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科研 | ISME：影响生命早期肠道短链脂肪酸特征的关键细菌类群和代谢途径

2021

07/06

微生态

A-

A+

婴儿肠道菌群的发育会影响整个生命过程中的宿主生理。

编译：微科盟R.A，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载。

导读

婴儿肠道菌群的发育会影响整个生命过程中的宿主生理，而短链脂肪酸（SCFA）是推定的关键代谢产物，介导了菌群与宿主之间的关系。本研究中，作者调查了生命前2年时段的（n = 1048）来自12位受试者的纵向、密集收集的粪便样本，以识别早期肠道SCFA模式及其与微生物群的关系。作者的研究结果揭示了SCFA曲线的三个不同的发展阶段：早期阶段的特征是低乙酸盐和高琥珀酸酯；中期阶段的特征是高乳酸和甲酸；晚期阶段的特征是高丙酸和丁酸。对SCFA-微生物群关系的评估表明，粪便丁酸与梭菌目（Clostridiales）的增多和母乳喂养的停止有关，并且具有乙酰辅酶A途径的梭菌物种的多样化和特性化组装在肠丁酸的生产中起主要作用。作者还发现甲酸盐和一些婴儿型双歧杆菌物种之间存在关联，并且人乳寡糖（HMO）衍生的岩藻糖是母乳喂养期间产生甲酸盐的基质。作者确定了在婴儿型双歧杆菌中的岩藻糖和岩藻糖基化HMO利用中上调的基因。值得注意的是，双歧杆菌在基因库中显示出种间和种内变异，并且岩藻糖的交叉喂养有助于肠道甲酸的产生。在这项研究中，我们调查了生命最初2年中来自12个健康足月婴儿的1048个样品的肠道微生物组及其代谢物特征。我们进一步评估了SCFA特征，肠道菌群组成和生命过程间的关联，并试图确定影响细菌SCFA特征的关键细菌群落，遗传因素（代谢途径）和环境因素。

论文ID

原名： Key bacterial taxa and metabolic pathways affecting gut short-chain fatty acid profiles in early life

译名：影响生命早期肠道短链脂肪酸特征的关键细菌类群和代谢途径

期刊：The ISME Journal

IF：10.302

发表时间：2021.3.15

通讯作者：Takahiro Matsuki

通讯作者单位：日本东京国立市养乐多中央研究所

实验设计

1）确定婴儿生命早期肠道菌群特征：12个足月婴儿生命最初2年中收集了1048份粪便样本，测16SrRNA基因的V1和V2区域的扩增子，QIIME2分析菌群组成。

2）短链脂肪酸特征分析：用HPLC检测各时间段的粪便SCFAs来确定早期SCFAs动态和特性。

3）菌群与SCFAs之间的关联分析：肠道SCFAs与微生物群之间的关联分析，发现乙酸与梭菌目之间有关联，为此确定了梭菌对丁酸产生的贡献。

4）双歧杆菌与SCFAs之间的关系：随年龄的变化来评估双歧杆菌的丰度与乳酸和甲酸浓度之间的关系。

结果与讨论

1 肠道菌群在早期生活中的发育

为了调查肠道菌群及其代谢产物在生命早期的动力学，我们在12个足月婴儿的生命最初2年收集了1048份粪便样本。在第1周的每一天，每隔一天直到第1个月，每星期直到1岁以及此后每隔一周，婴儿粪便样本均被收集（每个婴儿最多92个粪便样本）。所有婴儿均为日本人，经阴道分娩并以母乳为主要营养素（表S1）。

然后，我们对这些婴儿粪便样本以及从其父母那里获得的样本（总共1070个样本）的16S rRNA基因的V1和V2区的扩增子进行了测序。总共分析了2400万个扩增子序列（每个样品平均22,956±17,959个reads）。16S rRNA基因扩增子分析在不同的系统发生水平上进行表征，图4给出了4级的结果（分类层次中的目）（不同分类级别请参见图S1）。

