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中科院 | Microbial Biotechnology：环境和宿主的种类决定了同域植食性哺乳动物肠道菌群的多样性

2021

06/15

微生态

A-

A+

导读

先前的研究报道了肠道菌群是一种生理结果；但是，影响其组成和功能的因素尚不清楚。在这项研究中，评估宿主和环境对肠道菌群组成的影响程度，研究人员对高原鼠兔和牦牛这两种同域植食哺乳动物的16S rDNA和宏基因组DNA进行了测序分析，并进一步比较了夏冬两季的序列。结果表明，鼠兔和牦牛在冬夏两个季节的菌群组成差异明显。研究人员发现疣微菌门和变形菌门在鼠兔肠道菌群中显著富集，古生菌和拟杆菌门在牦牛肠道菌群中显著富集。与能量高效获取相关的厚壁菌门和放线菌门在冬季显著富集。肠道菌群的多样性是由寄主与季节的交互作用决定的。宏基因组学分析表明，夏季牦牛甲烷代谢相关通路显著富集，鼠兔的某些致病途径更为丰富。鼠兔和牦牛在冬季均具有较高的脂质降解能力。冬季食物短缺时，鼠兔和牦牛共享OTU较多，导致肠道微生物组成和功能趋同。从冬季到夏季，鼠兔的网络模块数从1个增加到5个，而牦牛的网络模块数有所不同。此项研究表明，宿主是形成微生物群落的主导因素，基于不同宿主物种特性的季节性食性组成促进了肠道菌群的差异和趋同。

论文ID

原名：Environment and host species identity shape gut microbiota diversity in sympatric herbivorous mammals

译名：环境和宿主的种类决定了同域植食性哺乳动物肠道菌群的多样性

期刊：Microbial Biotechnology

IF：5.328

发表时间：2020.12.26

通讯作者：赵新全^1,2&贾善刚³&张堰铭^1,2

通讯作者单位：1中国科学院西北高原生物研究所高原生物适应与进化重点实验室；2青海省动物生态基因组学重点实验室；3中国农业大学草业科学与技术学院

实验设计

结果

1 高原鼠兔和牦牛肠道菌群组成

研究人员收集了124份高原鼠兔和牦牛的粪便，并在2015年-2018年对其进行16S rDNA测序并描述了牦牛和鼠兔的肠道菌群组成。研究人员共得到8487518条序列。研究人员评估了宿主和季节性对肠道微生物群的影响程度，发现高原鼠兔和牦牛在夏季和冬季均可根据weighted UniFrac和unweighted UniFrac距离进行区分（unweighted UniFrac metric, PERMANOVA，permutations = 999，季节：F_1,123= 6.3，R² = 0.03，P = 0.001；物种：F_1,123= 69.7，R² = 0.35，P = 0.001；季节×物种：F_1,123= 69.7，R² = 0.02，P = 0.003；weighted UniFrac metric，permutations = 999，PERMANOVA, 季节：F_1,123= 7.8，R² = 0.03 ， P = 0.001；物种：F_1,123= 69.7，R² = 0.41，P = 0.001；季节×物种：F_1,123= 91.54，R² = 0.03，P = 0.001）。研究人员发现根据加权和未加权距离，季节分别揭示了3.1%和3.4%的菌群差异，而基于加权和未加权距离，物种分别揭示了34.8%和41.3%的菌群差异（图1A和B）。研究人员测量了物种、季节和年际变化的影响，并使用平均配对Bray-Curtis差异显示结果，以探索塑造肠道菌群的因素。两个物种间的差异明显大于同物种间的差异（曼-惠特尼U检验，Z = 15.3，P < 0.0001）（图1C），同一季节的群落相似性高于不同季节的群落相似性（曼-惠特尼U检验，Z = 6.3，P < 0.0001）。

