维生素D对睡眠剥夺小鼠认知功能的影响及其作用机制研究

【论著】

本研究通过建立小鼠睡眠剥夺（SD）模型，探讨维生素D（VD）对SD小鼠认知功能的影响及其作用机制。 

将40只C57BL/6小鼠按照随机数字表法分为4组（每组10只）：正常对照组（Ctrl组）、SD组、SD+VD组（VD组）、SD+VD+3MA组（3MA组）。Ctrl组不做任何处理，SD组、VD组、3MA组小鼠采用多平台水环境法进行72 h的SD；VD组、3MA组腹腔注射1,25‑二羟维生素D3［25（OH）2D3］1.5 μg/kg，连续7 d；3MA组腹腔注射自噬抑制剂3MA 2 mg/kg，连续7 d；Ctrl组与SD组腹腔注射等量的生理盐水。造模结束后用Morris水迷宫检测小鼠学习、记忆能力，行为学测试完毕后随即处死取材，采用ELISA试剂盒检测小鼠血清中25羟基维生素D3（25HVD3）的含量以及海马组织中β‑淀粉样蛋白（Aβ）、TNF‑α、IL‑1β及IL‑6的含量，Western blot法检测小鼠海马组织中自噬关键分子酵母Atg6同系物（Beclin 1）和微管相关蛋白1轻链3B亚基（LC3B）的蛋白水平；免疫荧光染色法标记LC3B。

2.1　Morris水迷宫测试结果

4组小鼠空间探索轨迹见图1。4组小鼠SD前的平均逃避潜伏期差异无统计学意义（P>0.05）。SD后，与Ctrl组比较，SD组、VD组与3MA组逃避潜伏期明显延长，穿越平台次数及目标象限停留时间减少（P<0.05）；与SD组比较，VD组逃避潜伏期明显缩短，穿越平台次数及目标象限停留时间增加（P<0.05）；与VD组比较，3MA组逃避潜伏期均明显延长，穿越平台次数及目标象限停留时间减少（P<0.05）。而SD组与3MA组逃避潜伏期、穿越平台次数和目标象限停留时间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图2。

2.2　ELISA检测结果

与Ctrl组比较，SD组、VD组和3MA组血清中25HVD3含量均减少（P<0.05）；与SD组比较，VD组和3MA组血清中25HVD3含量增加（P<0.05）；VD组与3MA组血清中25HVD3含量比较差异无统计学意义（P>0.05）。

与Ctrl组比较，SD组、VD组和3MA组海马组织中Aβ、TNF‑α、IL‑1β及IL‑6含量均增加（P<0.05）；与SD组比较，VD组和3MA组海马组织中Aβ、TNF‑α、IL‑1β及IL‑6含量均减少（P<0.05）；与VD组比较，3MA组海马组织中Aβ、TNF‑α、IL‑1β及IL‑6含量均增加（P<0.05）。见图3。

2.3　Western blot检测结果

与Ctrl组比较，SD组、VD组和3MA组海马组织中Beclin 1和LC3B的蛋白水平均升高（P<0.05）。与VD组比较，SD组和3MA组海马组织中Beclin 1和LC3B的蛋白水平降低（P<0.05）。SD组与3MA 组Beclin 1和LC3B蛋白水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图4。

2.4　免疫荧光检测结果

与Ctrl组比较，SD组、VD组和3MA组绿色荧光表达均明显增强（提示LC3B表达均增加）。与SD组比较，VD组的绿色荧光表达更强。SD组与3MA组绿色荧光表达无明显区别。见图5。

本实验采用改良多平台水环境法构建小鼠SD模型，用Morris水迷宫检测小鼠学习记忆能力。结果显示，与Ctrl组比较，其余3组逃避潜伏期明显延长，穿越平台次数和目标象限停留时间减少，海马组织中Aβ含量增加，提示造模成功，证实SD小鼠存在认知功能障碍，与上述文献结果一致。

本研究建立小鼠SD模型，探讨VD对SD小鼠认知功能的影响及其潜在机制。结果表明，SD小鼠血清中25HVD3含量明显减少，证实了SD可导致小鼠体内VD含量下降。另外，与SD组比较，VD组逃避潜伏期明显缩短，穿越平台次数和目标象限停留时间增加，海马组织中Aβ减少，表明补充VD能改善SD介导的小鼠认知功能障碍。

本研究发现，与Ctrl组比较，SD组、VD组和3MA组海马组织中Beclin 1和LC3B蛋白水平均增加，绿色荧光表达增强，与上述文献提及一致，表明SD可引起小鼠海马区自噬活动增强；另一方面，与SD组比较，VD组海马组织中Beclin 1和LC3B蛋白水平增多，绿色荧光表达更强，而使用自噬抑制剂3MA后，海马组织中Beclin 1和LC3B蛋白水平降低，绿色荧光表达下降，结果均提示VD通过诱导自噬增强改善SD小鼠的认知功能。

本研究通过ELISA法检测海马组织中IL‑6、TNF‑α和IL‑1β的含量，结果显示：SD组、3MA组与Ctrl组比较，IL‑6、TNF‑α及IL‑1β含量均增加；与SD组、3MA组比较，VD组中IL‑6、TNF‑α及IL‑1β含量减少。表明中枢神经炎症反应参与了SD介导的学习记忆损伤的过程，VD可调节炎症因子的表达，减轻神经炎症反应，从而改善SD小鼠的认知功能。