导读
蛋白质、碳水化合物和脂肪等常量营养素的均衡摄入对于生物体的健康至关重要。摄入足够的热量但蛋白质不足可能导致多种疾病，包括蛋白质缺乏症（kwashiorkor）。味觉受体（T1R1-T1R3）可以检测环境中的氨基酸，而细胞感受器（Gcn2和Tor）可以监测细胞内的氨基酸水平。当饮食中缺乏蛋白质时，动物会选择含有较大量蛋白质或必需氨基酸（EAAs）的食物作为来源。这表明食物选择的目的在于实现特定常量营养素的目标量，这是在EAA缺乏诱导的特异性反应的帮助下实现的，而人们对此知之甚少。我们在果蝇中发现，微生物-肠-脑轴检测到EAAs缺乏，并刺激增加对EAA的食欲。蛋白质不足诱导前中肠肠上皮细胞中神经肽CNMamide（CNMa）的高度表达。在蛋白质缺乏的果蝇中，沉默CNMa-CNMa受体轴阻断了EAA缺乏诱导的特异性代偿反应。此外，带有产EAA共生微生物的悉生果蝇对EAA的食欲降低。相比之下，带有不产亮氨酸或其他EAA的突变微生物的悉生果蝇表达较高的CNMa水平且对EAAs有较大食欲。我们由此提出肠上皮细胞感受饮食和微生物来源的EAA水平，并通过CNMa将EAA缺乏的状况传达给大脑。
原名：Response of the microbiome–gut–brain axis in Drosophilato amino acid deficit
译名：果蝇中微生物-肠-脑轴对氨基酸缺乏的反应
期刊：Nature
IF：42.778
发表时间：2021.5.5
通讯作者：Won-Jae Lee
通讯作者单位：首尔国立大学全基因组学国家创新研究计划中心与生物科学学院
1 氨基酸缺乏可代偿性增加EAA食欲，并刺激肠道中CNMa表达我们研究了长期缺乏饮食氨基酸的成年果蝇是否能够选择含有EAA的食物。我们给缺乏氨基酸的果蝇以下食物选择，这些食物分别混合在葡萄糖琼脂培养基中：10 L-EAAs（可以代谢，但不能体内合成），10 D-EAAs（不能代谢），10 L-非必需氨基酸（L-NEAAs）和/或10 D-NEAAs。缺乏氨基酸的雌蝇强烈地偏爱含有L-EAAs而非D-EAAs的培养基，而不缺乏氨基酸的雌蝇没有表现出这种偏爱（图1a）。这种氨基酸缺乏所诱导的选择性在雄性和处雌蝇中同样存在。在含有L-EAAs和D- NEAAs与含有D-EAAs和D- NEAAs的葡萄糖琼脂培养基中作出选择时，被剥夺氨基酸两天的果蝇显示出对含L-EAAs和D- NEAAs的培养基的偏爱（图1b）。相比之下，被剥夺氨基酸的果蝇在含D-EAAs和L-NEAAs与含D-EAAs和D-NEAAs的葡萄糖琼脂之间进行选择时，没有表现出任何偏爱（图1c）。这些结果表明，蛋白质剥夺果蝇偏好L-EAAs，而非L-NEAAs。当进食等热量但膳食酵母（果蝇的主要氨基酸来源）含量不同的饮食时，接受低到中等量膳食酵母（0-4％）的果蝇仍然优选L-EAAs胜过D-EAAs，而接受更大量酵母（6-20％）的果蝇没有表现出对L-EAAs的偏爱。这些数据支持如下假说：膳食氨基酸摄入不足代偿性地促进果蝇对L-EAAs的食欲。检测饮食中EAAs缺乏并作出响应的器官或细胞类型目前尚不清楚。我们通过研究味觉感觉神经元在促进蛋白质缺乏果蝇对EAA的代偿性食欲中的作用来开始探究这一问题。通过Ir76b（一种化学感觉离子型受体）标记味觉感觉神经元，已经显示出一些味觉感觉神经元可以对环境中氨基酸作出反应，并调整对食物的偏好性。但是，我们发现，在二选法中（1- EAA与D-EAAs），Ir76b +神经元被灭活的果蝇的行为反应与对照果蝇的行为反应是无法区分的。