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科研 | FRONT MICROBIOL：圈养和野生东方白鹳肠道菌群比较分析：对保护生物学的启示（国人佳作）

2021

06/18

微生态

A-

A+

本研究通过16S rRNA基因测序分析，对不同繁殖条件下东方白鹳肠道菌群进行了描述。

编译：微科盟北岸，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载。

导读

东方白鹳（Ciconia boyciana）被国际自然保护联盟（IUCN）红色名录列为濒危物种。该研究首次在不同生存条件下对东方白鹳肠道菌群多样性进行了比较分析。为了确定肠道菌群物种组成和群落结构，对天津动物园和天津七里海湿地的24份粪便样品在Illumina MiSeq平台进行了16S rRNA基因扩增子测序。结果表明厚壁菌门是优势菌门。群落结构分析表明，两种繁育条件下的种群间菌群物种多样性和丰富度存在显著差异。在野生环境下的东方白鹳肠道菌群中有更高的α多样性，而在天津动物园人工喂养的东方白鹳有较低的α多样性。主坐标分析表明两组间的微生物群落存在差异。此研究揭示了两种生存环境条件下东方白鹳肠道微生物的菌群组成和结构，该研究为东方白鹳的综合保护提供了理论依据。

论文ID

原名：Comparative Analysis of Gut Microbiota in Captive and Wild Oriental White Storks: Implications for Conservation Biology

译名：圈养和野生东方白鹳肠道菌群比较分析：对保护生物学的启示

期刊：Frontiers in Microbiology

IF：4.235

发表时间：2021.3.25

通讯作者：赵大鹏¹，周岐海²

通讯作者单位： 1天津师范大学生命科学学院， 2 广西师范大学广西珍稀濒危动物生态学重点实验室，珍稀濒危动植物生态与环境保护省部共建教育部重点实验室

实验设计

结果

1 不同DNA提取方法的比较

DNA提取是高通量测序中非常关键的一步，DNA提取方法的选择对DNA的产量和纯度有重要影响。根据结果展示， GuSCN 提取方法和TIANamp粪便DNA试剂盒比 CTAB 和SDS法产生更高的DNA产量（表2）。4种提取DNA的方法的DNA浓度都超过了10 ng/µl。GuSCN提取方法和TIANamp粪便DNA试剂盒的260/230吸光度比高于1.8，表明蛋白质污染程度低。然而，CTAB和SDS法的平均260/280吸光度比低于1.8，这表明这两种方法都造成了蛋白质污染。在东方白鹳粪便样本的研究中，通过GuSCN提取方法和 TIANamp 粪便DNA试剂盒获得的DNA均可用于高通量测序文库制备。此外，使用GuSCN方法提取DNA比TIANamp粪便DNA试剂盒成本效益高。

表1 实验样品基本信息

表2 四种不同的DNA提取方法的DNA产量和DNA纯度(吸光度比为260/280 nm)

2 测序分析

在24份东方白鹳的样品，通过Illumina MiSeq平台降噪后，一共获得了平均长度为415bp的1,263,339条原始reads。比较24个样本的原始 reads 数量、碱基对数量和平均reads长度。序列的数量从42,700至70,383不等，并且在东方白鹳的粪便中，共鉴定出2,390个OTUs（以97%序列相似性为阈值）和43个细菌菌门。细菌 α 多样性指数，包括Sobs，Shannon，Chao1，ACE和Good’s coverage在表3中。W组（天津七里海湿地；2,134）中OTUs的数量远超过Z组（天津动物园；1,555），这两个组共享1,299个OTUs。W组和Z组的 α 多样性存在显著性差异（p < 0.05）。在24份粪便样品中平均Good’s coverage覆盖率为99.28 ± 1.57%（平均值±标准差），从而获得了粪便中大部分细菌的多样性，确保了分析的准确性（表3）。

为了评估该研究测序深度是否足够估计肠道菌群的丰富度，研究人员计算了observed species的稀疏曲线。根据物种积累曲线和Good’s覆盖率估计值，曲线趋于逐渐平缓，说明采集的样本量足够大，可以鉴定出东方白鹳肠道中绝大部分的OTUs，高的Good’s覆盖率表明了在所有的样品中鉴定出大部分的细菌种类。