图1 生命最初2年的婴儿肠道菌群群落概况。研究了来自12名婴儿的粪便样品的微生物群特征（n = 1048；每个受试者最多92个样品）。A三个婴儿的门水平动态（所有受试者参见图S2A）。沿x轴的竖线表示每2个月一次；x轴上的点表示每周到1个月。B目水平上12例婴儿的细菌丰度随时间变化。C 随时间推移的α-多样性的变化。D使用JSD结合PCoA和PAM聚类分析说明婴儿肠道菌群的特征。E箱图显示了每个群集主要贡献者的相对丰度。F微生物群的时间变化。淡蓝色，以肠杆菌为主；红色，双歧杆菌占优势；黄色，梭菌目（Clostridiales）占优势；灰色，未检测到。白色和黑色箭头分别表示固体食物的开始和母乳喂养的停止。要求受试者在双歧杆菌中稳定定植。

早期的微生物组在个体之间的组成和进程上都表现出相当大的差异（图1A中显示了三个婴儿的年龄依赖性肠道菌群组成。所有12个婴儿见图S2A）。但是，它们还表现出时间结构（图1B）。最初的菌群通常以肠杆菌为主，但它们的丰度随着年龄的增长而降低。双歧杆菌是生命早期微生物群中的主要细菌目，显示到6个月大时平均丰度增加，而8个月后普遍下降。梭菌目（Clostridiales）是直到8个月大的次要细菌群落，但此后它们的丰度增加了。

我们还证实，通过系统类型数量，Shannon指数和菲斯系统发育多样性（PD）评估，α-多样性随年龄增长而增加（图1C和S2B）。在测试期结束时，这些多样性指数的增长速度有所减缓，尽管这些婴儿在2岁时的值仍显著低于其父母的值（图S2C）。然后使用Jensen-Shannon散度（JSD），主坐标分析（PCoA）和中心体周围分区（PAM）聚类算法对这些样品中的微生物群特征进行评估（图1D）。我们使用Calinski–Harabasz（CH）指数估算簇的数量，发现婴儿菌群可分为三个簇。婴幼儿微生物群特有的簇，称为微生物群En，Bi和Cl，其特分别是：肠杆菌，双歧杆菌和梭菌目（Clostridiales）占优势（图1E）。

然后，我们根据年龄对每个样本的簇进行了可视化，发现了从肠杆菌到双歧杆菌再到梭菌目（Clostridiales）为主的菌群的发展（图1F）。过渡日个体间差异很大；从肠杆菌到双歧杆菌的过渡时间为3天至6个月（中位数为0.6个月），而从双歧杆菌到梭菌目（Clostridiales）的过渡范围为8至24个月（中位数为13个月）。与先前的研究一致，在许多婴儿受试者中，双歧杆菌占主导的微生物群向梭菌目（Clostridiales）的转变与母乳喂养停止同时发生（图1F，黑色箭头）。

2 早期 SCFA特征的动态和特性

为了了解早期肠道 SCFA特征的模式和个体间差异，我们使用高效液相色特征（HPLC）分析了这些粪便样品中SCFA的浓度。

与肠道菌群的发展相似的是：早期肠内SCFA的分布图是动态且特性化的（图2A和S3A以及数据文件S1），而模式则显示了时间轨迹（图2B）。在整个测试期间，乙酸是主要的SCFA。其浓度在6个月大时增加，此后稳定（图2B）。琥珀酸，乳酸和甲酸的浓度在生命的早期就升高了，但直到1岁才下降。其他主要的短链脂肪酸，丙酸和丁酸，分别在8个月和10个月大时增加。在整个测试期间（尤其是直到9个月大），很少检测到支链脂肪酸（即异丁酸和异戊酸）。我们还观察到头2年内粪便pH值增加。直到10个月大时pH值中值均低于6.0，此后则高于6.0（图2B）。

图2 头两年的婴儿肠道SCFA特征。A三个婴儿的粪便SCFA和pH动力学（所有受试者见图S3A）。B粪便SCFA浓度和pH随时间变化。C使用JSD结合PCoA和PAM聚类分析说明了婴儿肠道SCFA轮廓的特征。D箱图显示了每个群集中主要贡献者的粪便SCFA浓度。E SCFA集群的时间转移。蓝色，乙酸盐减少，琥珀酸盐升高（1型）；橙色，乳酸和甲酸盐升高（2型）；绿色，丙酸和丁酸升高（3型）；灰色，未经测试。白色和黑色箭头分别表示固体食物的开始和母乳喂养的停止。按照图1F的目对受试者进行排序。

