复旦大学 | Sci Total Environ：大型饮用水源地的微生物多样性特征及环境因素的影响

导读   

尽管环境因素对水源微生物群落的影响至关重要，但很少有人对其进行评估。本文利用Illumina MiSeq测序技术研究了一个大型饮用水水库中细菌和真菌的微生物多样性与环境因子的季节性关系。本文对中国上海青草沙水库的41个细菌门和9个真菌门进行了分析。优势菌门为放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和蓝藻门（Cyanobacteria），最大相对丰度分别为46%、36.6%、16.1%和14.9%。春季和夏季以放线菌门为主。未分类真菌的最大相对丰度出现在夏季（98.8%），这一丰度高于子囊菌门和担子菌门（11.7%和8.2%）。主坐标分析（PCoA）结果表明，夏季和冬季细菌群落结构相似性较大；然而，真菌群落在春季和夏季表现出更大的相似性。2-甲基异莰醇（2-MIB）是一种由微生物产生的嗅觉化合物，在夏季检测到的浓度为8.97 ng/L，略低于嗅觉阈值（10 ng/L）。放线菌与未分类真菌与2-MIB（p＜0.05）呈正相关，证实放线菌和未分类真菌产生2-MIB。化学需氧量（COD）为1.48 ~ 1.94 mg/L，总氮（TN）和总磷（TP）的最大浓度分别为2.1 mg/L和0.5 mg/L。绿弯菌门与COD呈负相关（p＜0.05），与TP呈正相关（p＜0.01）。硝化螺旋菌门与COD呈负相关（p＜0.05），但与TN成正相关（p＜0.05）。在已分类的真菌中，Rozellomycota、担子菌门（p＜0.05），壶菌门（p＜0.01）与TP呈正相关。因此，优势菌的相对丰度受各种环境因素的影响;而真菌主要受TP的影响。

论文ID

原名：A unique bacterial and archaeal diversity make mangrovea green production system compared to rice in wetland ecology：A metagenomic approach

译名：大型饮用水源地的微生物多样性特征及环境因素的影响

期刊：Science of the Total Environment

IF：6.551

发表时间：2021.1.19

通讯作者：安东

通讯作者单位：复旦大学环境科学与工程系

实验设计

图1：中国上海Q水库和采样点的位置。

结果与讨论

1. 微生物多样性 

对测得的数千条16S序列进行注释。为了保证结果的准确性，将相似性为97%的16S序列作为一个操作分类单元，即单个OTU，之后进行物种注释和多样性计算。在Q水库中，细菌和真菌检测到的OTUs分别为3227和1524，所有样本的覆盖率均在98%以上。结果如表一所示，细菌测序的序列覆盖率能满足后续微生物分析的需要。一般来说，alpha多样性表示微生物群落的数量，包括4个指标，即Shannon指数和Simpson指数，他们主要表示物种多样性，Chao和ACE作为物种丰富度的主要指标。Shannon指数显示，夏季细菌多样性显著（Shannon值为4.513），秋季细菌多样性最低（Shannon值为4.050）。真菌微生物多样性秋季最高（Shannon值为3.786），夏季最低（Shannon值为3.086）。从ACE丰度来看，夏季细菌和真菌的相对丰度分别为2017.3和475.1，高于其他季节。秋季最低，分别为1265.2和430.7。细菌和真菌的季节特征表明微生物之间存在相互抑制。以往的研究表明，不同种类的细菌和真菌对环境因素的反应不同，这是为了保持动态平衡。 表1.细菌和真菌群落的相对丰度和多样性。

2. 微生物群落组成 

根据OTUs数量对细菌和真菌进行PCoA分析。PCoA是一种序列分析方法，其特点是对一系列特征值和特征向量进行分类，然后在坐标系中选择最重要的特征值。细菌和真菌的PCoA结果如图3所示。百分比代表样品组成差异的主轴解释值，即微生物群落对分离的贡献。X轴和Y轴的刻度表示相对距离，他们没有实际的意义。如图2a和b所示，PC1和PC2的解释度分别为32.6%和31.1%，而PC2的解释度较低，分别为19%和15.4%。根据结果，PC1被认为是影响细菌和真菌群落组成的主要因素。结果表明，在不同季节，同一采样点的微生物群落分布不同。