此外，大多数味觉细胞已转化为其他细胞类型的poxn突变体在二选分析中显示出正常的行为反应。继而，我们探究了大脑中表达Dh44 的神经元在L-EAA选择中的作用。该神经元可以检测糖含量，此前研究表明它对低水平的氨基酸也能作出响应。然而，表达Dh44 的神经元被沉默的果蝇表现出的行为反应与对照果蝇没有显著差异。这些结果表明，在蛋白质剥夺果蝇中，先前已知的营养物感受器不参与对L-EAA的代偿性选择偏好（详见原文补充材料）。由于肠道是营养物质进入人体的入口，我们假设肠道细胞直接对管腔中的EAAs含量变化做出反应。为了检验这一假设，我们监测了饮食中氨基酸的变化如何改变了不同肠道激素的表达。氨基酸缺乏显著上调了CNMa mRNA的表达（图1d）。相反，给果蝇补充富含酵母的饮食，CNMa转录水平成比例下调。利用含CNMa报告基因的果蝇（CNMa-Gal4> UAS-GFP）发现，CNMa的表达在前中肠被诱导，主要在R2区。通过免疫组化验证了该区域中CNMa蛋白的表达（图1e）。我们进一步证明，R2区的肠上皮细胞是表达CNMa的主要细胞类型（图1e）。且肠内CNMa的表达和对EAAs的偏好是由EAA剥夺（非NEAA剥夺）而特异性诱导的（图1f），进一步证明肠上皮细胞对EAAs缺乏有反应，而对NEAAs缺乏无反应。使用CaLexA报告系统，我们还发现，表达CNMa的肠上皮细胞胞质中钙离子水平因 EAA缺乏（非NEAA缺乏）而增加（图1f）。这些结果表明，表达CNMa的肠细胞作为营养物质感受细胞特异性地对EAA缺乏做出反应。值得注意的是，相比对照果蝇而言，即使缺少单一一种L-EAA的全纯饲养（holidic diet）果蝇也表达较高水平的CNMa，较高的胞内钙离子水平和对L-EAAs更大的饮食偏好（图1g）。
图1. 不依赖于味觉，氨基酸缺乏可代偿性促进EAA食欲，并刺激肠道中CNMa表达。
a-c，在指定的时间（5、24、48和72小时）内，喂食（-）或被剥夺氨基酸（AA）的w 1118交配雌蝇的二选偏爱。果蝇L-EAA和D-EAA（a），L-EAA + D-NEAA 和 D-EAA + D-NEAA （b）或 D-EAA + L-NEAA 和 D-EAA + D-NEAA （c）之间做选择。所有测试食品均含有D-葡萄糖。d，饲喂含10％酵母的琼脂（无剥夺）的果蝇与仅饲喂100 mM葡萄糖24小时（AA剥夺）的果蝇的肠肽标准化mRNA表达水平（n =4）。e，左图，w 1118对照与CNMa突变果蝇R2区肠上皮细胞染色的共聚焦图像，抗CNMa抗体（红色），DAPI（蓝色）；中图， CNMa-GAL4 > UAS-GFP果蝇肠道共聚焦图像。天然GFP荧光（绿色）与抗CNMa抗体（红色）共标记；右图，R2区中方框区域的放大图像。f，EAA剥夺，而非NEAA剥夺，诱导CNMa表达，使得偏爱L-EAAs，并可能动员细胞内钙。二选的偏爱实验中，w 1118果蝇先饲喂了缺乏EAA的饲料和缺乏NEAA的饲料两天（n =13）。在饲喂两天EAA缺乏饲料和NEAA缺乏饲料的CNMa - GAL4 > UAS-GFP蝇或CNMa - GAL4 > CaLexA蝇中，前中肠R2区域的代表性共聚焦图像。g，单种EAA的缺失诱导CNMA表达，使得偏爱L-EAAs，可能动员细胞内钙。二选的偏爱实验中，w 1118果蝇先饲喂缺乏单一EAA（精氨酸，色氨酸，缬氨酸，异亮氨酸或亮氨酸）的完整饮食三天（n =12）。CNMa - GAL4 > UAS-GFP果蝇或CNMa - GAL4 > CaLexA果蝇的R2区域中的代表性共聚焦图像，这些果蝇用缺乏单一EAA的整体饮食喂养了三天。代表性图像选自每种情况下的至少20个独立样本。数据为平均值±标准误。 P 值已显示；a，d，f，g采用one-way ANOVA与Tukey’s post-hoc检验 ； b，c中采用未配对两尾t检验。比例尺20 μm（e，左和右）；200 μm（e，中间），50 μm（f，g）。2 肠道CNMa和神经元CNMaR组成肠脑轴促进氨基酸缺乏时对EAA的食欲鉴于在其他组织如脂肪体和大脑中也观察到了