表3 东方白鹳各粪便样本中OTU丰富度及多样性指数

3 所有样品的细菌组成和相对丰度

按照97%的一致性上，在门、纲、目、科和属分类水平上概述了每个样品细菌组成。东方白鹳总体肠道微生物群为43个门，96个纲，188个目，338个科，675个属，1,222个种；不同分类水平的微生物组成分别如图1和补充图3-5所示。

在门分类水平上，16S rRNA序列共注释出43个原核细菌菌门（图1A）。Z组的东方白鹳肠道菌群的优势菌门是厚壁菌门（Firmicutes，65.59%），放线菌门（Actinobacteria，17.23%）和变形菌门（Proteobacteria，10.48%）。这三个优势菌门占据了24份样品93.30%的序列，而未鉴定出细菌序列只占所有序列的0.01%（图1A）。W组东方白鹳的肠道菌群的优势菌门为厚壁菌门（Firmicutes，28.43%）、变形菌门（Proteobacteria，23.58%）和放线菌门（Actinobacteria，14.71%）和未分类的细菌序列只占W组所有序列的0.04%（图1A）。

在属分类水平上，15个菌属拥的丰度均大于2%（图1B）。在W组中优势菌属为乳杆菌属（Lactobacillus，8.33%），norank_f_Anaerolineaceae（5.92%），norank_f_Xanthomonadales_Incertae_Sedis （3.91%），norank_f_Bacteroidales_S24-7_group（3.38%），norank_c_Cyanobacteria（3.35%）和产硫酸杆菌属（Thiobacillus， 2.943%）。在Z组中的优势菌属为Paeniclostridium（23.82%），乳杆菌属（Lactobacillus，8.55%），消化链球菌属（Peptostreptococcus，7.78%），Clostridium_sensu_stricto_1（7.17%），放线菌属（Actinomyces，3.99%）和Romboutsia（3.77%）。平均相对丰度最高的10个菌属在表4中。在属分类水平上，24个样品的群落热图分析展示在图2A中。

α多样性，指的是特定区域内的多样性，计算α多样性以检验了天津动物园和天津七里海湿地两组东方白鹳的差异。通过OTUs （Sobs和Chao指数）检验展示了W组的群落丰富度指数高于Z组，这表明了W组的肠道菌群有较高的丰富度。两组间的差异具有统计学意义（p < 0.05；图2B）。检验两组间的细菌群落多样性（香农指数），香农指数在W组中显著高于Z组。这表明了在菌群多样性W组和Z组之间有显著性差异（p < 0.05；图2C）。

图1 在门和属分类水平上所有样品的菌群结构。（A）柱状图展示了11个优势菌门的丰度和分布。（B）柱状图展示了11个优势菌属的丰度和分布。

图2 在属分类水平上的群落热图分析和两个种群间肠道菌群α多样性。（A）在属分类水平上的群落热图分析。（B）在Z组和W组的细菌群落丰富度（通过Sobs指数测定）。（C）在Z组和W组的细菌群落多样性（通过香农指数测定）。p < 0.05 具有统计学意义，***p ≤ 0.001。

4 β多样性分析和菌群结构

使用基于Bray-Curtis距离的系统树分析两种繁殖环境下样品间的关系（图3A）。系统树表明天津动物园的东方白鹳肠道菌群聚集在一起，天津七里海湿地的样品聚集在一起。为了评估24份样品的β多样性，PCoA用来描述Z组和W组的相似性或差异性（图3B，图3）。每个符号代表在PCoA图上一个样品的菌群组成，当考虑肠道菌群相对丰度时，大部分粪便样品被PCoA分析分成两个组。与聚类分析一致，基于加权与未加权 UniFrac 指数，Z组聚集在一起并与W组分离。这两个组倾向于分别聚集在一起，这表明每一组内有独特的微生物菌群。使用加权 UniFrac 指数，在变异量最大的主坐标轴1（PC1）将Z组的细菌群落与W组分离（图3B）。使用未加权 UniFrac 指数，24份样品的细菌群落沿PC1变化最大（图3C）。相似性分析（ANOSIM）证实了这一种聚类模式和未加权的UniFrac显示出更清晰的群落分组（ANOSIM，R = 0.71）。两组间微生物组成在门分类水平（ANOSIM，R = 0.5621，p = 0.001）和属分类水平（ANOSIM，R = 0.6196，p = 0.001）有显著性差异。