在门分类水平上，厚壁菌门、拟杆菌门、疣微菌门和变形菌门是高原鼠兔和牦牛的肠道菌群的优势菌门（图 1D）。厚壁菌门是丰度最高的菌门（图1D），在冬季的高原鼠兔肠道菌群组成显著高于夏季（曼-惠特尼U检验，Z = 4.7，FDR P < 0.0001），在牦牛的肠道菌群组成中冬季也显著的高于夏季（曼-惠特尼U检验，Z = -5.0，FDR P < 0.0001）。拟杆菌门是丰度第二高的菌门，在牦牛和高原鼠兔的肠道菌群组成中，1月和7月没有显著性的差异（高原鼠兔：曼-惠特尼U检验，Z = -0.2，FDR P = 0.851；牦牛：曼-惠特尼U检验，Z = -0.2，FDR P =0.811），但是在1月和7月，拟杆菌门丰富在牦牛的肠道菌群中显著高于高原鼠兔（7月：曼-惠特尼U检验，Z = -2.6，FDR P < 0. 01；1月：曼-惠特尼U检验，Z = -2.6，FDR P < 0. 05）。疣微菌门丰度在7月高原鼠兔的肠道菌群中显著高于1月（曼-惠特尼U检验，Z = -3.5，FDR P < 0. 001），并且在1月和7月的高原鼠兔的肠道菌群中显著高于牦牛（7月：曼-惠特尼U检验，Z = 4.7， FDR P < 0.0001；1月：曼-惠特尼U检验，Z = 2.8，FDR P = 0.05）。研究人员进一步在属分类水平上鉴定差异菌属，发现Akkermansia的相对丰度在7月的高原鼠兔的肠道菌群显著高于1月（曼 -惠特尼U检验，Z = -3.5，P < 0. 001）。

图1 高原鼠兔和牦牛不同季节肠道菌群的组成。（A）基于未加权UniFrac距离的PCoA分析（B）基于加权UniFrac距离的PCoA分析（C）宿主系统发育与季节的Bray–Curtis差异（D）在门分类水平上肠道菌群的相对丰度。

研究人员发现在不同宿主和季节间alpha多样性有显著性差异（图2A-D）。有趣的是， Chao1 和发现物种数量指数的差异在不同组间是相似的，而香农 -维纳和辛普森指数对季节和寄主物种特性的响应相似。研究人员不能确定不同多样性指数之间的相似响应是随机的或与它们自己的定义有关。因为Chao1和发现物种数指数是计算群落的丰度，香农-维纳和辛普森指数是计算菌群的均匀度。为了阐明宿主物种身份和季节如何影响微生物alpha多样性，研究人员进行了一般线性混合模型分析。结果表明，季节是解释Chao1和发现物种数量指数变化的主导变量（表1和2）。然而，复杂乘法效应以及加性效应是解释香农-维纳和辛普森指数变化的最重要变量（表1和2）。结果表明，季节和宿主种类对同一肠道微生物群落的不同alpha指数有不同的影响。

图2 所有样本中肠道微生物群的Alpha多样性。星号表示组间存在显著差异。（A）Chao 1指数（B）发现的物种数量指数（C）香农-维纳指数（D）辛普森指数。

表1 采用线性混合效应模型分析了宿主(高原鼠兔/牦牛)和季节(7月/ 1月)对肠道菌群多样性的影响。

包括Chao1指数、香农-维纳指数、发现物种数指数和辛普森指数（根据修正后的Akaike信息准则权重对所选模型进行排序（Ꞷ_iAICc））。Ꞷ_iAICc表示在一组给定的模型中，模型i是观测数据中相对可能的最优模型。Δ_iAICc不同于模型i中的AICc，这个模型有最低的AICc值（最优模型）。

表2 基于最小模型（基于AIC选择）的参数估计。

研究了青藏高原124个样本中宿主和季节对群落结构的影响，包括Chao1指数、香农-维纳指数、发现物种数指数和辛普森指数（该模型是一个混合效应模型，因变量由宿主（高原鼠兔和牦牛）、季节（7月和1月）及其相互作用来解释）。