CNMa的表达，我们于是探究了哪种组织对EAA的代偿性食欲调节是重要的。我们制造了CNMa无效突变果蝇，这些果蝇能存活且具有生殖能力，但对蛋白质缺乏诱导的L-EAAs偏好性降低（图2a）。尤为重要的是，在CNMa突变果蝇中，组织特异性再表达CNMa在肠上皮细胞（而非脂肪体或脑）足以还原对L-EAAs的偏好（图2a）。此外，RNA干扰（RNAi）敲低肠上皮细胞中CNMa表达削弱了对L-EAAs的偏好，但在脂肪体或大脑中无此现象。这些功能性的实验证明了肠上皮细胞中CNMa的表达对于EAA缺乏诱导的特异性反应至关重要。我们继而研究了氨基酸缺乏诱导肠CNMa表达的分子机制。氨基酸缺乏激活general control nonderepressible 2（GCN2），但使雷帕霉素（Tor）靶点失活。这两种作用使得细胞适应较低的细胞内氨基酸水平。使用磷酸特异性抗体对全肠裂解产物进行蛋白质印迹分析证实，EAA缺乏增强了真核生物起始因子2α（eIF2α）的磷酸化，但抑制了核糖体蛋白S6激酶（S6K）的磷酸化，S6K是Tor的下游激酶。敲除Gcn2（通过表达Gcn2-RNAi）或激活Tor（通过过度表达Tor）可以阻断氨基酸缺乏诱导的肠内CNMa表达，但不能阻断脂肪体或大脑中的CNMa表达（图2b）。Gcn2的激活刺激激活转录因子4（Atf4），有助于维持氨基酸的细胞内代谢，而Tor信号的失活则激活了小眼症相关转录因子（Mitf），有助于调节饥饿诱导的自噬。RNAi介导的Atf4（也称为crc）或Mitf的敲除消除了由氨基酸缺乏诱导的CNMa的表达，而对照mRFP或ninaB RNAi的表达则没有作用（图2b）。肠上皮细胞特异性失活Atf4或Mitf削弱了氨基酸缺乏时对L-EAAs的偏好性（图2c）。值得注意的是，当CNMa在肠上皮细胞中特异性表达时，上述这些果蝇中观察到的对L-EAAs偏好性减弱的情况完全恢复了正常（图2c，d）。这些发现表明肠上皮细胞可以通过Gcn2-Atf4和Tor-Mitf途径检测到EAA缺乏，这些途径诱导CNMa表达，进而触发对EAAs的代偿性食欲。在基于异源细胞的GPCR筛选测定系统中，G蛋白偶联受体（GPCR）CG33693被推测为可能的CNMa受体（CNMaR）。我们发现，条件性失活表达CNMaR的神经元导致果蝇在氨基酸缺乏时对EAAs的偏爱减弱（图2e）。相反，条件性激活表达CNMaR的神经元即使在饱食的果蝇中也诱导了对EAAs的偏爱（图2f）。为进一步验证CNMaR的作用，我们制造了一个CNMaR突变体，发现CNMaR突变的果蝇在氨基酸缺乏时无法代偿性增加对L-EAAs的食欲（图2g）。在CNMaR突变果蝇的表达CNMaR 的细胞中表达CNMaR cDNA完全恢复了突变果蝇对L-EAAs的食欲（图2g）。此外，神经元特异性敲低CNMaR（nSyb-GAL4> UAS-CNMaR-RNAi）消除了果蝇在氨基酸缺乏时对EAAs的偏爱（图2h）。值得注意的是，由肠上皮细胞特异性表达CNMa（NP1-GAL4>UAS-CNMa）诱导的对L-EAAs的偏好在表达CNMaR的细胞失活时被完全消除（图2i）。