分析两组间的独特菌群和共享的菌群。维恩图展示了24份样品共享1,299个核心细菌OTUs和独特的OTUs分别在Z组中有256个和在W组中有839个。

两组东方白鹳的肠道菌群有一些相似性。5大丰度最高的核心菌属分别为厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、绿弯菌门（Chloroflexi）和拟杆菌门（Bacteroidetes），而5大丰度最高的核心菌属为Paeniclostridium、乳杆菌属、消化链球菌属、Clostridium_sensu_stricto_1和放线菌属。接下来， LEfSE 分析被用来发现两组东方白鹳肠道菌群中不同的OTUs（图4A）。LEfSE分析分别在Z组和W组中发现10个和20个差异微生物类群（LDA > 4.0; 图4A）。

进化分支图展示了24份粪便样品在各分类水平上的核心细菌种类均存在显著差异。在门分类水平上，厚壁菌门的丰度在Z组中显著高于W组，而拟杆菌门的丰度在W组中显著高于Z组（p < 0.001；图4B）。在属分类水平上，Paeniclostridium在Z组中的丰度显著高于W组（p < 0.01；图4C）。

基于高通量测序，共计预测了296个KOs和42个KEGG代谢途径，并被注释到次级KEGG途径。次级KEGG途径与肠道微生物类群相关包括细胞过程、代谢和遗传信息处理，这表明肠道菌群差异对东方白鹳代谢有很重要的影响（图5）。

图3 肠道菌群聚类分析和PCoA分析。（A）Z组和W组肠道微生物进化的聚类分析。通过Mothur软件基于Bray–Curtis距离生成了肠道菌群树。（B）基于东方白鹳肠道菌群加权UniFrac指数的PCoA分析。（C）基于东方白鹳肠道菌群未加权UniFrac指数的PCoA分析。

图4 肠道菌群的LEfSe分析和比较肠道微生物类群的核心群菌。（A）基于OTUs鉴别特征的LEfSe分析。（B）在两组东方白鹳肠道菌群的核心5大核心菌门。（C）在两组东方白鹳肠道菌群的核心5大核心菌属。

图5 在每个样本中预测的KEGG功能热图。

讨论

该研究通过在Illumina MiSeq平台上对两种繁殖环境下的东方白鹳粪便样本进行16S rRNA基因扩增子测序，分析了肠道菌群的组成和比较了差异。东方白鹳是一种濒临灭绝的水鸟，并且提出了许多策略保护东方白鹳，包括建立合适的自然保护区。然而，有效支持东方白鹳相关保护工作的肠道微生物知识有限。因此，为了分析东方白鹳在圈养和野生环境下肠道菌群组成和差异，研究人员通过16S rRNA基因高通量测序分别对天津动物园和天津七里海湿地的东方白鹳进行肠道菌群比较分析。这种方法可以在不需要培养的情况下探索微生物群的组成和丰度。

1 微生物菌群组成和相对丰度

东方白鹳粪便中的细菌群落特征表明，圈养组和野生组的微生物群落组成相似，但细菌丰度在两组间存在显著差异。在门分类水平上，东方白鹳的肠道菌群主要由厚壁菌门、变形菌门和放线菌门组成，并且厚壁菌门是Z组和W组中丰度最高的革兰氏阳性菌。该菌群组成与其他野生鸟类基本一致，例如，加拿大鹅、丹顶鹤、达尔文雀、帽带企鹅、欧洲秃鹃和鸮鹦鹉，厚壁菌门是鸟类肠道菌群的优势菌群。

厚壁菌门的成员在代谢、消化、吸收蛋白质和其他营养物质等功能中扮演了重要的作用。例如，厚壁菌门与分解脂肪酸相关，并且厚壁菌门可以产生大量的丁酸盐，丁酸盐被认为是有益健康的重要物质，因为它可以提高胰岛素敏感性，调节能量代谢，增加瘦蛋白基因表达。拟杆菌门的主要产物是乙酸和丙酸。丙酸可以降低参与脂肪酸合成相关酶的表达，乙酸能促进胰岛素和胃饥饿素的分泌。尽管一些研究推测在许多动物模型和人类中，厚壁菌门与拟杆菌门（F/B）比率可能与肥胖有关，但是表明肥胖与厚壁菌门/拟杆菌门比值变化之间存在关联的证据并不能令人信服。在该研究中，Z组中F/B比例高于W组中的比例，说明天津动物园东方白鹳的肠道菌群可以帮助宿主更有效地利用营养物质和从食物中获取热量，因为在这些途径中厚壁菌门比拟杆菌门更有效。天津七里海湿地东方白鹳的体重和健康状况等生理指标难以获取，因此很难了解厚壁菌门/拟杆菌门之比与两组体重之间的关系。

