Blood重磅研究:PD-L1调控中性粒细胞凋亡在脓毒症肺损伤中的作用

2021
06/29

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古麻今醉
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    脓毒症是指感染引起宿主免疫失调,进而引起致命性功能障碍。至今为止,脓毒症仍是加强医疗病房(ICU)患者最常见死亡原因,病死率高,治疗费用高。遗憾的是,脓毒症的发病机制仍未完全阐明,至今仍无针对病因的临床治疗,仍需大量的基础研究来筛选更多的脓毒症干预靶点。
 
PD-L1是目前研究最为广泛的免疫检查点,在肿瘤治疗领域展现出了巨大的前景,2018年诺贝尔奖被授予“抑制负性免疫调节因素在肿瘤治疗中的应用”。
 
   近10年来,PD-L1/PD-1在脓毒症中的作用也得到了较为广泛的研究,脓毒症小鼠和患者的多种免疫细胞均有PD-L1和/或PD-1的表达上调。体外给予抗PD-L1抗体可逆转脓毒症患者免疫细胞功能障碍,动物模型中给予抗PD-L1抗体可改善脓毒症小鼠生存率。因此,PD-L1可能也是脓毒症治疗的重要干预靶点。
    然而,PD-L1与脓毒症的故事似乎远未结束。近期,来自海军军医大学第一附属医院的王嘉锋副教授和邓小明教授团队针对PD-L1在脓毒症中的作用展开了一项新的研究,研究结果于2021年5月在线发表于Blood杂志,本文对该研究内容做一简单介绍。

方法

   研究对象:包括脓毒症患者的外周血样本和中性粒细胞PD-L1条件性敲除(CKO)的小鼠。
   离体研究:分离脓毒症患者外周血中性粒细胞,并以RNA干扰技术敲减PD-L1的表达,观察对中性粒细胞凋亡和PI3K/Akt通路的影响。
  在体研究:利用Ela-cre和PD-L1-flox小鼠构建中性粒细胞PD-L1 CKO模型,实施盲肠结扎穿孔(CLP)脓毒症手术,观察术后生存率、肺损伤的变化。

结果

   体外以干扰素γ(IFN-γ)和脂多糖(LPS)刺激的中性粒细胞或脓毒症患者中性粒细胞PD-L1表达均显著上调(图1A),而中性粒细胞的凋亡率与PD-L1的表达水平呈负相关趋势(图1B)。以RNAi技术敲减PD-L1表达后降低的中性粒细胞凋亡率被逆转(图1C、1D)。
 
    图1. PD-L1表达与中性粒细胞凋亡的关系。A. IFN-γ与LPS刺激后中性粒细胞PD-L1表达增加,培养21h后凋亡率显著低于未刺激或单一因子刺激。B. 脓毒症患者PD-L1表达显著高于对照者,而体外培养21h后凋亡率显著低于健康对照者。PD-L1表达水平与凋亡率呈负相关。C. RNAi敲减中性粒细胞PD-L1后IFN-γ+LPS诱导的凋亡降低被逆转。D. RNAi敲减中性粒细胞PD-L1后脓毒症患者中性粒细胞凋亡降低被逆转。
    IFN-γ+LPS刺激的健康志愿者中性粒细胞和脓毒症患者中性粒细胞Akt磷酸化增强(图2A),IFN-γ+LPS刺激PD-L1 CKO小鼠骨髓中性粒细胞时无法诱导Akt磷酸化增强(图2B),而RNAi敲减中性粒细胞PD-L1后增强的脓毒症患者中性粒细胞Akt磷酸化被抑制(图2C)。免疫共沉淀显示,PD-L1与Akt上游PI3K p85亚基存在相互作用(图2D)。
 
    图2. PD-L1表达与PI3K/Akt通路活性的关系。A. IFN-γ+LPS刺激的健康志愿者中性粒细胞和脓毒症患者中性粒细胞Akt磷酸化增强。B. IFN-γ+LPS刺激PD-L1 CKO小鼠骨髓中性粒细胞Akt磷酸化未见明显增强。C. RNAi敲减PD-L1后脓毒症患者Akt磷酸化程度显著降低。D. 免疫共沉淀显示PD-L1和PI3K p85亚基存在相互作用。
    与野生型CLP小鼠相比,PD-L1 CKO CLP小鼠血浆促炎细胞因子(TNF-α和IL-6,图3A、B)降低,抗炎细胞因子(IL-10,图3C)升高,PD-L1 CKO CLP小鼠肺损伤程度减轻(图3D),肺部中性粒细胞数量减少(图3E),7d生存率显著升高(图3F)。
 
    图3. 中性粒细胞PD-L1特异性敲除后脓毒症肺损伤和生存率改善。A-C. 细胞因子水平的变化。D. 肺部HE染色及肺损伤病理评分。E. 肺部MPO荧光染色及MPO阳性细胞比例的变化。F. 7d生存率的比较。