加权UniFrac距离反映了肠道微生物群落在系统发育树重叠方面的相似性，表明1月两个物种之间的微生物群落明显比7月更相似（曼-惠特尼U检验，Z = 5.5，P < 0. 0001）。高原鼠兔肠道菌群在1月和7月间的距离明显大于牦牛（曼-惠特尼U检验，Z = 6.4，P < 0. 0001）（图3A-C）。与加权UniFrac距离结果一致，高原鼠兔的肠道菌群在1月独有的OTU（985，6.79%）少于7月份（2812，21.28%）（图3D和E）。

图3 肠道菌群对季节的响应。（A）在1月，基于加权UniFrac距离的PCoA分析(冬季)（B）在7月，基于加权UniFrac距离的PCoA分析(夏季)（C）组间肠道菌群相似性比较（D）在7月，牦牛和高原鼠兔共享OTU数量（E）在1月，牦牛和高原鼠兔共享OTU数量。

LEfSe结果展示了高原鼠兔和牦牛有78显著差异的菌群（图4A, LDA score > 3, P < 0.05）。然而，季节性只产生了14个显著不同的菌群（图4B, LDA score > 3, P < 0.05）。疣微菌门、变形菌门和放线菌门在高原鼠兔肠道菌群中更丰富，古生菌和拟杆菌门在牦牛肠道菌群中更丰富（图4A）。疣微菌门和Corynebacteria（放线菌门）在7月显著富集，厚壁菌门在一月显著富集（图4B）。

图4 LEfSe 分析鉴定显著差异的菌群（LDAscore > 3, P < 0.05）（A）高原鼠兔和牦牛间的差异（B）1月和7月间的差异。

2 宿主和季节对肠道菌群功能的影响

使用宏基因组数据，通过Bray–Curtis差异性的PCoA分析和在KEGG orthology(KO)通路上基因富集的相对丰度检验用来检查宿主和季节之间肠道菌群功能的相似性。结果表明，高原鼠兔和牦牛的肠道微生物功能在冬夏两季均存在显著差异（图5A）（PERMANOVA，permutations = 999，Bray–Curtis metric：季节：F_1,8 = 3.6，R²= 0.019， P = 0.002；物种：F_1,8 = 5.3，R²= 0.280，P = 0.001；季节×物种，F_1,8 = 2.1，R²= 0.019，P = 0.068）。对于影响肠道菌群功能的程度，季节为19.1%，宿主为28.0%（图5A）。Bray–Curtis差异性展示了高原鼠兔和牦牛之间的距离在夏天显著高于的冬天（图5B）（曼-惠特尼U检验，Z = 3.6，P = 0. 0003）。这个结果展示了高原鼠兔的肠道菌群在冬季比夏季更接近牦牛。研究人员对KEGG通路进行Welch t-检验并且发现霍乱弧菌致病性循环（ko05111），变形虫病（ko05146）和脂多糖生物合成（ko00540）在高原鼠兔中显著高于牦牛。甲烷代谢（ko00680）在冬季的牦牛场道菌群中显著富集。在冬季，脂肪细胞激素信号通路（ko04920）和脂肪酸降解（ko00071）在高原鼠兔和牦牛中均显著上调。在冬季，脂肪细胞激素信号通路（ko04920）、脂肪酸降解（ko00071）、肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）和酮体的合成与降解在牦牛肠道菌群中显著高于高原鼠兔。

图5 基因鸟枪法宏基因组测序的功能。SP和SY分别代表7月的高原鼠兔和牦牛。WP和WY分别代表1月的高原鼠兔和牦牛。（A）基于KO代谢通路相对丰度的Bray–Curtis差异PCoA分析（B）KO代谢通路的Bray-Curtis差异分析发现1月的距离显著短于7月。KO, KEGG 直系同源基因。