随后我们尝试使用JSD和PCoA和PAM聚类来表征肠道代谢物特征，就像我们对微生物群的表征一样（图2C）。根据CH指数，我们发现SCFA模式可分为三种类型，其特征是乙酸盐和琥珀酸盐浓度低（SCFA：类型1），乳酸和甲酸浓度高（SCFA：类型2）或丙酸和丁酸含量高。浓度（SCFA：类型3）（图2D）。然后我们总结了SCFA类型的进展，并观察到从SCFA类型1到2再到类型3的目过渡，在过渡的那天有个别变化（图2E）。在停止母乳喂养之前，观察到了由丙酸盐浓度升高驱动的从2型到3型SCFA曲线的转变，而丁酸盐浓度的增加以及乳酸盐和甲酸盐的减少与终止母乳喂养相吻合（图S3B）。

3 肠道 SCFA特征与微生物群之间的关联

为了考虑肠道 SCFA与微生物群落结构之间的关系，我们随后评估了微生物群和SCFA类型之间的关联（图3）。我们发现，大多数具有肠杆菌优势菌群的样品均表现出具有减少的乙酸盐和琥珀酸酯的1型SCFA特征图（129的151，占85.4％），而大多数以梭菌为优势菌群的样品均具有3型SCFA特征图，其中丙酸和丁酸含量均增加（219,243，90.1％）（图3A）。值得注意的是，双歧杆菌占优势的微生物群（n = 654）表现出多种SCFA类型；186个样品显示出1型SCFA特征（28.4％），256个样品显示出具有乳酸和甲酸增加的2型SCFA特征（39.1％），而212个样品显示3型SCFA特征（32.4％）。图3B显示了肠道菌群组成和SCFA浓度的直接比较，强调在双歧杆菌为主的菌群中观察到了不同浓度的SCFA（包括乳酸和甲酸盐）。

图3 婴儿菌群组成与肠道SCFA特征之间的关系。A三个微生物群和三个SCFA模式之间的关系。显示了B菌群组成（从簇En，Bi到Cl排序）和SCFA分布图（从类型1到3排序）。C肠道SCFA特征和微生物群在订单级别之间的特性化关联（其他SCFA参见图S4）。提出了与前6个细菌群落的关联（平均丰度> 2％）。数字代表r值（Spearman的相关性）。带下划线的数字表示经FDR校正的p>0.01。

事实证明，密集的纵向数据集足以评估微生物群组成与环境因素之间的关联。因此，我们根据Johnson方法计算了每个婴儿中SCFA浓度与细菌分类学特征之间的Spearman相关系数，以确定在每个SCFA产生中起主要作用的细菌群落（图3C和S4）。尽管SCFA和微生物群之间的关联在个体之间存在差异，但梭菌和丁酸之间的平均相关系数最高（r=0.68±0.21），在11名婴儿中显著（q>0.01，P值经FDR调整）。在细菌级评估中，我们还发现梭菌和丙酸（r=0.63±0.23），双歧杆菌和甲酸盐（r=0.50±0.19），双歧杆菌和乳酸盐（r=0.52±0.22）之间呈正相关，以下对此进行了进一步的讨论。

4 梭菌对丁酸肠生产的贡献

因为在梭菌和丁酸之间观察到显著正相关，所以我们通过观察梭菌的丰度和丁酸浓度随年龄的变化来评估它们之间的关系。如图所示。在图4A和S5A中，我们发现肠丁酸盐浓度的增加与梭菌目（Clostridiales）丰度的升高同时发生。该结果与以前的报道一致，表明某些梭菌目（Clostridiales）的肠道微生物（例如，真细菌，Roseburia intestinalis和Faecalibacteriumprausnitzii）在丁酸肠生产中发挥作用。

图4 梭菌目（Clostridiales）成员有助于肠丁酸的产生。A关于年龄的梭菌目（Clostridiales）丰度和丁酸盐浓度图。提出了六个有代表性的主题（所有主题参见图S5A）。蓝色和橙色虚线垂直线分别表示固体食物的开始和母乳喂养的停止。B丁酸盐生产途径。C梭菌目（Clostridiales）类型及其有效丁酸盐产生的年龄依赖性热图。此处：显示了排名前40位的梭菌。左树表示基于16S rRNA序列的分类学关系。右图是丁酸生产基因的展示（请参见图S6B）。本文中提到的分型以粗体突出显示。