同一季节，不同采样点的环境因子差异不显著，不同采样点的微生物群落相似性较高。微生物群落的季节变化大于空间变化。细菌群落在夏季和冬季的相似性高于其他季节，真菌群落在春季和夏季的相似性高于秋季和冬季。这一结果与ACE丰度的变化一致。  

图2.Q水库Q1-Q5样品中（a）细菌和（b）真菌的PCoA图。 

3. 微生物丰度的变化 

通过对Q库细菌16S rRNA高变区V3-V4和真菌ITS基因ITS1基因的分析，探究了水库中组成和成分尚不明确的微生物群落的变化。在Q 水库中共检测到41个细菌门和9个真菌门。结果表明，细菌门以放线菌门、变形菌门、拟杆菌门和蓝藻门为主。由于原生动物对放线菌的捕食受到抑制，因此很少有研究认为放线菌是水源水中的重要组成部分。在大多数淡水生态系统中，变形菌门已被确定为优势菌群。拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria）是富营养化淡水生态系统中最丰富的细菌群落。因此，尽管水源中的优势微生物有所不同，但放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）在决定水环境微生物群落组成中起着重要作用。如图3a所示，放线菌门和变形菌门在所有细菌门中占主导地位。微生物的相对丰度随季节变化而变化。春季放线菌的相对丰度高达46%，冬季下降到33%。变形菌门的相对丰度由春季的24.5%增加到冬季的36.5%。如图3a所示，春季和夏季放线菌的相对丰度较高。而变形菌门在秋季和冬季的丰度较高。拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对丰度在1年内变化范围为5.9% ~ 16.1%。夏季蓝藻的相对丰度最大，为14.9%。未分类真菌的相对丰度为98.8%。在已分类真菌中，担子菌门和子囊菌门为优势真菌门，春季相对丰度最小，为1%和0.1%，夏季相对丰度最大，为11.7%和8.2%（图3b）。根据优势微生物的特征，选择了几种环境因子评价其季节变化。  

图3.（a）细菌和（b）真菌群落在门水平上的季节性变化。   

4. 环境因素对微生物群落的影响 

研究了水源COD、TN、TP和2- MIB浓度的季节变化。如图4a所示，全年COD浓度变化范围为1.48 ~ 1.94 mg/L，季节变化不明显。一般认为，水库富营养化是由高浓度的TN和TP引起的。

如图4b和c所示，春季TN浓度最大值为2.1 mg/L，冬季最低浓度为0.5 mg/L。TP平均浓度由春季的0.13 mg/L增加到夏季的0.46 mg/L。水库中2-MIB的浓度由夏季最高的8.97 ng/L下降到秋季最低的3.01 ng/L。Q水库COD浓度较低，TN和TP浓度较高。  

图4.Q1-Q5采样点COD、TN、TP、2-MIB的浓度变化（a-d）。方框内的直线表示中值，而正方形表示平均值。盒指示25%和75%的值，丝指示最大值和最小值。  

4.1. 微生物多样性与COD的相关性

从图5的相关热图可以看出，一些非优势菌门，特别是绿弯菌门（p ＜ 0.05）、Elusimicrobia、Latescibacteria、芽单胞菌门（p ＜ 0.01），硝化螺旋菌门（p ＜ 0.001）与COD呈负相关，而导致人体组织坏死和败血症的梭杆菌门与COD呈正相关（p ＜ 0.01）。随着COD浓度的增加，Chloroflexi、Elusimicrobia、Latescibacteria、Gemmatimonadetes和Nitrospirae的丰度降低，而Fusobacteria的丰度增加。在COD浓度最低的情况下，Chloroflexi、Elusimicrobia、Latescibacteria、Gemmatimonadetes和Nitrospirae可能表现出较高的相对丰度。例如，如图3a所示，夏季绿弯菌门的相对丰度最高，为2.4%，COD浓度最低，为1.61 mg/L（平均值）。秋季COD增加到1.74 mg/L，而绿弯菌门的相对丰度下降到0.88%。绿弯菌门是一种光合自养细菌，它的生长需要少量的有机物质在水中。 

4.2. 微生物多样性与总氮的相关性研究

总体上，TN与大多数细菌呈较强的正相关，而与优势真菌呈较弱的正相关。Armatimonadetes、Gemmatimonadetes、Rokubacteria和Nitrospirae与总氮呈正相关（p ＜ 0.05）。从图3a和图4b可以看出，春季Armatimonadetes的相对丰度和TN浓度均高于其他季节。硝化螺旋菌门利用氮促进生长，在氮循环中起着重要作用。硝化螺旋菌门相对丰度的增加归因于充足的氮源，即TN浓度。如图5a所示，蓝藻与总氮呈负相关（p ＜ 0.05）。蓝藻的相对丰度由4.2%增加到10.2%，TN浓度由1.4 mg/L降低到0.7 mg/L。蓝藻已被证明在大量繁殖过程中消耗氮，可能导致TN浓度下降。 

