李华伟/左二伟/舒易来合作团队利用CRISPR基因编辑纠正显性遗传性聋小鼠听力

2021

07/06

生物世界

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该实验直观地验证了AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2系统对基因Myo6 p.C442Y突变导致的半显性遗传性聋的治疗作用，为显性遗传性聋和其它疾病的治疗提供了参考和借鉴。

据世界卫生组织（WHO）官网报道，超过全球人口的5%，即4.66亿人患有残疾性听力损失，其中3400万是儿童。先天性耳聋的儿童，60%是遗传因素所致，目前尚无可以治疗的药物。随着基因编辑和基因治疗技术的迅速发展，有望精准治愈遗传性耳聋。

肌球蛋白VI是一种非常规肌球蛋白，在内耳的内外毛细胞均有表达，特别是纤毛的表皮板，因此认为该蛋白对于纤毛在表皮板的锚定发挥重要作用。MYO6基因的致病变异导致常染色体显性或隐性遗传性耳聋。有报道指出2.4%的常染色体显性遗传性感音神经性耳聋病例是由MYO6突变引起的。

肌球蛋白VI p.C442Y突变在人类儿童时期开始发生渐进性听力损失。虽然MYO6突变是遗传性耳聋常见的致病基因，但目前尚缺乏有效的治疗和预防药物。因此，亟需寻找一种有效针对基因Myo6导致的半显性遗传感音神经性聋的治疗方法。

近日，复旦大学附属眼耳鼻喉科医院李华伟和舒易来耳聋基因治疗团队联合中国农业科学院深圳农业基因组研究所左二伟研究员，在美国基因和细胞治疗学会（ASGT）的正刊 Molecular Therapy 上发表了题为：Gene editing in a Myo6 semi-dominant mouse model rescues auditory function 的研究论文。

该研究以模拟人源突变的显性遗传性耳聋小鼠模型为对象，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统（SaCas9-KKH系统），针对突变位点（Myo6，c.1325G>A ，p.C442Y）筛选出了特异且高效编辑的gRNA2，然后利用新发现的高效感染内耳毛细胞的腺相关病毒AAV-PHP.eB，将SaCas9-KKH-Myo6-g2基因编辑治疗体系递送至Myo6WT/C442Y耳聋小鼠模型的内耳， 实现了在体原位特异性地敲除了Myo6 p.C442Y突变等位基因，并在长达 5 个月的时间内，可观察到听觉功能的恢复。

这是国际上首个利用CRISPR/Cas9技术针对Myo6基因突变导致的遗传性耳聋进行治疗，并获得成功的研究，是基因编辑技术用于遗传性耳聋治疗的重要研究进展，为遗传性耳聋基因治疗临床转化提供了坚实的科学依据。

该研究首先针对突变的Myo6 p.C442Y 等位基因设计了sgRNA，然后取Myo6 p.C442Y突变小鼠的胚胎构建胚胎干细胞系（mESC），将SaCas9-KKH-sgRNA-GFP基因编辑系统导入，筛选并确认出高效、精准的sgRNA2用于后续体内治疗研究。

随后，使用微量注射仪将AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2基因治疗体系显微注射入活体内耳。体内结果表明AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2对Myo6WT/C442Y小鼠的Myo6C442Y等位基因精准编辑。同时，研究发现AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2对治疗耳的听力有明显地改善，其中治疗组10周龄小鼠的ABR阈值在测试的所有频率（4、8、16、24和32 kHz）均比未治疗耳显著下降；在长达5个月的时间内，皆可观察到听觉功能的恢复；同时，治疗组的ABR I波潜伏期变短、细胞存活率提高、纤毛形态变规则，内毛细胞的钙电流恢复到正常水平。

研究团队同时进行了AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2体系的安全性评估，未发现明显的脱靶情况，且对野生型小鼠的听力没有影响，验证了该治疗体系的安全性。

该工作由复旦大学附属眼耳鼻喉科医院李华伟教授、舒易来研究员和左二伟研究员共同指导完成（共同通讯作者），复旦大学附属眼耳鼻喉科医院薛媛媛博士后、王大奇博士后和中科院胡新德博士后、中国农业科学院李迪博士为论文的共同第一作者，研究过程中也得到复旦大学附属眼耳鼻喉科医院李耕林研究员和中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）杨辉研究员的合作指导。