结论

 
   脓毒症时中性粒细胞PD-L1表达升高,PD-L1可通过PI3K/Akt通路抑制中性粒细胞凋亡,进而导致脓毒症时肺部中性粒细胞聚集增多,肺损伤加重,从而恶化脓毒症预后。  

麻海新知的评述:

   本研究报道了PD-L1对中性粒细胞凋亡调控和脓毒症肺损伤的影响,发现PD-L1参与了脓毒症诱导的中性粒细胞凋亡延迟,进而导致脓毒症时肺部中性粒细胞聚集增多,肺损伤加重和预后变差。

   脓毒症时各种免疫细胞的功能均发生不同程度的功能障碍,对于中性粒细胞而言,发生的变化包括凋亡延迟,迁移和吞噬功能障碍。这种功能紊乱可能导致脓毒症时中性粒细胞向感染部位趋化的能力减弱,向非特异性靶器官迁移增多,进而导致病原体清除能力减弱,而介导非特异性靶器官损伤的作用增强。因此,靶向中性粒细胞凋亡延迟有望成为脓毒症脏器损伤干预的靶点。

   传统上PD-L1为抗原递呈过程的抑制性第二信号。一般而言,抗原递呈细胞通过MHC分子将抗原递呈给T淋巴细胞受体(TCR)。同时,需要有共刺激分子作为第二信号增强效应细胞对抗原递呈过程的反应,如CD80/CD86和CD28的结合。同时,为了避免免疫反应过强,机体还存在负反馈调节机制,及抑制性共刺激分子PD-L1/PD-1、LAG3等途径。所以,PD-L1作为PD-1的配体,可向效应细胞表面PD-1传递抑制性信号。中性粒细胞并非传统意义上的抗原递呈细胞,然而,作者在2015年报道于Anesthesiology杂志的研究发现,脓毒症时中性粒细胞也可高表达PD-L1,且中性粒细胞PD-L1也可参与脓毒症淋巴细胞凋亡的调控,中性粒细胞PD-L1表达水平与脓毒症患者病情和预后相关,提示脓毒症时中性粒细胞功能紊乱的内涵不仅仅在于其自身迁移、吞噬和凋亡过程的紊乱,还可与获得性免疫系统发生相互作用。

   本研究的意义在于,进一步揭示了PD-L1并非传统意义上的PD-1配体,而是可反向作用于中性粒细胞,并发挥着传递抗凋亡信号的新作用。免疫共沉淀实验显示,PD-L1的作用靶点位于PI3K的p85亚基。PI3K/Akt是一条经典的促细胞存活通路,脓毒症时Akt的活性明显增强。P85作为PI3K的调节性亚基,激活后可于PI3K的功能性亚基p110相结合,进一步促进其下游分子Akt的磷酸化,从而启动抗凋亡过程。而本研究显示PD-L1可与p85结合,促进Akt磷酸化,这一发现丰富了对PD-L1功能的认识。

 

   PD-L1有望成为对抗脓毒症免疫抑制的作用靶点,国内外也已经启动了PD-L1抑制剂用于脓毒症治疗的一期临床试验。然而对于这一新型治疗药物的顾虑在于,利用PD-L1抑制脓毒症免疫抑制后,是否会带来过度的免疫反应而加重脓毒症脏器损伤,如免疫检查点相关性肺炎。本研究的结果显示PD-L1抑制剂在逆转脓毒症免疫抑制的同时,还可能可以缓解中性粒细胞介导的脏器损伤,为PD-L1抑制剂用于脓毒症治疗进一步提供了理论依据。当然,中性粒细胞介导的脏器损伤缓解并不意味着PD-L1抑制剂可缓解其他免疫细胞功能增强所介导的脏器损伤。

Blood期刊的述评(待刊状态,稿件号:BLD-2021-012186-C)

  中性粒细胞是外周血白细胞中含量最多的一类细胞,约占60%~70%。中性粒细胞是一类高度分化的细胞,生命周期较短,但是在天然免疫和宿主对抗微生物的反应中至关重要。在感染过程中,中性粒细胞作为一线抗感染细胞会大量募集于感染部位,并通过多种不同的受体识别并吞噬微生物。中性粒细胞杀菌机制包括向吞噬体释放氧自由基等毒性物质或含过氧化物酶、蛋白酶、抗菌肽等物质的颗粒。微生物也可被中性粒细胞外捕获网捕获。中性粒细胞死亡的方式包括凋亡、NETosis、焦亡和坏死性凋亡等,然后进一步被巨噬细胞吞噬清除,也称为胞葬作用,从而清除感染灶。因此,中性粒细胞是天然免疫系统中至关重要的抗炎组分,它们的生理作用为清除感染和炎症反应灶。尽管如此,脓毒症等炎症紊乱的病理情况下中性粒细胞会出现过度激活或凋亡延迟,进而导致周围组织受损或炎症反应持续活化。由于炎症组织中存在多种促生存的因子,所以组织中的中性粒细胞可能比外周血中性粒细胞存活时间更长。凋亡被抑制时中性粒细胞生存期延长,通常与疾病的严重程度相关。从外周血分离出来的中性粒细胞可发生自发性凋亡,在不同刺激下凋亡可被加速或延迟。炎症状态下中性粒细胞凋亡被抑制,然而这些抑制中性粒细胞凋亡的因素尚未被完全阐明。本文作者揭示了PD-L1在炎症部位可通过PI3K/Akt通路抑制中性粒细胞凋亡。