另一方面，最近有报道说：并不是所有梭菌的系统型都对丁酸肠产生有贡献，这促使我们研究梭菌的系统型和丁酸肠产生所涉及的基因。在这项研究中，在生命的头2年中，在12名婴儿中检测到了370种属于梭菌的系统型。热图显示了前80种丰富的系统型的分布和进程（图S6A）。我们观察到，尽管它们并非在所有受试者中都始终占主导地位，但经常检测到Blautia luti，Ruminococcusgnavus和Intestinibacter bartlettii。梭菌目（Clostridiales）属的基因组序列已积累在公共数据库中详细介绍了与产生丁酸的四个主要途径相关的基因（图4B）。因此，我们调查了本研究中检测到的类型是否具有产生丁酸盐的基因（有关详细信息，请参见“材料和方法”）。与以前的研究一致是，我们发现梭菌目（Clostridiales）系统型只有一部分（前80名中有45种）具有该途径（图S6B）。大部分产生丁酸的梭菌目（Clostridiales）（在包括F.prausnitzii，E.recttale和Eubacterium hallii在内的前80种系统型中，有21种）具有丁酰-CoA：乙酸酯CoA转移酶的乙酰-CoA途径的基因（图4C和图4C和图7C）。S6B），表明其他肠道微生物产生的微生物可及的碳水化合物和乙酸肠道乙酸是丁酸肠生产的底物。有些物种（包括丁酸梭菌在内的80种植物中有18种）具有丁酸激酶（buk），而不是丁酸激酶，它是催化从丁酰辅酶A转化为丁酸的最后一步的酶（图4C和S6B）; 结果表明，这些物种使用碳水化合物而不是乙酸盐来生产丁酸盐。一些物种具有4-氨基丁酸/琥珀酸酯途径（包括百里厌氧杆菌（Anaerostipes caccae）在内的12种系统型），表明琥珀酸酯（由其他肠道微生物产生）也可以用于丁酸的生产。图S5B示出了丁酸盐浓度和具有梭菌目（Clostridiales）产生途径的梭菌系统型总数相对于年龄的图，证实了在许多受试者中，产生丁酸盐的梭菌和丁酸盐浓度的增加是一致的。因此，我们的研究确定了具有乙酰辅酶A途径的梭菌目（Clostridiales）系统型的多样化和特性化组合在丁酸肠生产中起主要作用（图4C），并且并非所有梭菌系统型都有助于这种代谢。我们还通过结合16S rRNA扩增子和丁酸代谢的基因目录（补充文本），详细介绍了丁酸生产涉及的物种和基因，从而使人们对早期丁酸肠生产的底物进行了讨论。

5 只有一些婴儿型双歧杆菌与肠道SCFA相关

随后，我们通过绘制关于年龄的值来评估双歧杆菌的丰度与乳酸和甲酸浓度之间的关系。但是，与梭菌-丁酸的关系不同，这两种双链脂肪酸的双歧杆菌丰度和浓度的增加并不吻合。在大多数受试者中，观察到双歧杆菌增加之前乳酸和甲酸增加（图5A和S7A）。

图5 婴儿双歧杆菌有助于肠道乳酸和甲酸的产生。A交流双歧杆菌的丰度以及乳酸和甲酸的浓度随年龄的增长而变化。B介绍了六个婴儿，其乳酸和甲酸盐的产生是由婴儿双歧杆菌或双歧双歧杆菌驱动的（所有受试者见图S7）。D岩藻糖和FL与乳糖相比在利用过程中的转录数据的Volcano图。E上调基因及其位点标签（缩写为INF29），KEGG正交学（KO），每百万注释和转录本（TPM）的列表。F预测从岩藻糖半乳糖和岩藻糖到甲酸盐的代谢途径。G岩藻糖利用基因的组织及其表型（其他菌株见图S10A，B）。箭头下方的数字表示轨迹标记的最后一位。

因此，我们在物种水平上评估了双歧杆菌-SCFA的关联（图S8）。每个受试者中Spearman的相关系数表明长双歧杆菌亚种。婴儿（此后称为婴儿双歧杆菌），双歧双歧杆菌和短双歧杆菌与肠道乳酸和甲酸盐浓度呈正相关，并且与这些SCFA相关的双歧杆菌种类在个体之间有所不同（图S8）。我们还通过绘制这些物种的丰度和SCFA浓度相对于年龄的关系来评估它们之间的关系（图5B，C和S7B）。我们发现婴儿双歧杆菌的丰度增加与正相关婴儿的乳酸和甲酸盐浓度升高相吻合（例如，受试者L，F和C;图5B），而双歧双歧杆菌的丰度和肠道SCFA浓度呈正相关。其他婴儿（例如，受试者E，H和K；图5C）。这些数据共同表明，某些双歧杆菌物种有助于婴儿肠道中乳酸和甲酸的产生，并且在生态系统中具有相同的功能，这被称为功能冗余。