3 系统发育分子生态网络分析

研究人员使用pMENA分析了微生物群落的网络，这是比较不同微生物类群（节点）之间物种相互作用（链接）的有力工具。在7月，高原鼠兔共分配了5个模块76个节点和642条链路，是4组模块中最多的（鼠兔：分别在七月和一月；牦牛：分别在七月和一月）。然而，在7月牦牛的46个节点和512条链路仅构成了一个模块。高原鼠兔和牦牛在1月份都只形成了一个模块。此外，高原鼠兔和牦牛在1月模块化的参数（fast_greedy）是相同的（0.310），在7月，高原鼠兔和牦牛的参数分别为0.750和0.380。因此，高原鼠兔与牦牛之间的网络模块化特性在1月的相似性明显高于7月。不仅仅是模块化的特性，高原鼠兔与牦牛的其他网络属性在1月的相似性高于7月，例如节点总数、平均路径距离（GD）、测量效率（E）、谐波测量距离（HD）、集中程度（CD）、网络中间中心度（CB）、压力中心集中（CS）、特征向量中心集中（CE）、密度（D）、传递性（Trans）、连通性（Con）和有效性。

结论

在之前的研究中，宿主物种是影响肠道菌群组成的重要因素，而在其他研究中，环境因素，如食性和季节，被发现为主导因素。然而，这些研究不能区分环境的影响和宿主的影响。许多研究集中在单一物种在不同环境或者多个物种在不同环境来阐明环境和宿主对肠道微生物群的各自影响。然而，上述研究是在一个季节内进行的。尽管他们采用了一个在不同环境中有多个物种的方案，但宿主对特定食性的偏好可能削弱了环境的影响，因为生活在不同环境中的动物可能通过相似的食性组成来寻找相似的食物。这将导致生活在不同环境中的物种的肠道菌群之间有更大的相似性，错误地归因于宿主物种的相似性，并掩盖了环境影响。然而，在野生动物中，季节性引起的觅食差异是普遍存在的。因此，评估季节性的环境影响可能比评估同一季节的不同环境更可信。因此，研究人员探讨了同域宿主和不同季节的影响。

近年来，一些研究通过对同域哺乳动物肠道菌群的多元分析和可靠的分析框架，研究了宿主食性和宿主物种在塑造肠道菌群多样性中的相对重要性。研究表明，哺乳动物肠道菌群的聚集受宿主遗传、食性和社会行为等多种因素的调控。研究人员使用2 × 2因子分析探讨了同域、不同宿主的肠道菌群在不同季节的变化。结果表明，牦牛和高原鼠兔在夏季和冬季均可通过未加权和加权的UniFrac距离进行区分，表明宿主物种是影响肠道菌群的主导因素（图1A和B）。但不同季节的细菌群落具有明显的季节性，高原鼠兔的微生物组成比牦牛更具有季节性（图1A和B）。此外，一些优势菌群在不同季节的牦牛和高原鼠兔的肠道菌群中有显著性差异，例如，厚壁菌门、拟杆菌门、疣微菌门、瘤胃菌科和Akkermansia。季节改变了植被的形态和营养结构，在7月的高度和覆盖度显著高于1月，7月的植被的天然蛋白质、天然脂肪脂肪和总糖含量显著高于1月。相反的是，1月的植被中天然纤维和多糖含量显著高于7月。结果提示，在7月的食物可及性和营养价值显著高于1月，纤维素等不消化物质可能在1月更为丰富。这些差异可能进一步影响宿主的肠道菌群，可能导致更多的纤维素降解细菌的富集。这一结果与之前的研究结果一致，在该结果中宿主物种和环境因素影响宿主的肠道菌群。

