编译：微科盟HushKuo，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。
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导读
壬基酚（NP）因其对生物体的雌激素活性而广为人知，但其对复杂微生物群介导生化过程的影响尚未清楚。本研究报道了NP 影响污泥厌氧消化中酸化和产甲烷过程的剂量特性。低剂量（50 mg/kg）和高剂量（1000 mg/kg）NP都有利于酸化和乙酸发酵产甲烷（AM），而高剂量NP则进一步刺激氢营养型产甲烷（HM）。稳定同位素检测分析表明，随着NP 剂量的增加，主要的产甲烷途径从 AM 转变为 AM 和 HM 的组合。在NP作用下，为利于酸化和基于底物的产甲烷过程，产酸和产甲烷菌群积累且发生重构，负责将底物生物转化为乙酸盐（糖酵解、stickland反应和丙酮酸代谢）、乙酸盐运输和微生物维稳的酸化相关基因在低和高 NP 剂量下均有所富集。高低剂量NP都增强了编码乙酸发酵途径中的乙酰辅酶A脱氢酶/合成酶（CODH/ACS）和辅酶合成转运蛋白的产甲烷相关基因。此外，高剂量NP促进了CO2还原途径中的大部分基因以及辅酶 F420 和杂二硫化物还原酶合成的关键物质转运蛋白。这项研究揭示了NP在遗传水平上具有剂量特性模式对复杂微生物过程（而非特定生物）的影响，对含难降解有机物污泥的资源利用具有指导意义。
原名：Metagenomic analysis reveals nonylphenol-shaped acidification and methanogenesis during sludge anaerobic digestion
译名：宏基因组分析揭示污泥厌氧消化中的壬基酚型酸化及产甲烷过程
期刊：Water Research
IF：9.13
发表时间：2021.3.3
通讯作者：冯雷雨
通讯作者单位：同济大学
NP影响厌氧消化的实验在一系列含有300 mL污泥的相同血清瓶中进行。厌氧消化池中的NP浓度分别设置为0（对照）、50、100、200、1000 mg/kg干污泥。NP 影响厌氧消化过程（水解、酸化和产甲烷）的实验在一系列相同的厌氧反应器中使用合成废水进行。甲烷产量相对稳定后，取消化液分析溶解多糖和蛋白质、微生物群落和宏基因组，并用混合气体测定甲烷（δ13CH4）和二氧化碳（δ13CO2）的稳定碳同位素值。对于NP影响水解的实验，将450 mg BSA（模型蛋白）和90 mg葡聚糖（模型多糖）溶解在270 mL自来水中形成合成废水，并添加30 mL来自长期厌氧反应器的消化混合物为接种物。对于酸化，底物是450 mg/L谷氨酸（模型氨基酸）和 90 mg葡萄糖（模型单糖）。运行时间为3天，分析SCFAs浓度。对于乙酸发酵和氢营养产甲烷，底物分别为0.9 g乙酸盐和300 mL H2/CO2混合气体(V/V= 4/1)。 
图
1 在稳定运行（> 60 d）的条件下，NP分化厌氧消化反应器的实时（a）和平均（b）甲烷产量。（b）中的黑色*表示该组与对照组之间的数据有显著性差异（p <0.05），红色的表示该组与所有其他组之间的数据中存在显著性差异（p <0.05）。
图1（a）显示了在不同 NP 应力下厌氧消化器中甲烷的表观产率。显然，NP 的存在对污泥厌氧消化过程中的甲烷产量产生了积极影响。然而，积极影响随着污泥中 NP 浓度的变化而变化。厌氧消化系统中NP浓度为0、50、100、200和1000 mg/kg对应的平均甲烷产量分别为9.42、12.10、11.50、11.85和14.42 mL/gVSS（图1（b））。随着厌氧消化过程中污泥中NP含量的增加，产甲烷的趋势可在200 mg/kg的NP剂量处前后分为两个阶段。在第一阶段，甲烷产量先增加后保持稳定，NP含量在0-200 mg/kg范围内。在第二阶段，NP浓度在200-1000 mg/kg范围内时，甲烷产量增加，当NP剂量为1000 mg/kg时，甲烷产量达到最高。