图2. 肠道CNMa和神经元CNMaR组成肠脑轴促进对EAA的代偿性食欲。
a，氨基酸缺乏的CNMa突变果蝇的偏好，其中UAS-CNMa在肠上皮细胞（NP1-Gal4），脂肪体（Cg-Gal4）或神经元（Nsyb-Gal4）中特异性表达。b，在CNMa-Gal4 > UAS-GFP果蝇（对照）或CNMa-Gal4 > UAS-GFP果蝇的前中肠R2区域GFP荧光的代表性共聚焦图像，其中也包含UAS-mRFP，UAS-ninaB RNAi，UAS -Gcn2 RNAi，UAS-Atf4 RNAi，UAS-Tor WT或UAS-Mitf RNAi。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺，50μm。c，d，表达NP1-GAL4（对照），NP1-Gal4>UAS-Atf4 RNAi（Atf4 RNA）或NP1-Gal4>UAS-Atf4 RNAi + UAS-CNMa（Atf4 RNAi + CNMa）（n = 11）（c）和NP1-Gal4（对照），NP1-Gal4>UAS-Mitf RNAi（Mitf RNAi）或NP1-Gal4>UAS-Mitf RNAi + UAS-CNMa（Mitf RNAi + CNMa）（n = 12）（d）的果蝇在氨基酸缺乏时的选择偏好。e，f，条件沉默CNMaR +神经元的果蝇（n = 7）在氨基酸缺乏时的选择偏好（e）和条件激活CNMaR +神经元的果蝇（n = 8）在氨基酸缺乏时的选择偏好（f））。g，h，缺乏氨基酸的CNMaR突变果蝇和表达CNMaR-Gal4（n = 9）的CNMaR突变果蝇（g），以及缺乏氨基酸的Nsyb-Gal4>UAS-CNMaR RNAi果蝇（n = 10）（h）的选择偏好。i，携带CNMaR-LexA>LexAop-TNT的NP1-Gal4>UAS-CNMa果蝇和NP1-Gal4> UAS-CNMa果蝇的选择偏好。数据为平均值±标准误； P 值已标注；在a，c，d，g，i中使用one-wayANOVA与Tukey’spost-hoc检验 ；e，f，h中采用未配对双尾t检验。据报道肠道共生细菌可能是肠腔内
EAAs的来源，因此我们试图确定CNMa的表达和对EAAs的补偿性食欲是否受到共生微生物的影响。我们发现，在氨基酸缺乏时，与常规饲养的果蝇相比，无菌（GF）果蝇对L-EAA的偏好性增加（图3a）。但饲喂了足够量的膳食氨基酸（例如15％的膳食酵母）的GF果蝇的CNMa表达较低，并且对L-EAA无偏爱（图3b）。相比之下，饲喂10％饮食酵母的GF果蝇在其前中肠表达高水平的CNMa，并表现出对L-EAAs的偏好。这些结果表明共生微生物促成了氨基酸的基础水平，从而改变了CNMa的表达和对EAAs的代偿性食欲。醋杆菌科（Acetobacteraceae）和乳酸杆菌科（Lactobacillaceae）是果蝇肠道微生物组中发现的两个主要细菌家族。为明确对果蝇的摄食行为产生影响的特定共生细菌，我们用醋杆菌科（Acetobacter pomorum）或乳杆菌科（Lactobacillus plantarum）的代表成员对GF果蝇进行了单菌定植。通过在肠道中定植A. pomorum，而非L. plantarum，可以消除GF果蝇中CNMa的表达和对L-EAA的偏好（图3c），表明A. pomorum有助于肠腔内氨基酸的产生和/或吸收。此外，比较基因组学分析表明，参与A. pomorum氨基酸代谢的生物合成途径不同于L. plantarum中的生物合成途径（图3d）。