Youngblut研究发现，宿主物种和食性对肠道微生物多样性有不同的调控作用，表明与宿主物种或食性相关的微生物类群具有更强的神经系统发生信号。环境筛选和微生物与微生物之间的相互作用也因宿主的系统发育分支而不同。我们发现，宿主物种和季节均可调节肠道微生物菌群多样性，并发现它们调控多样性的不同方面。此结果与一项跨多个物种的研究结果相一致，在该研究中，每个因素调节多样性的不同方面，宿主物种与食性呈中度相关性。用Chao1指数和发现物种数指数来确定群落丰富度，而不是群落丰富度和均匀度，这两个指数对丰度小或者独特的菌群比较敏感。季节导致食物组成的变化，为不同微生物种类提供了不同的生态位。因此，在GLM分析中，季节可能对Chao1指数和发现物种数指数的丰富度产生更大的影响（表1和2）。然而香农-维纳指数和辛普森指数用于评价群落异质性，它们不仅取决于物种数量，还取决于丰度和均匀度。宿主种类和季节对香农-维纳指数和辛普森指数均有倍增效应。这些结果表明，宿主种类和季节不仅影响微生物种类的数量，而且影响微生物的丰度和均匀度。

宿主肠道微生物群落的形成因素存在着广泛的争论，因为肠道菌群是在动态的发展过程中，这使得获取肠道微生物群落的相关影响因素变得困难。肠道菌群依靠宿主的内部环境形成了一个复杂的生态系统，并与宿主积极互动。因此，它自动显示除了生态学家假设的宿主物种是塑造肠道菌群组成的主导因素。然而，这一假说往往无法解释当宿主物种共享食性或栖息地时肠道菌群的趋同，尽管宿主物种不在同一系统进化发育枝上。因此，这很难评估肠道微生物群落的影响因素。我们的研究结果显示了宿主对高原鼠兔和牦牛细菌群落的形成起主导作用，但群落结构在1月仍有趋同、7月有分化的趋势（图3A-C）。这种现象也在出现在OTUs的组成中；高原鼠兔和牦牛在1月份共享的OTU多于7月份，季节的影响倾向于克服宿主物种的影响（图3D和E）。高原鼠兔在夏季喜欢吃带有植物次生代谢产物的牧草（PSMs），牦牛喜欢吃禾本科和莎草科植物。食性生态位的差异可能导致肠道微生物群落组成和结构的差异。然而，当高原鼠兔和牦牛面临相似的恶劣环境，共享枯萎的地上植物时，两种动物的饮食变得更加缺乏和统一。这可能导致了它们肠道微生物菌群的组成和结构的趋同。

某些细菌对于宿主物种和季节的相应不同（图4A和B）。Akkermansia是一种重要的益生菌，能降解肠道黏膜蛋白，通过提高宿主的免疫力来抵抗有害物质的刺激。它也与纤细的身材和健康的身体相关。在7月，高原鼠兔的食性组成中富含PSMs的植物，例如，蒲公英、车前草、翻白草和无患子。因此，在7月，高丰度的Akkermansia可能通过提高宿主对有毒化合物的免疫和耐受能力来提高宿主对有毒化合物的适应性。产甲烷菌（古生菌）能通过减少H₂和CO₂的积累提高纤维素的消化率和能量利用率，从而导致发酵的中断。产甲烷菌（古生菌）在牦牛肠道菌群中富集有利于食物资源的利用（图4A）。此外，高丰度的厚壁菌门与有效的能量获取和纤维素降解密切相关（图4B）。宿主因素对肠道菌群的偏好，与宿主的特性相关，季节因素对细菌的偏好与食物组成有关。

