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科研 | The ISME Journal:氯消毒通过ROS介导的氧化应激促进游离性抗性基因转移

2021-06-17   微生态
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涉及抗菌素耐药性的细菌感染正在全球范围内威胁着公众健康。



编译:微科盟HushKuo,编辑:微科盟木木夕、江舜尧。

微科盟原创微文,欢迎转发转载。

导读  

涉及抗菌素耐药性的细菌感染正在全球范围内威胁着公众健康。基于氯的水消毒过程可以使抗药性细菌失活。但与此同时,这些过程可能导致抗生素抗性基因以游离DNA的形式释放到水中,因此增加了游离性抗生素抗性传播的风险。目前,关于残留氯影响细胞外抗生素抗性基因(ARGs)转化的贡献知之甚少。这项研究调查了氯胺和游离氯是否能促进ARGs的转化以及如何发生。研究发现,实际相关浓度的氯胺和游离氯均显著促进了Acinetobacter baylyi ADP1为受体的质粒编码ARGs的传播,其程度增加了高达10倍。研究揭示了提高转化的基础机制。消毒剂暴露诱导了一系列细胞反应,包括活性氧(ROS)水平升高、细菌膜损伤、ROS介导的DNA损伤和应激反应增加等;这些作用最终导致ARGs转化的增强。将消毒剂预处理的A. baylyi暴露于游离质粒时,可观察这种转化的增强;相反,用消毒剂预处理游离质粒后,由于质粒完整性的破坏,ARGs的转化减弱了。这些发现为关于消毒剂影响ARGs水平转移的作用提供了重要见解,对于水系统中抗生素耐药性的管理至关重要。


 

论文ID


 

名:Chlorine disinfection facilitates natural transformation through ROS-mediated oxidative stress

氯消毒通过ROS介导的氧化应激促进游离性抗性基因转移

期刊The ISME Journal

IF:9.180

发表时间:2021.05.03

通讯作者:郭建华

通讯作者单位:澳大利亚昆士兰大学水管理高等研究中心


实验设计


图1 实验设计与方法示意图。建立了三个转换模型系统。通过评估氧化应激和细胞膜通透性、RNA测序和蛋白质组测序,揭示系统1   中的潜在机制。  

 

结果


1 消毒剂促进转化频率
 

2 不同浓度消毒剂诱导的ARGs转化的表型结果。(a)消毒剂对模拟饮用水中ARGs转化频率的影响。(b)污水处理厂模拟废水中消毒剂对ARGs转化频率的影响。(c)模拟饮用水和(d)模拟WWTP出水中转化子提取的pHW1266质粒的电泳凝胶(转化系统分别由0、0.5、2、4、10、20、30 mg/L氯胺或游离氯处理)。(e)模拟饮用水和(f)模拟WWTP出水中通过从转化子中提取的PCR短扩增子(SA)和长扩增子(LA)测定tetAblaTEM-1的电泳凝胶(分别用0和10 mg/L氯胺或游离氯处理的转化系统)。用消毒剂分别对A. baylyi菌株进行5 min(g)和15 min(h)的预处理,导致转化频率增加。各个氯胺或游离氯与对照之间的显著差异显示为*( padj < 0.05) 和*(padj < 0.01)。
 