我们发现参与支链氨基酸（BCAAs）产生的四个亮氨酸生物合成基因（leuA，leuB，leuC和leuD）和三个异亮氨酸或缬氨酸生物合成基因（ilvA，ilvC和ilvD）在乳酸菌属（Lactobacillus）成员中是缺失的，而在醋菌属（Acetobacter）成员中是存在的（图3d）。由于支链氨基酸可以激活Tor激酶，Tor的激活能拮抗CNMa表达及CNMa依赖的对L-EAAs的偏好，我们假设共生Acetobacter衍生的支链氨基酸（例如亮氨酸）通过抑制CNMa的表达来抑制对L-EAAs的偏好。为验证这一假设，我们制造了缺乏leuB（Aceto ΔleuB）或ilvA（Aceto ΔilvA）的Acetobacter突变株，分别无法合成亮氨酸或异亮氨酸，然后将这些突变菌株定植于GF果蝇的肠道，与定植亲本野生型菌株（Aceto WT）的果蝇进行比较。如所预期的，CNMa的表达和对L-EAAs的偏好在定植野生型菌株的GF果蝇中显著降低（图3e）。相比之下，定植于Aceto ΔleuB或Aceto ΔilvA迅速诱导果蝇CNMA表达并呈现出对L-EAAs的强烈偏好（图3e），表明共生细菌产生的单个BCAA的缺失对EAA缺乏诱导的特异性反应产生了重要影响。然而，给GF果蝇定植缺少一个NEAA如脯氨酸的Acetobacter突变株（Aceto ΔproC），不诱导CNMA表达及对L-EAAs的代偿性偏好（图3e）。为进一步验证共生细菌在产BCAA中的作用，我们制造了一种L. plantarum菌株，该菌株表达了七个介导BCAA产生的基因（Lacto BCAA），这些基因在该菌株原本的基因组中并不存在。作为对照，定植野生型L. plantarum（LactoWT）的GF果蝇高表达CNMa并显示出对L-EAA更强的偏好，当给予果蝇支链氨基酸膳食后该现象消失（图3f）。重要的是，定植Lacto BCAA降低了GF果蝇CNMa的表达和对L-EAAs的偏爱（图3f）。该结果表明，Lactobacillus无法影响果蝇对L-EAA的偏爱是由于该菌不能产生BCAAs。在果蝇膳食中添加亮氨酸或将leuB重组进Aceto ΔleuB菌（即，GF果蝇定植AcetoΔleuB_leuB菌株）完全消除了定植Aceto ΔleuB所致的高水平CNMa及对L-EAAs的强烈偏好（图3e）。该结果表明，共生菌Acetobacter可提供饮食性BCAA，例如亮氨酸和异亮氨酸，降低CNMa的表达，从而抑制对EAA的代偿性食欲。总之，蛋白质缺乏可诱导果蝇前中肠R2区段的肠上皮细胞表达CNMa肽，从而诱发EAA缺乏所致的特异性反应。该过程很可能是通过与大脑中表达CNMaR的神经元的相互作用而实现的（图3g）。本质上，这些肠上皮细胞作为肠道中的感受器，当感受到内环境中的EAA水平过低时可代偿性增加对富含EAAs食物的食欲。该感受器可通过以下方式补充先前已在大脑发现的其它摄食后氨基酸感受器的作用：（1）检测并对EAAs甚至单个EAA缺乏做出反应；（2）在氨基酸缺乏时释放肠道激素CNMa，以触发肠道与大脑之间的交流，这可能引发对富含EAA的食物的“渴望”。
图3. 肠道微生物调节代偿性EAA食欲。