生物体的功能通常取决于它们的结构，相似的结构产生相似的功能。野生动物肠道微生物的功能受到季节性的有效影响已被报道。在本研究中，高原鼠兔和牦牛肠道菌群的显著差异表明了肠道菌群的功能与宿主物种和特征密切相关（图5A和B）。然而，肠道菌群群落在7月出现了分化，在1月份呈现趋同（图5A和B），说明肠道菌群的功能受到宿主和季节的影响。在夏季，高原鼠兔的某些致病和诱导炎症反应通路比牦牛更丰富，如霍乱弧菌致病性循环（ko05111）、变形虫病（ko05146）和脂多糖生物合成（ko00540）。这可能与先前的研究发现相关，因密度制约和夏季患寄生虫病概率高导致夏季高原鼠兔死亡率高。这些结果也与高丰度的Akkermansia有关，这能提高宿主的免疫能力。在夏季，牦牛甲烷代谢显著富集（ko00680）。这可能增强了瘤胃发酵的持久性，并与瘤胃内产甲烷菌的较高丰度相对应。此外，黄酮类化合物广泛存在于新鲜植物中，在夏季黄酮类相关代谢途径（ko00941和 ko00944）在高原鼠兔与牦牛肠道菌群中差异显著，而在冬季差异不显著。这也提示季节性饮食特征可能会导致肠道微生物功能的差异。在冬季，脂肪细胞因子信号通路（ko04920）和脂肪酸降解（ko00071）在高原鼠兔和牦牛中均显著上调，这表明，当宿主面临同样的饮食短缺挑战时，肠道微生物群的功能发生了趋同。此外，能够加速脂肪降解的赖氨酸生物合成途径(ko00300)在高原鼠兔中的丰度高于牦牛。在冬季，脂肪细胞激素信号通路（ko04920）、脂肪酸降解（ko00071）和酮体的合成和降解途径在牦牛中丰度高于高原鼠兔。上述结果表明高原鼠兔和牦牛的适应策略存在显著差异。高原鼠兔的体重在全年保持相对稳定，在夏季积累褐色脂肪组织，在冬季通过非颤抖性产热而不是消耗白色脂肪减轻体重。与此相反的是，牦牛将食物中丰富的能量和营养转化为白色脂肪组织，在夏季表现出明显的增重，在冬季通过消耗白色脂肪组织来抵抗寒冷。因此，宿主之间的生活史特征和反应模式的差异主要导致了肠道微生物功能的差异和趋同。我们的研究结果与之前的研究结果一致，即肠道菌群的功能与宿主的生活方式和食性组成密切相关。总体而言，夏季微生物的功能随着食性生态位的消耗倾向于形成各自的特征，而这一机制在冬季趋同于有限的食性生态位。此外，这些调节机制有助于两种同域植食性哺乳动物的共存。高复杂性的网络往往意味着细菌之间存在广泛的协作互动。多种机制的存在可能导致网络复杂性的增加。细菌丰度随成员间的相互作用或对环境因素的响应而变化。先前的研究表明，食性组成可利用性是网络结构的重要驱动因素。此外，PSMs 显著增加了肠道菌群的多样性，增强了网络复杂性。高原鼠兔的网络复杂度高于牦牛，这可能与高原鼠兔对有毒植物的偏好摄食有关，例如，蒲公英、车前草、翻白草和无患子，因此高原鼠兔含有降解PSMs的肠道微生物。类似的结果也在布氏田鼠上出现；他们发展了更多样化的群落和复杂的网络来抵抗糙隐子草的毒性，因为更复杂的网络可能提供更灵活的代谢网络，允许适应多样化的饮食，从而提高宿主的适应性。在冬季，高原鼠兔和牦牛的饮食变得更加单一，这可能导致了这些动物所发现的细菌网络的简化和趋同。

总结

综上所述，我们的研究结果表明，宿主物种和环境共同影响植食性哺乳动物肠道菌群的组成和功能。但宿主物种和季节影响各不相同。哺乳动物的肠道微生物群似乎反映了它们的宿主物种，重叠或分离的饮食生态位可以推动哺乳动物肠道微生物群的组成和功能在不同宿主物种上的趋同或分歧。宿主和季节的影响并不是完全孤立的，因为它们在特定条件下往往表现出复杂而多样的相互作用。该研究对影响肠道微生物多样性的因素提供了深入的认识，对今后的研究具有一定的指导意义。然而，我们的研究对更深入的理解肠道微生物群决定因素方面仍然有限。因此，未来的研究应该探索肠道微生物如何对食性生态位变化做出反应，以及这种反应模式如何影响种群的动态。