RNA-Seq+qPCR,无参转录组揭示幼体硬壳蛤色素沉着分子机制

2021
08/13

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派森诺生物
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色素是贝壳颜色产生的主要原因。在本研究中,作者对非色素沉着、白色和红色的硬壳蛤进行了RNA-Seq分析,以探讨幼体硬壳蛤色素沉着的机制。

期刊:Genomics

影响因子:6.2


文章题目:De novo assembly transcriptome analysis reveals the preliminary molecular mechanism of pigmentation in juveniles of the hard clam Mercenaria mercenaria


发表期刊:Genomics  

技术手段:RNA-Seq+qPCR

派森诺生物与中国科学院海洋研究所携手合作,于近期在《Genomics》上发表了无参转录组分析揭示幼体硬壳蛤(Mercenaria mercenaria)色素沉着的初步分子机制相关研究成果。


研究背景/

颜色是个体重要的表型特征,并且与伪装、免疫、体温调节等生物学功能相关。软体动物具有丰富的外壳颜色,但是,人们对贝壳色素沉着的了解仍然很有限。已有学者利用杂交进行的遗传分析表明,贝壳的颜色可以由基因调控。研究表明,钙信号转导、黑色素合成、卟啉和叶绿素代谢等相关基因参与生物外壳的色素沉着与调控。这些研究大多数以双壳类动物的外被膜作为研究材料,但是,双壳类动物幼体时期是开始色素沉着的重要时期却往往被忽视。

硬壳蛤(Mercenaria mercenaria)是一种有着重要商业价值的双壳类动物,其养殖品种具有丰富的壳色变异。本研究根据色素沉着情况将幼体硬壳蛤分为三组,采用RNA-Seq技术进行分析,从中鉴定出参与色素沉着的候选基因和相关代谢通路。


研究方法 /

样本:无色素沉着幼体硬壳蛤(NP)、白色幼体硬壳蛤(W)、红色幼体硬壳蛤(OP)

实验方法:转录组测序

测序平台:Illumina NovaSeq

技术路线图见下:



研究结果 /

1.转录组测序结果,注释以及差异表达基因(DEGs)分析

借助二代转录组测序技术,对NP、W、OP三组幼体硬壳蛤,每组三个重复,一共9个样品进行转录组测序。通过转录本拼接共得到149234个unigenes,N50为1567 bp,对unigene功能注释鉴定出很多与信号转导相关的基因。

为了评估在不同分组的基因表达量变化,对三组幼体硬壳蛤的转录表达情况进行两两比较。在OP vs NP比较组中检测到2133个上调基因,1708个下调基因。W vs NP比较组中有1824个上调基因和1628个下调基因。OP vs W比较组中发现179个上调基因和71个下调基因。

为了更好地了解DEGs的功能,作者进行了KEGG富集分析。结果显示,OP vs NP比较组富集了282条途径,其中有51条途径显示显著富集(表1),富集最显著的前20个代谢通路如图1A所示。W vs NP和OP vs W比较组分别富集了266和122条途径,且分别有45和15条途径显示显著富集(表2,表3),富集最显著的前20个代谢通路如图1B和图1C所示。DEGs主要在黑色素瘤、卟啉和叶绿素代谢以及ABC转运通路中富集。


表1 OP vs NP显著富集途径条目


图1A OP vs NP  KEGG 富集分析


表2 W vs NP显著富集途径条目

图1B W vs NP  KEGG 富集分析


表3  OP vs W显著富集途径条目

 图1C  OP vs W  KEGG 富集分析


2.与色素沉着相关的候选基因鉴定

作者研究发现,红色硬壳蛤的黑色素和胡萝卜素浓度明显高于白色硬壳蛤。色素前体分子可以通过ABC转运蛋白运输到色素细胞,并且四吡咯是软体动物中另一种主要的色素。因此,作者挑选了黑色素瘤/黑色素生成、类胡萝卜素相关代谢通路、ABC转运体以及卟啉和叶绿素代谢的DEGs进行聚类热图分析。聚类结果如下:

A.在黑色素瘤/黑色素生成代谢通路途径中,W组首先与OP组聚集,然后与NP组聚集。在该通路中发现了小眼畸形相关转录因子(MITF)、酪氨酸酶(TYR)和钙离子结合相关基因。TYR是合成黑色素所必需的,MITF对TYR具有调控作用。TYR在OP和W组中高表达,MITF在W组中表达相对下调(图2a)。

B.在ABC转运体代谢通路中,W组先与OP组聚类,然后与NP组聚类。ABC转运体可能通过转运色素前体来介导色素沉着。相比于W和NP组,ABCA、ABCC和ABCG在OP组中高表达(图2b)。

C.类胡萝卜的摄取、运输和分解在类胡萝卜色素沉着中起着至关重要的作用。在类胡萝卜素相关代谢通路中清道夫受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白和载脂蛋白等的Unigenes差异表达(图2c)。

D.与W组相比,OP组中卟啉和叶绿素代谢显著富集,表明该途径在硬壳蛤中红色素的形成中发挥了作用(图2d)。


图2 显示关注的KEGG通路中基因表达水平的聚类热图: A) 黑色素瘤/黑色素生成; B) ABC转运体; C) 类胡萝卜素相关代谢通路; D)卟啉和叶绿素代谢。


3.关键基因qRT-PCR验证

为了验证RNA-Seq数据的可靠性,作者从DEGs中选取10个 unigenes,使用qRT-PCR进行验证。如图3所示,转录组数据与qRT-PCR结果一致,在OP组中ABCA1, ABCA3, ABCC1和 ABCG5-like的表达量最高。

图3 10个基因的qRT-PCR验证


总结 /

色素是贝壳颜色产生的主要原因。在本研究中,作者对非色素沉着、白色和红色的硬壳蛤进行了RNA-Seq分析,以探讨幼体硬壳蛤色素沉着的机制。DEGs有黑色素瘤/黑色素形成、ABC转运体、类胡萝卜素代谢相关途径、卟啉和叶绿素代谢,可能参与色素的形成和调控。这些发现表明黑色素和类胡萝卜素可能是硬蛤壳的主要色素。值得注意的是,与脂质转运、ABC转运蛋白、卟啉和叶绿素代谢相关的基因,可能是这些硬壳蛤壳呈红色的原因。


本研究的测序和数据分析工作由上海派森诺生物科技有限公司完成。




本文由作者自行上传,并且作者对本文图文涉及知识产权负全部责任。如有侵权请及时联系(邮箱:nanxingjun@hmkx.cn
关键词:
黑色素瘤,幼体,转录,基因,富集,测序,途径

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