a，在指定的持续时间（5、24、48和72小时）喂食（-）或剥夺氨基酸的无菌w 1118交配雌蝇的两选偏爱。b，以10％或15％饮食酵母为食的GF果蝇或常规饲养（CV）w 1118果蝇的两选偏爱（n = 7），以及表达CNMa-Gal4>UAS-GFP的GF和CV两种果蝇R2区代表性共聚焦图像。c，（n = 12）GF w 1118果蝇（+无）、定植A.pomorum （+AP） GF w 1118果蝇或L. plantarum WJL（+ LPWJL）GF w 1118果蝇的双选偏爱；及GFCNMa-Gal4> UAS-GFP果蝇（+无）和CNMa-Gal4>UAS-GFP（+ AP或+ LPWJL）果蝇的R2区域中的代表性共聚焦图像。d，醋杆菌科和乳杆菌科成员的氨基酸合成基因的热图分析。与A.pomorumDM001相比，其他细菌中生物合成基因的氨基酸序列百分比显示为蓝色梯度。无或少于20％的生物合成基因以红色显示。e，CNMa-Gal4>UAS-GFP的GF果蝇的R2区域代表性共聚焦图像；proC基因（AcetoΔproC）或leuB基因（AcetoΔleuB）突变的Acetobacter菌定植果蝇的两选偏爱。AcetoΔleuB中重新引入leuB基因以产生AcetoΔleuB_leuB菌株。饮食中添加10 mM亮氨酸来实现AcetoΔleuB的饮食补充。f，CNMa-Gal4> UAS-GFP的GF果蝇R2区域中具有代表性的共聚焦图像；定植L. plantarum WJL的GF w 1118果蝇（获得了产BCAA的能力）的二选偏好。通过向饮食中添加10 mM亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸（LactoWT + BCAA），实现L. plantarum WJL（LactoWT）定植果蝇的膳食补充。g，微生物-肠-脑轴模型。在EAA缺乏时，Atf4和Mitf（以及其他可能的未知因素）会上调CNMa，CNMa作用于表达CNMaR的神经元，从而刺激代偿性EAA食欲。比例尺50μm（b，c，e，f）。数据为平均值±标准误。已示P值；在a–c，e，f中采用one-wayANOVA与Tukey’spost-hoc检验 。前中肠是食物摄入后的直接接触部位，主要由干细胞、肠内分泌细胞和肠上皮细胞组成。肠内分泌细胞对各种环境刺激，包括营养物质做出反应，并分泌神经肽介导大脑与其他器官之间的互作。与之相反，既往认为肠上皮细胞的作用是释放消化酶，参与食物的消化与吸收。然而，此项工作和最近的另一项研究表明，肠上皮细胞的作用较为复杂，不仅限于营养物质的消化与吸收。果蝇中的这一作用机制与哺乳动物中成纤维细胞生长因子21（FGF21）介导的机制相似。在哺乳动物中，蛋白质缺乏迅速诱导周围组织中FGF21的表达，而FGF21的表达也依赖于ATF4和转录因子EB（TFEB；MITF家族成员）途径。 FGF21最终向大脑发出信号，通知人体蛋白质缺乏状态，并触发应对蛋白质缺乏的行动。FGF21主要在肝脏中表达，在其他组织中也有表达。果蝇CNMa也存在于脂肪体内，脂肪体在生理上类似于哺乳动物的肝脏和脂肪组织。然而，我们在果蝇中进行的组织特异性实验表明，肠上皮细胞而非脂肪体才是由氨基酸缺乏诱导的CNMa和代偿性EAA食欲上调的关键。最近的两项研究证明肠神经元和大脑之间的直接联系，这为“肠上皮细胞释放的CNMa肽直接激活表达CNMaR 的肠道神经元进而将肠道信息传达给大脑”提供了更多的理论依据。但同样可以想到的是，CNMa作为一种激素释放到循环系统中从而刺激大脑。未来需要进一步的实验来确定CNMa在果蝇中的作用以及哺乳动物中相关肽在调节蛋白质稳态中的作用。在发展中国家，慢性蛋白质缺乏症常导致儿童营养不良；而在发达国家，蛋白质食欲失调可能会导致营养失衡。我们的研究发现肠道感受器能检测EAAs缺乏并介导对EAA的代偿性食欲，这一发现将极大地增进我们对代谢疾病和饮食相关疾病的生物学和病因学的认识。
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