6 婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌同化HMO衍生的岩藻糖并产生甲酸盐

B. infantis, B. bifidum和B. breve通常在婴儿肠道中发现，前两个物种拥有利用HMO的基因库。HMO在生命早期被称为主要的微生物可及的碳水化合物，其主要成分为葡萄糖和半乳糖，而岩藻糖，N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰神经氨酸残基为次要成分。双歧杆菌通过Leloir途径将半乳糖代谢为葡萄糖，而葡萄糖则通过双歧杆菌特异性的“双歧管”途径以3：2的比例代谢为乙酸盐和乳酸盐（图S9A）。因此，肠道乳酸浓度增加，再加上婴儿双歧杆菌和双歧双歧杆菌，归因于它们利用HMO的能力。该推定与以下事实一致：在这些婴儿中，乳酸的增加与双歧杆菌种类的丰度与乙酸盐浓度的增加相吻合（图S7B，箭头所示）。然而，尚未充分探索在婴儿肠道中产生甲酸盐及其底物的双歧杆菌代谢途径。因此，我们研究了使用婴儿双歧杆菌IN-F29的HMO衍生单糖（岩藻糖，N-乙酰氨基葡萄糖和唾液酸）的利用和代谢后果，并发现该菌株通过岩藻糖发酵产生了甲酸。随后，我们对婴儿双歧杆菌菌株在存在岩藻糖，2'-岩藻糖基乳糖（FL）或乳糖的生长过程中进行了RNA-seq转录分析，以研究HMO衍生的岩藻糖代谢成甲酸盐的分子基础。我们发现，在利用岩藻糖和FL的过程中有8个基因被显著上调，其中许多基因与岩藻糖的代谢和FL的运输有关（图5D，E）。我们还观察到甲酸的最终步骤（甲酸C-乙酰基转移酶[K00656]，INF29_01241）和1，2-丙二醇（1，2-PD）产生（乳酸醛还原酶[K00048]，INF29_00346）的基因上调。基于转录组数据分析，基因注释和先前的研究，我们假设双歧杆菌利用HMO衍生的岩藻糖并通过图5F所示的途径产生甲酸盐。与岩藻糖丙酮酸和乳醛代谢相关的上调基因位于一个基因座（基因座标记INF29_02150-02155），表示为利用基因座1的岩藻糖（图5G）。此外，我们发现另一组基因具有相同的功能注释，并且位于另一个基因座（图5G; INF29_02182-02187，表示为FUL-2）。转录RNA-seq数据证实位于FUL-2的基因在岩藻糖，FL和乳糖利用过程中组成性表达（图S9B），表明这些基因也参与了HMO衍生的岩藻糖利用。我们进一步研究了39个代表性双歧杆菌菌株中这些基因的存在（用于HMO衍生的岩藻糖利用），并发现所有婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌都具有从岩藻糖到甲酸盐代谢途径的基因（图S10A，B）。在某些短双歧杆菌菌株（例如，JCM1192T，BR-07，BR-19，BR-C29，BR-H29和BR-L29）中未发现FL的ABC转运蛋白（K02025–02027）。观察到这些菌株不能利用FL。相比之下，我们观察到某些假性链球菌菌株具有FUL-2以及所有将岩藻糖转化为甲酸和1，2-PD的基因。这些菌株在位点包含FL的ABC转运蛋白基因，但不存在岩藻糖通透酶基因，这与其能够利用FL而不是岩藻糖的表型是一致的。因此，在婴儿型双歧杆菌中观察到的FL和岩藻糖利用的变化可以通过FL和岩藻糖转运蛋白的基因及其相关途径的存在来解释，如图5G和S10C–G所示。