本研究中NP在污泥厌氧消化中的生物降解效率相对较低，因此NP生物降解对产甲烷的贡献可以忽略不计，对产甲烷主要由污泥的厌氧消化实现。正如NP和有机体（细胞、组织或器官）的剂量响应关系一样，甲烷产量随NP剂量而变化。基于NP可以影响的消化体系中的甲烷产量，需要进一步揭示如下问题：1）为什么NP可以加速污泥的厌氧消化？2）NP的低剂量和高剂量之间的促进机制有何不同。为了清楚地揭示未知信息，本研究人为定义了关键的 NP 浓度节点，分别设置了对照（0 mg/kg）、低剂量（50 mg/kg，对应于甲烷的第一个产量峰值）和高剂量（1000 mg/kg，对应于甲烷产量的第二个峰值）。从毒理学的角度来看，这种剂量特性关系既不是单调的促进或抑制趋势（如 J 形和 S 形曲线），也不是常见的兴奋趋势（如 U 形曲线）。因此，进一步探讨不同NP胁迫下污泥厌氧消化的机理具有重要的启发意义。
图2 NP对（a）酸化的影响（3 d运行结束时产生的SCFAs）。（b）NP对乙酸发酵产甲烷的影响（8 d运行结束时产生的甲烷）。（c）NP对氢营养型产甲烷的影响（2 d运行结束时产生的甲烷）。（d）主要产甲烷途径的变化（沼气的δ13CO2和δ13CH4的平均值以及由（δ13CO2+1000）/（δ13CH4+1000）计算的表观分馏因子（αc））。（e）NP分化厌氧消化反应器中的关键过程概览。生物废料的典型厌氧消化可大致分为两个阶段，包括水解、酸化和同型乙酸生成，以及乙酸盐、
H2
和CO2转化为甲烷（即产甲烷）。非产甲烷作用对于厌氧消化系统中生态位的稳定至关重要，其速度受到不溶性复杂底物水解的限制。值得注意的是，用于产甲烷的乙酸大部分来自酸化，由于微生物生长受到抑制，酸化可能是环境胁迫条件下潜在的限速步骤。在实际中，当系统中存在其他氢消耗微生物（如产甲烷菌）时，同型产乙酸对乙酸的贡献几乎可以忽略不计。目前结果表明，NP对厌氧消化的促进作用并非源于NP对水解的影响。对于酸化（图 2 (a)）而言，在运行时间结束时（3天），在对照和NP反应器之间观察到总SCFA的产量（6238-6479 mg COD/L）没有显著差异（P < 0.05）。酸化产生的主要短链脂肪酸是乙酸和正丁酸，占短链脂肪酸总量的90%。低和高NP 浓度的乙酸产量（4454和4209 mg COD/L）远高于对照（3429 mg COD/L），这表明在污泥酸化过程中乙酸产量的增加。通常地，大约三分之一的甲烷是由H2/CO2（氢营养型产甲烷，HM）形成的，而乙酸是生物废料消化系统中剩余三分之二（乙酸发酵产甲烷，AM）的甲烷来源。然而，目前尚未有不同NP浓度对基于底物产甲烷作用影响的信息。当操作时间为8 d时，具有低NP和高NP浓度的AM反应器中甲烷的积累分别为130.2和127.9 mL（图2（b）），高于对照（103.0 mL）。与AM不同，在HM期间， NP含量在0-1000 mg/kg 范围内，甲烷产量随着NP含量逐渐增加（图2（c））。与其他反应器相比，当操作时间为2 d时，高NP剂量导致甲烷积累急剧增加（是对照中的1.72倍）。甲烷产量受产甲烷过程和途径的控制，这意味着NP影响的过程不足以解释实际生物反应器中受 NP 影响的甲烷产量趋势，因此我们进一步研究了主要产甲烷途径的转变。图2（d）显示了不同NP含量的厌氧消化反应器中
δ13CH4
、δ13CO2和αC的值。对照中δ13CH4平均值为-47.2 ‰，随着NP浓度的升高，先增加到-45.6 ‰，然后下降到-53.4 ‰。相比之下，厌氧消化系统中δ13CO2值则呈现相反的趋势，随着NP浓度的增加分别为-26.3 ‰、-16.0 ‰和-13.6 ‰。在无、低和高NP应力下，由δ13CH4和δ13CO2计算的αC值分别为1.022、1.031和1.042。据报道，当αC < 1.027、αC> 1.065和αC ≈ 1.045时，甲烷主要由乙酸发酵、氢营养以及乙酸发酵和氢营养相结合的过程分别产生。因此，在对照和低NP剂量反应器中，主要途径是AM，随后转变为具有高NP剂量的AM和HM 组合。迄今为止，已经报道了在环境压力条件下，主要产甲烷途径（特别是受抑制的乙酸发酵途径，如在高醋酸盐和铵浓度、低 pH和产甲烷抑制剂（BES和氯仿）下）的转变。在这项研究中，NP不仅没有抑制乙酸发酵途径，而且在高 NP 剂量下，氢营养途径得到增强，这不同于先前所报道的。因此，低浓度和高浓度的 NP 对污泥的酸化和 AM 都有积极的影响；在此基础上，高浓度的NP进一步提高了HM的甲烷产量和比例（图2（e））。因此，本文重点研究污泥的产甲烷和酸化，未考虑NP对水解的影响。