   PD-1是表达于免疫细胞的免疫检查点受体,可激活免疫抑制信号,其与PD-L1或PD-L2结合并阻断传往T细胞受体的激活信号。PD-1/PD-L1可抑制获得性免疫系统及肿瘤免疫中的T细胞功能。PD-L1表达于T细胞、B细胞和抗原递呈细胞的浆细胞膜。肿瘤细胞也可表达PD-L1,与T细胞表面PD-1结合后可产生免疫逃逸现象。因此,抗PD-1或PD-L1抗体被广泛用于肿瘤治疗。既往研究显示不同炎症状态下中性粒细胞可表达PD-L1,在本研究中作者发现脓毒症患者PD-L1过表达与其生存期相关,沉默PD-L1表达后可加速中性粒细胞凋亡。有趣的是,以IFN-γ+LPS刺激的中性粒细胞或脓毒症患者中性粒细胞中Akt磷酸化增强,而这一现象可被PD-L1 siRNA逆转。作者还通过免疫共沉淀反应发现PD-L1可与PI3K p85亚基发生相互作用。在体实验中,中性粒细胞PD-L1条件性敲除可降低盲肠结扎穿孔小鼠肺部中性粒细胞聚集并缓解脓毒症肺损伤。因此,炎症状态下中性粒细胞PD-L1表达上调可通过PI3K/Akt通路延迟细胞凋亡过程,进而诱导肺损伤并促进死亡的发生。

   这一研究为中性粒细胞的研究领域带来了全新的信息。首条重要的信息在于PD-L1不仅是介导肿瘤免疫逃逸的重要分子,在炎症发生中也有重要作用,这为开发新的药物靶点提出了新的可能。另一条重要的信息在于脓毒症时PD-L1上调可促进中性粒细胞存活。最后,本研究新提出了PD-L1激活PI3K/Akt通路进而调解中性粒细胞炎症功能的重要作用。因此,本研究为我们对中性粒细胞生理学功能的理解增添了重要的一环。

   新机制的提出往往都存在一些问题。在肿瘤细胞中,PD-L1表达于浆细胞膜,但是其在中性粒细胞的表达部位本文并未作深入研究,探索其表达于中性粒细胞细胞膜还是在细胞内颗粒上值得进一步探索,表达于细胞膜的PD-L1使其很容易作为封闭抗体的免疫治疗作用位点。在本文的投稿阶段,Thanabalasuriar等报道了气道炎症小鼠中PD-L1+中性粒细胞的作用,并发现抗PD-L1抗体对炎症具有保护作用。Patera等也发现炎症状态的中性粒细胞可表达PD-L1,细胞内PD-L1和PD-1的结合可以诱导中性粒细胞PI3K/Akt通路的激活。这些问题均可利用中和抗体进一步验证。本文发现IFN-γ和LPS可诱导中性粒细胞表达PD-L1,但是是否存在其他诱导中性粒细胞表达PD-L1的机制也值得进一步研究。

   本研究提示PI3K/Akt通路在PD-L1促进中性粒细胞存活上具有重要作用,但是仅利用HEK293工具细胞证实了PD-L1可与p85结合,PD-L1如何激活PI3K的机制没有作进一步探索。这一发现还需要在中性粒细胞中进一步验证。此外,PI3K/Akt通路对中性粒细胞的其他重要功能也有调控作用,如氧自由基的释放、脱颗粒和趋化,PD-L1+中性粒细胞这些功能是否存在异常也值得研究。同时,在其它炎症性疾病如类风湿性关节炎和炎症性肠病中PD-L1是否有同样的作用也值得研究。

   综上所述,本研究在中性粒细胞生理学功能研究领域取得重要进展。值得关注的是,本研究揭示了炎症状态下PD-L1-PI3K-Akt在中性粒细胞凋亡延迟中的重要作用。这为某些免疫或炎症性疾病的新型治疗手段开放了新的道路,并为将来进一步探索PD-L1作用的研究提出了非常有趣的新问题。

(王嘉锋 编译 邓小明 评述)


原始文献:Wang JF, Wang YP, Xie J, Zhao ZZ, Gupta S, Guo Y, Jia SH, Parodo J, Marshall JC, Deng X. Upregulated PD-L1 delays human neutrophil apoptosis and promotes lung injury in an experimental animal model of sepsis. Blood. 2021 May 19:blood.2020009417. doi: 10.1182/blood.2020009417. Epub ahead of print. PMID: 34010409.


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关键词:
中性粒细胞,肺损伤,脓毒症,凋亡,调控,研究,炎症,免疫

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