4.3. 微生物多样性与总磷的相关性

已有研究表明，微生物的生长与磷浓度有关。绿弯菌门（p ＜ 0.01）和蓝藻（p ＜ 0.05）与TP呈正相关。绿弯菌门在除磷方面发挥重要作用。绿弯菌门的相对丰度随TP浓度的增加而增加。对蓝藻来说，总氮和总磷都是微生物生长的重要限制因子。夏季TP平均浓度为0.46 mg/L，明显高于其他季节。此外，蓝藻的丰度也很高。对于低丰度细菌，厚壁菌门和Deinococcus-Thermus与TP呈正相关（p ＜ 0.001）（图5a）。然而，拟杆菌（Bacteroidetes）（p ＜ 0.01）和浮霉菌门（p ＜ 0.05）与TP呈负相关。分类真菌中，Rozellomycota、担子菌门（p ＜0.05）和壶菌门（p ＜ 0.01）与TP呈正相关（图5b）。在水源中，细菌和真菌吸收磷生长。因此，推测某些细菌受到多种环境因子的影响，而真菌主要受TP的影响。 4.4. 微生物多样性与2-MIB的相关性

如前所述，放线菌和蓝藻在代谢过程中都会产生2-MIB。本研究结果也显示放线菌与2-MIB呈显著正相关（p < 0.05）。如图5a所示，放线菌和蓝藻的总丰度在夏季为46.1%，在冬季为43.2%。Dadabobacteria、Margulisbacteria、担子菌门、变形菌门与2-MIB呈负相关。未分类真菌与2- MIB （p ＜ 0.05）呈正相关，与TP呈负相关。因此，放线菌门和蓝藻门的相对丰度受到其他细菌代谢活动的严重影响。此外，真菌是2-MIB的另一来源，是水源水中味道和气味的主要来源。  

图5.微生物门与水质（a）细菌门和（b）真菌门关系的相关热图。R值以不同颜色显示。如果p值小于0.05，则用* （*0.01 ＜ p ＜ 0.05，**0.001 ＜ p ＜ 0.01，***p ＜ 0.001）。  

总结

微生物多样性与环境因素之间的关系对于更好地了解水库特征至关重要。本文研究了大型饮用水库中细菌和真菌多样性的季节变化，并重点讨论水质参数与微生物的关系。细菌门以放线菌门、变形菌门、拟杆菌门和蓝藻门为主，真菌门以子囊菌门和担子菌门为主。根据PCoA分析，微生物群落的季节和空间变化同样重要。水库全年COD浓度为1.48 ~ 1.94 mg/L。TN浓度的季节变化显著，冬季为0.5 mg/L，春季为2.1 mg/L。春季TP浓度最低，为0.12 mg/L。TP浓度在夏季最高，为0.5 mg/L。

环境因子的变化严重影响了微生物的相对丰度。放线菌为优势菌种，春季相对丰度为46%，冬季相对丰度为33%。变形菌门的相对丰度由春季的24.5%增加到冬季的36.5%。拟杆菌门的相对丰度相对较小，变化范围为5.9% ~ 16.1%。细菌的相对丰度也受各种环境因素的影响。蓝藻的相对丰度受TN和TP （p ＜ 0.05）， COD和TP对绿弯菌门的影响显著（p ＜ 0.05）。在已分类的真菌中，Rozellomycota、担子菌门（p ＜ 0.05），壶菌门（p ＜ 0.01）与TP呈正相关。真菌的相对丰度主要受TP的影响。

未分类真菌与2-MIB呈正相关（p ＜ 0.05）。此外，真菌是2-MIB的另一个来源，它对水源水的味道和气味也能造成影响。环境因素对代谢物的影响需要在将来进行研究。因为所使用的方法和技术要求，常规微生物种类和多样性的测定是复杂的。研究微生物多样性与环境因子的关系有助于推断COD、TN和TP等环境因子对微生物特性的影响。这些发现对于更好地了解饮用水水库微生物特征和改善饮用水水源管理具有重要意义。