Paeniclostridium是Z组中最丰度最高的菌属，而乳杆菌属在W组中是最丰度最高的菌属，在Z组中也是最重要的菌属之一。在Z组和W组中乳杆菌属的丰度均较高（分别为8.55%和8.33%）。在之前的报道中，乳杆菌属是肠道菌群中重要的细菌类群，拥有较高水平的β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶。在这项研究中，两组丰度相似的乳杆菌属可能与食性组成相关。东方白鹳的食量很大，尽管两组的食性组成不同，但是在不同环境中摄入的糖分可能是相似的。因此，研究食性组成与生存环境的关系和探究这些细菌在东方白鹳代谢途径中的功能非常有意义。

2 β多样性分析和菌群结构

聚焦于系统发育关系的UniFrac方法是由Lozupone 和 Knight开发的。加权和未加权的UniFrac指数可以有效的分析微生物群落的差异和相关性。在这项研究中，加权和未加权的UniFrac指标都表明，每个粪便样本都有不同的微生物群落，并且东方白鹳肠道菌群在不同繁殖条件下基本保持一致并聚集在一起。

采用PICRUSt方法对东方白鹳的微生物功能进行了分析。东方白鹳的肠道菌群与功能相关，例如细胞过程和新陈代谢。这些数据有助于理解肠道微生物类群与代谢之间的关系，以及肠道微生物对宿主健康的影响。然而，就像其他鸟类肠道微生物群的研究一样，目前这项研究的局限性是从每只鸟类身上获取DNA，这影响了个体水平上肠道微生物群与宿主遗传和生理关系的研究。

在门分类水平上，24份粪便样品分析揭示了东方白鹳的肠道菌群与丹顶鹤和黑颈鹤的结果相似，因为厚壁菌门是这三种鸟类的优势菌门。比较东方白鹳的Z组和W组肠道菌群相对丰度揭示了肠道菌群结构和丰度在门分类水平上是相对稳定的，但在属分类水平上是多变的和复杂的。微生物组成的丰富度和多样性存在显著差异，并且宿主肠道菌群可能与食性、地形和季节变化有关。Z组与W组的差异主要表现在生存条件和饮食条件上。天津七里海湿地的东方白鹳对能量的要求更高，食性组成也更多样化，所以W组比Z组有更丰富的肠道微生物群。本研究表明生物地理因素和膳食因素可能影响了东方白鹳肠道菌群结构，因为两组物种的代谢和能量采集需求存在差异。这与之前鸟类的相关研究结果一致，即肠道微生物的群落结构和丰度主要受食性的影响。食性组成的差异可能导致两组粪便微生物群的差异，食性组成和生存条件对粪便微生物群的作用有待进一步研究。所以接下来，研究人员将结合宏基因组学和代谢组学来研究生存条件是否改变粪菌群。此外，因为不同的微生物类群对碳水化合物、蛋白质和纤维素的消化能力有不同的效果，食物组成的差异将对宿主肠道微生物群的变化产生重要影响。这可能会影响东方白鹳对营养成分的利用，并可能导致东方白鹳患消化道疾病。因此，对东方白鹳肠道菌群的研究有助于了解不同细菌在宿主肠道内消化吸收的具体功能，并可能加强对濒危物种人工繁殖种群和野生种群中的保护。

结论

本研究通过16S rRNA基因测序分析，对不同繁殖条件下东方白鹳肠道菌群进行了描述。Z组与W组菌群组成相似，但细菌的丰度不同。遗传因素是一样的，由此推测，这些差异主要与环境和食性有关。在不同繁殖条件下，大多数肠道微生物是分组聚集的，并且肠道菌群与宿主代谢途径相关。该研究揭示了两种繁殖条件下东方白鹳肠道菌群的组成及差异。这些结果将有助于研究人员进一步理解东方白鹳肠道菌群多样性与栖息环境和食性结构之间的关系，并且有助于这一濒危物种的综合保护。