为了检查基于氯的消毒剂对eARGs扩散的影响,我们通过建立三个系统研究了氯胺或游离氯暴露下pWH1266质粒的转化频率(图1)。我们使用的氯胺和游离氯的暴露浓度与饮用水(0-4 mg/L)和污水处理厂的二次污水(1-20 mg/L)中的消毒剂量有关。此外,在这项研究中在极高的浓度(30 mg/L)下通过MIC分析测试了 A.baylyi 的高耐氯性。eARGs的转化效率由图1所示的实验设计和方法进行评估。首先,针对初始质粒浓度和转化时间优化了转化系统的条件。 eARGs转化的频率在6小时后约为1.5×10-7,并且在质粒浓度大于0.8 ng/μL时达到最大值。因此,在这项研究中,我们将0.8 ng/μL用作初始质粒浓度,将6 h用作转化时间。
氯胺和游离氯均可显著增加系统1中转化子的数量和质粒编码的eARG的转化频率(图2a和b)。具体来说,当氯胺或游离氯的剂量分别大于10和0.5 mg/L时,在模拟饮用水的条件下eARGs的转化频率显著增加(图2a,padj = 8.8×10−4–4.6×10−2)。另一方面,在模拟污水处理厂废水的条件下,氯胺或游离氯的浓度必须分别大于4和2 mg/L,才能使eARG的转化频率显著增加(图2b,padj = 2.6×10-6–4.6×10−2)。此外,随着游离氯暴露增加,eARGs的转化频率呈现出剂量依赖性的趋势。在模拟饮用水的条件下,添加20 mg/L氯胺后的最大转化频率(每个受体细胞2.6×10-6)比对照大10倍以上(图2a,padj = 1.4×10-3)。但是,当氯胺浓度从20 mg/L进一步提高到30 mg/L时,转化频率降低(图2a和b)。另外,在转化实验中测量了氯残留物的浓度,表明由于消毒反应,氯胺和游离氯随时间消散。例如,当分别施加30 mg/L的氯胺或游离氯的初始水平后,处理6小时后氯残留物的浓度降低到2.7或1.4 mg/L(图S5)。
MIC测试、质粒提取、PCR和凝胶电泳均可验证pWH1266质粒已被系统A. baylyi摄取。通过凝胶电泳观察到的透明条带大小约为来自供体的质粒的片段(图2c和d),可证实转化体中存在pWH1266质粒。其次,在短和长扩增子的PCR中,随机挑选的转化体中tetA基因和blaTEM-1基因的存在均呈阳性。所有的tetA基因和blaTEM-1基因均显示出清晰的条带,其大小与pWH1266质粒中的条带大小大致相同(图2e和f)。这也证实了转化子包含了eARG。此外,转化的MIC同样证实了对于Amp和Tet两种抗生素抗性的eARG的获得。所有转化体均显示出对两种抗生素的抗性增强,表明摄取pWH1266质粒后Amp和Tet抗性基因的表达。相比之下,野生型A. baylyi对抗生素Amp和Tet敏感。 我们通过系统2实验进一步研究了如果先用残留的消毒剂预处理野生型Baylyi菌株,则eARGs的转化是否会增加。
同样,eARGs的转化频率随着消毒剂量的增加而增加(图2g和h)。例如,用20 mg/L氯胺处理A. baylyi菌株5分钟后,转化频率约是对照组的4.9倍(图2g,padj = 1.2×10−4–2.4×10−2)。当预处理时间增加到15分钟时,转化频率显着提高了5.6倍(图2g, padj = 7.6×10−5–1.0×10−2)。用游离氯处理A. baylyi后,当eARGs的浓度大于0.5 mg/L时,其转化频率也显著增加(图2h,padj = 4.1×10−3–5.5×10−2)。
总体而言,这些结果表明,消毒剂可以显著增加系统1和2中eARG的转化子数量和转化频率。产生的转化子确实通过摄取pWH1266质粒获得了对Amp和Tet的抗性。应该注意的是,如果在转化期间发生垂直基因转移(VGT),则转化频率可能会被高估。但是,由于在6小时内受体的总数没有增加,因此可以排除这种高估的可能性,这表明增加的频率是通过转换而不是VGT来促进的。
 