7 双歧双歧杆菌通过交叉喂入岩藻糖促进肠甲酸盐的产生

有趣的是，但与先前的研究一致，双歧双歧杆菌缺乏吸收岩藻糖的代谢途径（图S10A），尽管其丰度与几个婴儿的肠甲酸盐浓度呈正相关（图5C，S7和S8B）。先前的体外研究报道双歧双歧杆菌具有胞外岩藻糖苷酶以利用岩藻糖基化的HMO，从而将岩藻糖释放到短双歧杆菌用于进一步代谢的培养上清液中。然而，尚未研究这两种双歧杆菌物种的共培养的代谢后果。在本研究中，在甲酸盐-B的大多数样品中均检测到短双歧杆菌。观察到两歧关系（图S7）。因此，我们假设甲双歧杆菌和短双歧杆菌短双歧杆菌定殖到底物交叉喂入的情况下，双歧双歧杆菌的甲酸盐含量增加（图6A）。

为了在体外测试该假设，我们在包含岩藻糖，2'-FL和乳糖的培养基中培养了婴儿双歧杆菌，双歧双歧杆菌和短双歧杆菌（不含FL的ABC转运蛋白）的代表性菌株（请参阅补充说明）。细节）。我们证实，婴儿双歧杆菌使用岩藻糖和2'-FL均可产生甲酸盐。B. breve用岩藻糖产生甲酸盐，但不用2'-FL产生甲酸盐。双歧杆菌与岩藻糖或2'-FL生成的甲酸盐较少（图6B和表S2）。相反，短双歧杆菌和双歧双歧杆菌的共培养利用2'-FL并产生甲酸盐，证实了我们的假设，即这两个物种的组合可以利用岩藻糖基化的HMO通过交叉进料产生甲酸盐。

图6 双歧杆菌群落对岩藻糖基化的HMO的利用和甲酸的产生。A假设的的双歧双歧杆菌和短双歧杆菌短杆菌代谢产生SCFA的交叉饲喂模型。B婴儿双歧杆菌，短双歧杆菌，双歧双歧杆菌和这些物种的组合产生甲酸。C岩藻糖基化HMO利用的关键标记基因与乳酸和甲酸浓度之间的关系（所有受试者见图S11）。D根据进食，双歧杆菌定殖和岩藻糖基化HMO利用的关键基因的存在将样品分为五个亚组。E各亚组之间粪便中SCFA浓度的差异。括号中的数字表示分配给该子组的样本数。

8 体内岩藻糖基化HMO的利用和甲酸盐的产生

为了评估我们的婴儿数据中双歧杆菌和ABC转运蛋白FL的双歧杆菌和岩藻糖交叉喂养对甲酸生成的贡献，我们进一步研究了这些关键遗传因素的存在及其与肠道SCFA浓度的关系。我们开发了FL底物结合蛋白（表示为FL-SBP），岩藻糖转运蛋白（FucP）和细胞外岩藻糖苷酶的特异性引物，并使用实时PCR研究了从12例婴儿中获得的1048个样品中它们的存在（图6C和S11）。如所预期的，FUL中始终存在的FL-SBP基因的增加对应于许多受试者（例如，婴儿B，C，K和L）的肠甲酸盐和乳酸盐浓度的增加。尽管在几个婴儿中未观察到这种相关性，但肠内甲酸和乳酸浓度的增加可以通过胞外岩藻糖苷酶和FucP的共同存在来解释，这两者都是岩藻糖交叉喂养的关键遗传因素（例如，婴儿H和E）。根据进食，双歧杆菌的定殖和岩藻糖基化HMO利用的关键基因的存在，我们将这1048个样品进一步分为五个亚组（见图6D）。我们确认，具有完整的岩藻糖基化HMO利用途径的样品显示出比其他亚组样品更高的甲酸盐和乳酸盐浓度（图6E），这支持了我们的观点，即FL的ABC转运蛋白和双歧杆菌的交叉转运饲喂岩藻糖有助于婴儿肠道中甲酸的产生。

肠道菌群来源的SCFA已显示对宿主发挥广泛的生理作用，而肠道微生物具有产生和代谢这些SCFA的不同能力。因此，具有不同组成的微生物群会导致不同的肠道SCFA特征，这可能会产生不同的宿主反应。但是，与肠道菌群的详细关系很难被描述。在这项研究中，我们使用密集的纵向采样在最初的2年中表征了肠道SCFA与肠道菌群组成的关系。我们发现肠道SCFA特征显示出进展的三个阶段。我们进一步调查了影响细菌早期SCFA特征的关键细菌群落，遗传因素和生活事件。因此，本研究中提供的数据增进了我们对早期肠道SCFA特征及其与肠道菌群的关系的了解。