图3 NP分化厌氧消化反应器中主要细菌（a）、古细菌（b）和所有微生物（c）变化的图形呈现。（a）中只显示了的丰度> 1％的细菌。（b）中绿色和红色表示的古生菌分别是乙酸发酵产甲烷菌和氢营养型产甲烷菌。
产酸细菌。由于细菌群落在环境压力下的改变，由产酸微生物介导的酸化可能是一个潜在的限速步骤。从该意义上说，相对更高的细菌多样性和均匀度是含NP厌氧消化器的特征。较高的微生物多样性和均匀度被认为是具有冗余代谢途径的发酵细菌的库，这有利于确保微生物群落的功能稳定性，并且通常厌氧反应器的稳定运行相关。本研究所采用的污泥的细菌群落以Bacteroidetes、Proteobacteria、Firmicutes、Spirochaetae、Chloroflexi、Actinobacteria、Parcubacteria、Acidobacteria以及Chlorobi等水解酸化过程的核心菌群为主导。NP 反应器中与酸化相关的细菌可分为三组。第一组是有机底物降解菌（以Acidimicrobiales和Corynebacteriales为代表），可将葡萄糖、琥珀酸盐和乳酸等转化为乙酸盐、
CO2
和H2作为中间体。第二组是和通过为乙酸发酵产甲烷菌提供乙酸而形成共营养代谢关系的微生物（即Anaerolineales和Chlorobiales）。第三组微生物能够通过转换底物类型来适应复杂的环境，避免与其他微生物种群（以Rhizobiales代表）的直接竞争，可能对厌氧消化的稳定运行产生积极的影响。NP反应器中所有上述细菌的相对丰度均比对照中的高得多，这表明存在NP时细菌群落的变化有利于污泥酸化。产甲烷古菌。产甲烷的古细菌通过将有限数量的底物转化为甲烷气体而获得生长所需的能量。同样，产甲烷古菌的多样性升高，并且与 NP 浓度相关。Methanobacteriaceae、Methanosaetaceae、Methanosarcinaceae、Methanoregulaceae以及Methanospirillaceae是科水平上厌氧发酵系统中的主导产甲烷菌。如图3（b）所示，Methanosaeta（隶属于Methanosaetaceae）和Methanosarcina（隶属于Methanosarcinaceae）进行了乙酸发酵反应分解乙酸盐，其在NP反应器中的丰度（分别为11.20%-15.43%和1.65-3.29%）高于对照（分别为9.26%和1.00%）。氢营养型的Methanoregulaceae（主要是Methanolinea）、Methanospirillaceae科（主要是Methanospirillum）、Methanobacteriaceae和WCHA1-57可将CO2还原为甲烷。对照组中氢营养型产甲烷菌占15.67%，在高剂量NP体系则升高到23.48%。另一方面，由于乙酸发酵型和氢营养型产甲烷菌在NP的积累，利用其他底物的产甲烷菌（如使用C-1化合物作为底物的Methanomethylovorans）在NP反应器中受到抑制。因此，NP胁迫下厌氧消化系统中的产甲烷群落有利于乙酸发酵和CO2还原产生甲烷。宏基因组分析用于进一步评估属于不同域的所有微生物（图3（c））。与对照（3.35%）相比，在NP反应器中获得了更多的古细菌，尤其是产甲烷菌（分别为3.57%和3.87%，对应低和高NP含量），可能与NP反应器较高的甲烷产量。