2 消毒剂诱导ROS生成增加并刺激应激反应
 

图3 消毒剂对受体细菌菌株中ROS生成和DNA整合/修复的影响。(a)消毒剂对模拟饮用水中ROS生成的影响。(b)WWTP模拟出水中消毒剂对ROS生成的影响。(c)ROS清除剂对消毒剂诱导的ROS生成的影响。(d)添加ROS清除剂的转化效率。(e)厌氧条件下转化效率的倍数变化。(f)与ROS产生和DNA整合/修复有关的核心基因表达的倍数变化。(g)与ROS产生有关的核心蛋白丰度的倍数变化。(a)-(e)中氯胺或游离氯与对照之间的显著差异显示为*(padj < 0.05) and **(padj < 0.01)。
 
可以看到,由于氧化应激,亚抑制浓度的抗生素可以增加ARGs的转化。 在这里,我们假设暴露两种基于氯的消毒剂会导致ROS的产生增加,从而促进了eARGs的转化频率。实际上,在模拟饮用水的实验(图3a, padj = 7.7×10−6–4.3×10−2)和模拟WWTP出水实验(图3b,padj = 4.0×10-6–9.8×10-3)中,受体细胞在氯胺或游离氯暴露下的细胞内ROS生成显着增加(从0.5增加到30 mg/L)。实验于30 mg / L的游离氯暴露实验期间检测到了最大的ROS产生。与无暴露对照组相比,ROS水平增加了130倍以上。另外,在暴露于消毒剂的过程中,与模拟饮用水的实验相比,模仿WWTP出水实验中ROS的产量更高。例如,与模拟饮用水中检测到的水平相比模仿WWTP出水实验中暴露于4 mg/L氯胺下的ROS水平比模拟饮用水中的水平升高了4.7倍(padj = 1.2×10-3)。这可能是由于添加了有机物(50 mg COD/L)引起的细菌代谢活性增加,导致了更高的ROS产生。
为了进一步验证增加的ROS水平对提高转化频率的作用,我们进行了ROS清除试验。硫脲是典型的ROS清除剂,在转化系统中加入400μM硫脲发现,消毒剂暴露期间的ROS产生水平显着降低至无消毒剂对照组的ROS水平(图3c, padj = 7.7×10−6–7.9×10−4)。相应地,转化频率也显著降低(padj = 6.1×10-6–7.3×10-3)至对照组水平(图3d)。
为了进一步阐述ROS对增强转化的贡献,在不会产生ROS严格的厌氧条件下进行了实验。不出所料,在氯胺或游离氯暴露后,与有氧条件下检测的细菌ROS水平相比细菌ROS水平显著下降(图3b,padj = 4.1×10−6–1.5×10−4)至非消毒控制水平。此外,厌氧转化实验中,氯胺或游离氯暴露(图3e, padj = 0.0~0.33)时未检测到转化频率显著提高。此外,厌氧条件下的转化频率相比于有氧条件下测量的转化频率(padj = 2.3×10−4–0.02)显著下降。因此,厌氧实验可以支持这一假设,即 eARG 的增强转化是由于在氯胺或游离氯消毒剂暴露期间细菌 ROS 生成增加。
关于氧化条件,生成自由基可由DMPO的 EPR自旋捕获进行表征。在有氧条件下,氯胺和游离氯(30 mg/L)都可能产生强度很高的ClO·自由基。厌氧条件下,DMPO捕获的自由基的强度下降。此外,当 A.baylyi 厌氧地暴露在这些消毒剂下时,产生的自由基是不同的。对于游离氯,仍然是以ClO·为主,而在氯胺的暴露下,则以HO·为主。这可能归因于这两种氯基消毒剂对A. baylyi的不同作用模式。
我们进一步采用转录分析,以提供证明受体菌株暴露于10 mg/L氯基消毒剂触发氧化应激的分子证据(图3f)。基于全基因组RNA测序比较了氯胺或游离氯处理组与对照组之间转录的氧化应激基因差异。氧化应激相关基因的表达增加表明受体细菌对消毒剂暴露迅速做出反应。实际上,暴露于消毒剂2小时后,超氧化物歧化酶(sodBsodM)的转录水平增加了。例如,在受体细菌中观察到sodM基因增加了1.3倍和2.4倍以分别响应氯胺或游离氯暴露(p <0.05)。编码烷基氢过氧化物还原酶的ahpC(在氯胺下为4.9倍以上,p <0.05)和ahpF(在氯胺下为4.3倍以上,p <0.05)的表达水平在暴露消毒剂后上调。另外,编码肌氨酸氧化酶的soxD在氯胺或游离氯的应激下分别上调了4.7倍和3.8倍以上(p <0.05)。这些抗氧化酶的过表达可能是使受体自身免受ROS水平升高引起损害的保护。尤其地,在ROS反应中起关键作用的 A.baylyi 中的soxR基因在氯胺应激下被上调了2.8倍以上。此外,与DNA整合和修复有关的核心基因的表达在氯胺或游离氯的暴露下显示出增加的转录水平(图3f,表S5)。例如,当A. baylyi暴露于氯胺或游离氯后,gyrBrec基因家族(recArecBrecDrecOrecR)以及ruvB(与DNA整合和修复有关的基因)的表达水平升高。
蛋白质测序进一步用于检测细菌对与消毒剂暴露有关的氧化应激的反应。 与ROS水平升高有关的SodA、KatA、Ahp和HimD等蛋白质在接触氯基消毒剂时增加(图3g)。例如,在受体细菌中,观察到了HimD蛋白增加了5.3倍和3.0倍(p <0.01)分别响应氯胺或游离氯暴露。尤其地,抗ROS侵袭的抗氧化酶SodA和Ahp家族蛋白(AhpC和AphF)上调(表S6)。
 