结论

S3时增加了AOB-amoA功能基因的绝对丰度，并增加了nirK功能基因群落中浮霉菌、甲基杆菌属、亚硝酸菌属、出芽菌属、地嗜皮菌属和中华根瘤菌的相对丰度。此外，含有Epichloë内生真菌的凋落物降低了nirK功能基因在S1、S3时的绝对丰度和S3时的多样性；降低了nosZ功能基因在S1～S3时的绝对丰度和S1时的多样性；降低了AOB-amoA功能基因中变形菌门的相对丰度。土壤水分以及土壤TP、OC、AN和MBN是影响凋落物返田土壤中硝化和反硝化基因丰度和多样性的主要因素。需要进一步的研究来探索内生真菌介导的AOA-amoA，AOB-amoA，nirS，nirK和nosZ功能基因的丰度和多样性变化的机制。

1 利用HMO双歧杆菌生产乳酸和甲酸盐

在这项研究中，我们证明了乳酸和甲酸是SCFA特征图第二阶段的主要代谢产物。尽管受试者之间乳酸和甲酸盐稳态增加的持续时间有所不同（1-10个月，图2E），但在本研究的所有受试者中均观察到乳酸和甲酸盐升高阶段。以前在成人中进行的研究报告说，这两种SCFA不会在肠道中积聚，因为它们是中间体，会转化为其他代谢物。一些婴儿研究确实探索了粪便中SCFA的浓度。然而，他们只关注乙酸，丙酸和丁酸肠，而大多数研究中并未关注乳酸和甲酸的肠浓度。因此，据我们所知，这是第一份强调健康婴儿在一定时间内肠道中会积累甲酸盐和乳酸盐的报告。

此外，我们证明了利用岩藻糖基化的HMO双歧杆菌在肠道SCFA生产中起关键作用。我们专注于甲酸盐的产生，发现源自HMO的岩藻糖是在婴儿肠道中产生SCFA的主要底物，并且我们提出了从岩藻糖到甲酸盐的详细双歧杆菌代谢途径。提议的途径与最近的报道一致，该报道报道了某些双歧杆菌菌株（例如，Bifidobacteriumkashiwanohense APCKJ1菌株）将岩藻糖代谢为1，2-PD。我们的研究证实了他们的发现，并进一步表明，基因INF29_01241（被标记为甲酸C-乙酰基转移酶）参与了最终步骤，以产生甲酸并补充婴儿肠道共生双歧杆菌中岩藻糖代谢的整体情况。

关于岩藻糖和乳糖的代谢，值得注意的是，利用双歧杆菌的岩藻糖具有将丙酮酸不仅转化为甲酸盐而且还转化为乳酸的酶。我们观察到婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌通过岩藻糖彻底发酵产生了甲酸盐，乙酸盐和1，2-PD，并且它们通过乳糖代谢产生了乙酸盐和乳酸盐（表S2）。我们还证实了与丙酮酸-甲酸转化相关的基因（K00048，K00656和K13788）在岩藻糖利用中上调，丙酮酸-乳酸转化的基因（K00016）在乳糖利用中也上调，并且两者相关的基因（K00925）在婴儿双歧杆菌中组成性表达（图S9C）。这种调节可以通过岩藻糖和乳糖代谢途径中的NADH/NAD⁺平衡来解释。NAD⁺用于将岩藻糖转化为岩藻糖酸内酯，并在乳醛转化为1，2-PD的过程中再生（图S9A），丙酮酸可被甲酸C-乙酰基转移酶进一步代谢为乙酸盐，并伴随CoA的羧化反应。但是，在利用岩藻糖的过程中，丙酮酸不能进一步有效地代谢为乳酸，因为NADH / NAD⁺的平衡没有此反应。

微生物群来源的甲酸和乳酸的生理作用尚未得到积极研究，这可能是由于成年人在正常生理条件下肠腔中的浓度较低。本研究表明母乳喂养的婴儿中乳酸和甲酸的产生和积累，从而强调了研究这些次要SCFA的功能作用的重要性。