图4 （a）NP分化厌氧消化反应器中的酸化和产甲烷相关功能基因和途径相对丰度热图（黑色和红色表示的功能分别来自细菌和产甲烷菌构建的基因组）。（b）不同NP剂量的功能强化。
众所周知，微生物几乎所有的生命活动本质上都与功能基因有关。为了进一步阐明为什么微生物群落因NP负荷而转变为适合产乙酸和产甲烷的微生物的原因，在这项研究中，基于由产酸细菌和产甲烷古菌构成的基因组进行了宏基因组学分析。在厌氧消化体系中，微生物的功能包括发酵和生长，这与微生物的发酵途径和生理状态有关。酸化相关功能。产酸菌的酸化途径主要包括糖酵解（EMP和ED途径）、单糖代谢、氨基酸代谢（stickland反应）和丙酮酸代谢。值得注意的是，糖酵解和单糖代谢途径（果糖/甘露糖、半乳糖和氨基/核苷酸糖代谢，以及磷酸戊糖途径）在低剂量和高剂量的NP下均显著增强（P < 0.05）（图4（a））。此外，编码己糖激酶（HK）、6-磷酸葡萄糖异构酶（pgi）、磷酸丙糖异构酶（tpiA）、磷酸甘油酸变位酶（gp-mAI和apgM）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（gapN）、参与糖酵解的2-脱氢-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶（eda），与stickland反应有关的氨基酸还原酶（grd-ABCDE和prd）和转氨酶（asdA），以及丙酮酸代谢相关的铁氧还蛋白氧化还原酶（por和korAB）、乙酸激酶（ackA）和磷酸转乙酰酶（pta），在NP消化器中与对照相比增加了10%-275%。从产酸途径产生的乙酸应该通过运输得以利用，对此，乙酸转运蛋白基因atoE和SMCT在两种NP剂量下都得到增强。对于非产酸途径，低和高NP浓度都显著增强了翻译（核糖体）（P < 0.05）（图4（a））。核糖体的功能是在蛋白质生物合成过程中翻译mRNA以维持细胞稳态和存活。编码参与修复DNA损伤的核糖体亚基成分（RPS3）、早期发育和生物体内细胞迁移和存活的调节器（RPS7）、在核仁和细胞质之间转运的5S rRNA的分子伴侣（RPL5）和核糖体组装（RpL15）的基因在NP的作用下得到改善。然而，在NP含量低和高的情况下观察到分化的途径。嘌呤/嘧啶代谢、同源重组、错配修复和DNA复制在低NP剂量下显著增加（P < 0.05），而底物（氨基酸和单糖）转运蛋白基因（livGFHMK、rbsAC、ugpBE、aapJM、proWV和metQ）和群体感应控制生物膜形成的基因（bapA、secY和oppCD）在高剂量NP下显著增加。基于细菌基因组，酸化通过剂量特性机制增强（图4（b））。NP对参与产酸途径的功能基因有积极影响；此外，低NP剂量有利于基因调控，高NP剂量有利于膜转运和信号转导。产甲烷相关功能。基于产甲烷古菌构建的基因组对产甲烷途径（乙酸发酵反应和CO2还原）进行了分析，结果表明低和高NP含量均增强了甲烷代谢功能（ko00680）（图4（a））。对于乙酸发酵反应，NP胁迫下产甲烷菌中乙酰辅酶A合成酶（acs）和CO脱氢酶/乙酰辅酶A合成酶（cdhCDE）相关基因的相对丰度高于对照。对于CO2型途径，甲酰甲烷呋喃脱氢酶（fwdBCDEF）、甲酰甲烷呋喃：四氢甲蝶呤甲酰转移酶（ftr）、亚甲基四氢甲蝶呤脱氢酶（mtd）和5,10-亚甲基四氢甲喋呤再分解酶（mer）有关的基因以及F420和MFR辅酶合成有关的基因（cofCDEHG、fbiC和mfnCE）的丰度在NP应力下高于对照1.2-1.6倍。对于共同途径（AM和HM均存在的部分途径），基因mtrDGH（辅酶M甲基转移酶，Mtr）、mcrABCDG（甲基辅酶M还原酶，Mcr）和hdrABC（杂二硫键还原酶，Hdr）基因在存在低浓度和高浓度的NP时均被富集。因此，两种NP剂量都有益于参与乙酸发酵和共同途径的功能基因。此外，高浓度的NP对功能基因的促进作用，不仅涉及代谢途径，而且还涉及用于
CO
2