3 消毒剂暴露可增加细胞膜通透性
 

图4 消毒剂对受体 A. baylyi 细胞膜的影响。(a)消毒剂对模拟饮用水中细胞膜通透性的影响。(b)消毒剂对WWTP模拟出水中细胞膜通透性的影响。未经处理的对照组(c)和用10 mg / L的游离氯(d)或氯胺(e)处理的细胞中超细切片中A. baylyi的TEM图像(比例尺为1μm)。(f)热图显示了与A.baylyi中细胞膜相关的蛋白质的丰度增加。(g)热图显示了与A.baylyi中的细胞膜相关的上调基因。(a)和(b)中氯胺或游离氯与对照之间的显著差异显示为*(padj < 0.05) and **(padj< 0.01)。
 
膜通透性是摄取外源或细胞外DNA的障碍之一。据认为,由细胞表面上的孔形成引起的膜通透性增加可以提高转化频率。因此,研究评估了受体细菌的细胞膜通透性,以验证在暴露于消毒剂的条件下转化的增强与膜通透性的增加是否相关。实际结果显示,在氯胺或游离氯作用下,受体菌株显示细胞膜通透性显著增加(图4a和b, padj = 7.2×10−6–4.9×10−2)。例如,在模拟饮用水的实验中,在暴露于30 mg/L氯胺的过程中,细胞膜通透性与对照组相比增加了41.8倍(图4a, padj = 1.1×10-5)。在模拟WWTP出水实验中,同样观察到了膜渗透性的显著提高(图4b, padj = 4.3×10−5–4.9×10−2)。但是,在饮用水和WWTP出水实验之间,膜的渗透性变化略有不同。特别地,当游离氯浓度等于或大于4 mg/L时,WWTP模拟废水中受体的膜渗透率开始显著提高(图4b,padj = 2.5×10-2)。相反地,在模拟饮用水实验中,在较低的0.5 mg/L氯含量下,渗透率发生了显著变化。这种现象可能是由WWTP出水中添加的有机物(50 mg COD/L)对氯的消耗所致。此外,可以发现导致细胞膜通透性提高的氯的阈值(饮用水为0.5 mg/L以上,而WWTP出水为4 mg/L以上)远远低于氯胺(10 mg/L以上,尽管有水基质)。
另外,TEM用于检查在氯胺或游离氯暴露下受体菌株的细胞膜损伤。可以看出,在未经处理的对照中,细胞膜是不同的(图4c)。但是,当细胞暴露于10 mg/L的氯胺或游离氯中时,明显的细胞膜损伤明显(图4d和e)。
通过分析受体A. baylyi中的蛋白质和基因表达,进一步评估了由消毒剂引起的细胞膜损伤(表S7,S8)。暴露于消毒剂2小时后,膜蛋白的水平发生了变化(图4f)。例如,在氯胺或游离氯的暴露下,分别观察到了AdeA蛋白增加了2.5倍和2.0倍。特别地,在暴露于消毒剂的情况下,OprC和BamE蛋白更为丰富。这些蛋白质对于外膜通道很重要。相应的基因,如bamAbamE,在存在消毒剂的情况下也显示出表达的增加(图4g)。另外,大多数编码外膜蛋白的基因在暴露于消毒剂的情况下表达增加。例如,响应于10 mg/L的氯胺暴露,受体细菌中的主要外膜蛋白调节基因ompAompW均显着上调了1.4倍。这些外膜蛋白对于调节细胞膜通透性很重要。负责外排泵的基因,hca家族基因和acr也发生上调。此外,与膜蛋白有关的基因,如slyDfumCtolC,在消毒剂暴露期间也发生上调。因此,在系统1中暴露于消毒剂后,与细胞膜通透性和完整性有关的基因和蛋白质均发生上调。
 