2 通过多种特性化梭菌目（Clostridiales）产生丁酸

除了先前发现的与停止母乳喂养同时发生的几类厚壁菌门（Firmicutes）（包括梭菌）的增加相关的发现外，我们目前的研究还强调了一种先进的观念，即停止食用会引起肠道丁酸生产的增加（图2E，S3和S5）。我们还证实，固体食物的引入对SCFA概况以及肠道菌群组成几乎没有影响。

这些观察结果表明存在控制人乳中丁酸肠产量的特定因素。长期以来，人们一直认为母乳中含有大量的乳铁蛋白。乳铁蛋白限制了环境中游离Fe的可用性，这对于细菌执行酶促反应和调节基因表达是必不可少的。先前的研究表明，双歧杆菌物种非常适合于低铁条件，而铁缺乏或螯合会导致体外结肠发酵和动物模型中丁酸生成的减少。在这项研究中，我们发现乙酰CoA途径是早期产生丁酸盐的梭菌的主要途径。该途径的主要能量产生步骤是巴豆酰辅酶A向丁酰辅酶A的转化（图4B），它通过丁酰辅酶A脱氢酶电子转移黄素复合物通过铁氧还蛋白还原而产生质子原动力。这些先前的发现和我们的观察使我们认为停止母乳喂养可能导致乳铁蛋白减少和游离铁增加，从而导致肠丁酸产量增加：这一假说应在未来的研究中得到进一步验证。

3 肠道SCFA，微生物群和环境因素之间的其他关联

我们观察到梭菌的丰度与丙酸盐浓度之间呈正相关（图S4）。但是，在梭菌目（Clostridiales）丰度升高之前就观察到了丙酸的增加（图S3），因此在这项研究中我们无法提出令人信服的因果关系。

与我们的观察一致，即大多数以肠杆菌为主导的菌群均表现出1型SCFA分布，其中琥珀酸盐含量增加（图3a）。Bittinger等科学家最近报道，基于新生粪便中代谢产物的观察和营养通量平衡模型分析，大肠杆菌是肠杆菌的代表物种，通过氨基酸代谢促进琥珀酸的产生。该研究的其他数据（图S12）也支持了他们的发现，因为在一些婴儿受试者中肠杆菌的丰度升高和琥珀酸盐浓度相对于年龄的升高是相关的（例如，受试者F，G和I，补充文本）。这样，我们当前的SCFA-微生物群数据集可用于支持或评估肠道SCFA-微生物群的详细关系，并可能为将来的研究提供宝贵的资源。

在生命早期接触抗生素会增加患过敏和哮喘的风险，体重超重和肥胖。我们的研究提供了有关抗生素治疗如何影响肠道SCFA概况和微生物群的病例对照数据。

在这项研究中，在最初的2年中，有12名受试者中有8名接受了抗生素治疗，其中许多人的SCFA分布，微生物群组成和/或α-多样性均发生了变化（图S2A，B和S3A，用箭头指示）。此外，我们观察到这些变化在治疗完成后恢复为治疗前的状态，尽管效果的幅度及其恢复因人而异。在这项研究中，我们观察到肠道pH与乳酸盐浓度之间呈负相关（r=-0.58±0.19，图S13）。该观察结果和我们的体外数据表明，利用HMO的双歧杆菌可产生SCFA，从而有助于降低肠道pH。相反，已经证明环境pH会影响微生物群的组成。一些研究提出，低pH值可能是抑制肠道生态系统中潜在病原体过度生长的关键因素。双歧杆菌耐受酸性环境的能力也得到了积极的研究。因此，我们的数据和先前的发现暗示了肠道pH与以双歧杆菌为主导的菌群之间的正反馈回路。

4 婴儿健康和微生物来源的SCFA

目前我们正在积极研究婴儿肠道菌群的发育与生命后期的寄主健康和疾病风险的关系。在这项研究中，我们确定了三个不同的SCFA模式，这些模式显示了连续过渡，表现出相当大的个体差异。然而，至少部分由于受试者人数少，无法充分评估SCFA特征的进展，环境因素（除母乳喂养停止）与随后的婴儿健康之间的关联。因此，将未来的婴儿出生人群扩展到同时针对微生物群和SCFA分布图并进行频繁采样以更好地了解肠道微生物群– SCFA –环境–宿主健康之间的关系将是有趣的。

这项研究中详细介绍了肠道SCFA的产生方式及其与微生物群的关系，这是制定可早期影响肠道SCFA的策略的重要步骤，该策略可能会影响宿主终身健康。