还原辅酶的合成。基于产甲烷基因组，含NP的生物膜介导的功能（ABC转运蛋白）远高于对照（图4（a））。铁复合物、钴/镍和钼转运系统的底物结合、ATP 结合和通透酶蛋白在高NP胁迫下积累。铁是原卟啉大循环中必不可少的嵌入物，用于产甲烷菌的血红素生成。钴和镍作为参与甲烷生成的辅酶中环状四吡咯（corrin 环）的中心配位离子。参与甲烷生成最后一步的Mcr的镍-corrin 辅酶F430因子和亚基MtrA含有一个钴-corrin衍生物辅基，该基团在产甲烷过程中的催化循环中发生甲基化和去甲基化。钼由于其立体相似性，阻止了硫酸盐还原中的第一种酶，从而刺激了甲烷的产生。锌的底物结合、ATP 结合和通透酶蛋白仅在高 NP 浓度下增加。锌是甲酸脱氢酶的重要位点，它催化由甲酸代替H2的氧化而生成还原型辅酶F420的反应。在锌蛋白HdrB中发现了杂二硫键还原位点，Hdr是Hdr的一个亚基，催化CoB-CoM杂二硫键还原为CoB和CoM。此外，高浓度的NP促进了与氢营养型产甲烷菌的生长和增殖有关的功能（核糖体、嘧啶代谢、RNA聚合酶和蛋白质的输出）（图4（a）），表明在高NP含量下产生了更多氢营养产甲烷菌的子细胞。基于上述结果，污泥的产甲烷过程在剂量特性机制下被促进和形成（图4（b））。低含量和高含量的NP均促进了乙酸发酵途径和共同途径中辅酶合成必需成分的转运蛋白的功能基因；此外，高剂量的NP促进氢营养途径和氢营养产甲烷过程涉及辅酶合成的关键物质的转运基因。在污泥厌氧消化过程中，响应和信号转导是由NP激活的关键功能。事实上，在个体生物体中也观察到膜渗透性和物质吸收的紊乱。NP对膜磷脂具有更高的亲和力，并影响钙向肌浆网的主动运输并导致细胞死亡。在NP诱导淡水鱼肝毒性的条件下，细胞间和细胞内的膜转运减少。基于宏基因组学分析（图4（b）），厌氧消化的细菌和古细菌的膜转运功能在实验浓度范围内随着NP的增加而增加（图4（b）），这与在个体有机体中认识到的机制不同。另一方面，目前通过精心设计控制生物体整体生理的信号转导，NP可以用于调节雌激素的作用。例如，ER信号通路在斑马鱼早期发育过程中被中心水平的NP靶向，长期暴露于NP会影响成年雄性肝脏中的胰岛素信号传导。在这项研究中，控制细菌生物膜形成的群体感应（属于信号转导）在高 NP 剂量下得到了改善（图4（b））。类比NP对生物体的雌激素作用机制，污泥中这些功能的改变可视为NP对微生物群落的“雌激素作用机制”。对于NP激活的基因，除了环境调控基因外，还检测到了许多涉及氨基酸和葡萄糖代谢的基因。与对照动物相比，NP处理的动物肝脏中己糖激酶的活性显著降低，而糖原磷酸化酶和葡萄糖-6-磷酸酶的活性呈剂量依赖性增加。暴露于不适当浓度的 NP 可能会改变葡萄糖代谢并增加患糖尿病的风险。天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、乳酸脱氢酶、硫代巴比妥酸反应物质和谷胱甘肽水平受NP影响，因此NP可诱导雄性大鼠肝脏氧化应激。污泥厌氧消化过程（尤其是酸化）是一个复杂的氨基酸、葡萄糖等有机物降解系统（图4（b）），与这些有机物在生物体内的代谢密切相关。该研究深入了解了NP在代谢途径和遗传水平上对污泥厌氧消化的剂量特性影响，并对含有难降解有机物的污泥的资源利用具有重要意义。另一方面，该项研究不仅从个体生物体层面，而且从参与复杂微生物过程的生物群体层面，扩充了NP对所有形式的“生命”影响的认识。本文结果显示，随着NP剂量的增加，污泥厌氧消化产甲烷的剂量特性增强。低和高的NP剂量均能够促进厌氧消化，具有特定的剂量特性机制：低和高的NP剂量均促进酸化和AM，并且AM在低NP剂量下主导产甲烷途径；高剂量NP进一步刺激了HM，并且AM和HM的组合在高剂量NP下主导了产甲烷途径。对于酸化，两种NP剂量都促进了参与底物运输和生物转化为乙酸盐和乙酸盐转运的功能基因。对于产甲烷，与乙酸发酵途径相关的功能基因在低和高NP剂量下积累；此外，高NP剂量还刺激了大部分参与CO2还原途径的基因和辅酶合成的关键物质转运蛋白。
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