4 用消毒剂处理裸质粒后的转化频率损失
 

图5 消毒剂预处理对pWH1266质粒转化的影响。用消毒剂预处理5分钟(a)和15分钟(b)的pWH1266质粒分别导致转化频率降低。(c)氯胺或游离氯处理15分钟前后裸质粒pWH1266 DNA的AFM图像。氯胺处理5分钟(d)和15分钟(e)时用qPCR扩增子测得的基因blaTEM-1tetA降解。游离氯处理5分钟(f)和15分钟(g)时用qPCR扩增子测得的基因blaTEM-1tetA降解。误差线表示与平均值的标准偏差(n≥3)。(a)和(b)中氯胺或游离氯与对照之间的显著差异显示为*(padj < 0.05) and **(padj < 0.01)。
 
为了测试受损的eARGs的转化性能是否会降低,我们建立了转化系统3(图1),其中pWH1266质粒先用氯胺或游离氯处理,然后再用于转化试验,消毒剂剂量高达10 mg/L。随后,我们测量了被A. baylyi捕获的eARG的能力。eARGs的转化频率随着消毒剂量的增加而降低(图5a和b)。例如,用10 mg/L游离氯处理pWH1266质粒5分钟后,转化频率比对照组低2.5倍(图5a, padj = 0.006)。另外,如果将预处理时间增加到15分钟,则在暴露10 mg/L消毒剂时未检测到转化体。在这种恶劣条件下,DNA可能会受到相当大的损害(图5b)。该结果与先前发现UV254消毒处理可能导致可转化性丧失的研究一致。
为了深入了解潜在的机制,使用AFM和qPCR来探讨裸露质粒用消毒剂处理后转化频率降低的原因。我们在氯胺或游离氯处理之前和之后检测了质粒的表面形貌。在未处理的对照中,环状质粒的形貌明显(图5c)。但是,暴露于4 mg/L的氯胺或游离氯后,质粒被破坏并变成线性。当氯胺或游离氯的剂量增加到10 mg/L时,仅能观察到短的DNA片段,而非完整的质粒(图5c)。这些AFM结果表明,由氯胺或游离氯诱导的质粒片段化导致转化频率降低。
此外,我们对短扩增子(SA,约200 bps)和长扩增子(LA,800-1200 bps)均采用qPCR来评估消毒处理前后blaTEM-1tetA基因的损伤程度。正如预期的那样,随着氯胺或游离氯剂量的增加,短和长eARGs扩增子的丰度均降低(图5d-g)。在30 mg/L的氯胺预处理剂量下5分钟,tetA LA扩增子丰度降低了~0.49 log10个单位。此外,用氯胺预处理15 min时blaTEM-1tetA基因的丢失率比预处理5 min时更高(图5d和e)。例如,在30 mg/L的氯胺剂量下,blaTEM-1 SA基因的丰度在处理5分钟后下降了~0.26 log10个单位,而在15分钟处理后下降了~0.77 log10个单位(图5d和e)。有趣的是,对于两个eARG,长基因扩增子的丢失率大于短基因扩增子的丢失率(图5d–g)。例如,在5分钟处理时间的30 mg/L游离氯剂量下,tetA SA降低了~0.17 log10个单位,而tetA LA降低了~0.39 log10个单位。这可能是由于在消毒剂处理后,与基因的长模板相比,完整的ARG短模板大量存在。最终,这些结果证实了消毒剂引起的eARGs的破坏和损失导致系统3中eARGs转化频率的降低。
 

讨论

 

图6 氯胺或游离氯调节pWH1266质粒上携带的eARGs转化效率的可能机制。系统1的机制:在模拟饮用水和模拟WWTP废水中,分别将含有受体细菌和质粒溶液的转化系统暴露于不同浓度的消毒剂中。(a)增加细胞内ROS的产生;(b)刺激的DNA损伤/修复反应;(c)刺激应激反应;(d)损伤细胞膜。系统3的机制:纯化的质粒溶液用消毒剂预处理。然后将处理过的eARG进行模拟WWTP出水的转化分析。消毒剂引起的eARGs的破坏和损失导致eARGs转化频率的降低。
 
在水或废水处理的后续步骤中,广泛使用诸如氯化等消毒过程来灭活病原体。然而,这些基于氯的消毒方法不能完全灭活处理过的水或废水中的所有ARB。即使消毒过程可以使ARB完全灭活,eARGs也会同时释放到水中,从而成为通过转化传播ARGs的来源。最近,一些研究证明消毒过程有可能增强结合转移或ARGs的转化。但是,尚无研究全面评估氯基消毒剂在通过自然转化传播eARG方面的作用。而且,关于消毒剂如何以及为什么会通过自然转化促进或减少ARGs的扩散,目前还不清楚。在这里,我们建立了三个转化系统,以研究这些基于氯的消毒剂是否会在模拟饮用水和WWTP出水的条件下提高eARG的转化效率。结果显示,在实验系统1和2中,在氯胺或游离氯的暴露下,质粒编码的ARGs的转化频率显着增加。这类似于在抗生素暴露期间检测到的效果,即抗生素增加细菌ROS的产生或引起SOS响应,从而促进ARG的水平转移。在这项研究中,我们使用了多种方法(包括MIC,质粒提取,PCR和凝胶电泳)来验证pWH1266质粒已被A. baylyi接收,并且这种接收对受体产生了针对Amp和Tet的抗性。研究表面,在实际相关浓度下,消毒剂显着提高了eARGs的转化频率。值得注意的是,受体 A.baylyi 被检测到对消毒剂具有很强的抵抗力。因此,促进转化的消毒剂浓度的阈值可能会根据各种受体菌株的类型或特性而有所不同。
我们的研究通过各种分子和可视化方法来确定氯基消毒剂如何彻底促进eARGs转化的潜在机制。这些方法包括测量ROS生成和细胞膜通透性,采用ROS清除剂测试,在有氧和无氧条件下进行转化测定,通过TEM和AFM表征细胞和质粒的形态,以及全基因组RNA测序和蛋白质组学分析。提出的eARG的消毒剂增强转化基本机制总结于图6中。我们推测消毒剂暴露引起一系列细胞反应,包括增加ROS的产生、增强细胞膜通透性、增加应激反应以及增强DNA损伤和修复活性。
在这些响应中,A. baylyi中ROS产量的增加是消毒导致的eARGs加速转化的主要因素。显然地,添加ROS清除剂后ROS产生和转化频率均显著降低,这与我们在厌氧条件下消毒剂暴露的观察结果一致:由于缺乏增强的ROS生成,在暴露于氯胺或游离氯的过程中未检测到转化频率的显著提高(图3b和e)。事实上,在急性暴露于消毒剂2小时后,氧化应激的转录水平(sodBsodM)增加了。在暴露于10 mg/L消毒剂的情况下,与应激相关的基因(nirDglsA)和与运动能力相关的基因(pilIRTU)的转录水平上调(表S9)。除了与氧化应激相关的基因外,DNA整合/修复基因(如gyrBrec基因家族和ruvB)也表现出增加的表达水平。氧化反应的触发可能是由DNA损伤/修复诱导。总的来说,综合有关细胞内ROS水平、ROS清除、厌氧条件下的转化测定、RNA测序和蛋白质分析的证据,可表明细胞胞内ROS的生成在物理上驱动氯和氯胺暴露下转化频率的增加。应当指出的是,该研究没有证实是仅为细胞内ROS或细胞内和细胞外ROS共同在转化频率增加中起作用,这值得进一步研究。此外,在无氧条件下,将A. baylyi暴露于氯胺或游离氯中时,与非消毒剂对照相比,未见活/死细胞百分率有显着变化(图S8)。相反地,在有氧条件下,高浓度的氯胺或游离氯(> 20 mg/L)会导致细胞大量死亡(padj = 2.3×10−4–4.6×10−2)。这表明消毒效果主要在于由ROS水平升高所造成的损害。因此,ROS的淬灭可以消除氯胺和游离氯的抗菌作用。以前的研究表明,微生物产生ROS会增强抗菌效果,基于氯的消毒剂会诱导ROS依赖性损伤机制。然而,需要承认的是,ROS的变化是由HGT升高的导致还是由细菌引起的抗菌素淬灭仍有争议。需要进一步的研究,提供更多证据验证转化的增强是否是由于消毒剂暴露下而ROS水平升高直接引起的。
通过细胞表面孔的形成增加的细胞膜通透性可以增强HGT。本研究发现,在暴露于氯胺或游离氯的条件下,细胞膜通透性显著增加(图4a和b,padj = 7.2×10−6–4.9×10−2)。此外,当细菌暴露于10 mg/L的氯胺或游离氯中时,通过TEM观察到明显的细胞膜损伤(图4c)。基于RNA测序和蛋白质组学分析,我们发现消毒剂的暴露确实影响了与A. baylyi细胞膜完整性和能量产生相关的蛋白质丰度和基因表达要素。此外,从系统2的观察中可以看出细胞透化与转化频率增加之间的关系:在该系统中,用消毒剂对A. baylyi进行预处理,然后将受损的A. baylyi与完整质粒混合。尽管去除残留的消毒剂后细胞内ROS的产生显著减少(图S9),但仍保留了增加的细胞膜通透性。考虑到在系统2中,用消毒剂处理过的A. baylyi具有更高的eARG吸收能力,这些结果表明了可渗透膜在增加eARG的转化中起着作用。
另外,我们进一步揭示了ROS产生与细胞通透性之间的关系。在厌氧条件下的膜通透性与有氧条件下相比明显降低。例如,在厌氧条件下最高倍数变化仅为2.8倍(如图S10所示),而有氧条件下最高倍数变化可能达到40倍(图4a和b)。这些结果表明,ROS的产生与细胞膜通透性之间存在紧密的联系。 但是,还应注意,与非消毒剂对照相比,在厌氧地暴露于游离氯的情况下,膜的渗透性显着增强(图S10)。如先前的研究报道,这可能与消毒剂本身也可能对细胞膜产生直接作用有关。 与我们在细胞消毒处理过程中观察到的结果相反,对裸质粒(即系统3)进行消毒剂预处理,转化频率随氯胺或游离氯剂量的增加而降低(图6)。

此外,如果延长预处理时间,裸DNA会严重受损,从而导致转化频率的显著损失。通过采用AFM和qPCR方法,我们发现消毒剂暴露使质粒断裂,并且质粒携带的blaTEM-1tetA基因的丰度降低。这些结果证实,eARGs转化频率的降低与消毒剂诱导的质粒片段化有关(图6)。

在这项研究中使用的两种基于氯的消毒剂可能表现出不同的作用方式。例如,氯会形成氢氯酸和次氯酸以及氧自由基,而氯胺会分解为氨和次氯酸或盐酸。先前的研究证明,半稳定的氯胺甚至可以通过HOCl与DNA、RNA和多核苷酸的反应生成。在氯胺由金属离子催化的过程分解后,会生成以氮为中心的自由基。在这项研究中,我们发现在这两种消毒剂的暴露下氧基自由基的产生。然而,我们没有检测以氮为中心的自由基的存在,这些自由基或许在体系中已经生成。值得注意的是,尽管游离氯和氯胺是不同的消毒剂,但它们在影响eARGs转化、细菌ROS产生和膜的通透性方面表现出相似的模式。游离氯和氯胺均可促进由ROS氧化应激介导的转化。这些消毒剂作用的主要区别在于,当A. baylyi作为受体时,导致转化效率提高的游离氯阈值(高于0.5 mg/L)低于氯胺的阈值(高于4 mg/L)。进一步确定水或废水处理系统中促进抗生素耐药性扩散的氯和氯胺的具体阈值有利于指导优化消毒操作,具有重要意义。
消毒是防止水生的病原体传播或产生耐药性的重要过程。在这项研究中,我们开发了三种转化系统以研究实际相关的消毒剂量是否可以促进eARGs的转化。我们发现,基于氯的消毒剂确实促进了非ARB对eARG的转化。尽管系统3中的消毒剂可能会损坏eARG,但eARG的转化能力并未完全消除。在当前的消毒过程中,细菌(例如大肠杆菌)的浓度被用作评估水质和安全性的指标。我们的研究结果表明,基于病原体检测的单一标准可能无法全面评估水安全的微生物风险。诸如表征iARG和eARG存在的类似参数可以视为指标。 iARG和eARG的水平转移需要在实际消毒过程中进行检测。为了全面防止抗菌素耐药性的传播,当前的消毒工艺需要在消毒浓度、接触时间和消毒剂类型方面进行优化。另外,应该进一步开发不仅可以灭活病原体和ARB,而且可以破坏eARG和iARG的新型消毒技术,以最小化微生物风险。

此外,在2019年冠状病毒(COVID-19)流行期间,消毒剂的使用激增,废水的直接排放导致收纳水体中记录的消毒剂环境浓度持续增加。研究表明,消毒剂和消毒副产物会促进抗生素耐药性的传播。因此,当前流行期间的过度消毒可能会通过加速抗菌素耐药性的传播而造成环境和公共卫生风险,对此应进行深入的综合评估。

 

结论


这项研究表明,氯胺和游离氯均可提高质粒编码的ARGs的转化效率。消毒剂暴露引起一系列细胞反应,包括增加的细胞内ROS产生,刺激的应激反应和增加的细胞膜通透性。这些变化伴随着eARG的加速转型。其中,氧化反应似乎是最关键的因素,这是因为在厌氧条件下,通过添加ROS清除剂或缺少ROS可以逆转eARGs转化效率的提高。另外,在质粒暴露于氯胺或游离氯的过程中,这些质粒被片段化并且ARG丢失。消毒剂引起的eARGs的破坏和损失导致eARGs转化频率的降低。这些发现揭示了常用消毒剂在促进水处理系统中eARGs水平转移方面的作用。


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