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西农 | SBB：作物覆盖和施肥处理下苹果园不同粒径土壤团聚体中丰富、稀有细菌和真菌亚群落的组装

2021

06/16

微生态

A-

A+

丰富真菌群落的组装以随机过程为主，而不同粒径团聚体中稀有真菌群落的组装以同质选择和有限扩散为主导。

编译：微科盟清韵，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载。

导读

土壤细菌和真菌群落通常由“丰富生物圈”和“稀有生物圈”组成，它们共存于土壤团聚体中，形成一个复杂的种间相互作用系统。然而，由于团聚体的空间隔离，丰富和稀有细菌和真菌群落所表现出的不同的组装过程仍然不清楚。本研究量化了覆盖作物和施肥处理的苹果园中不同粒径大小的土壤团聚体中与丰富和稀有的细菌和真菌亚群落组装相关的随机性和确定性过程。在丰富细菌群落的组装中，变量选择的重要性从大团聚体增加到小型微团聚体。随着土壤有机碳和总氮含量的降低，稀有细菌群落的组装过程经历了从同质选择到弱同质选择的转变。土壤团聚体中丰富和稀有细菌群落在扩散上都不受限制。丰富真菌群落的组装以随机过程为主，而不同粒径团聚体中稀有真菌群落的组装以同质选择和有限扩散为主导。丰富和稀有细菌和真菌群落的组成也受到土壤团聚体和农业措施的影响。与稀有细菌和真菌相比，细菌和真菌中含量最高的前20个OTUs大多与大团聚体数量有关，而丰富真菌的OTUs中也有部分与微团聚体和小型微团聚体有关。本研究为今后的实验验证提供了先验假设，从而为理解不同粒径土壤团聚体中真菌和细菌群落组成变化的机制提供了系统的方法。

论文ID

原名：Assembly of abundant and rare bacterial and fungal sub-communities indifferent soil aggregate sizes in an apple orchard treated with cover crop and fertilizer

译名：作物覆盖和施肥处理下苹果园不同粒径土壤团聚体中丰富、稀有细菌和真菌亚群落的组装

期刊：Soil Biology and Biochemistry

IF：5.795

发表时间：2021.03

通讯作者：翟丙年

通讯作者单位：西北农林科技大学

实验设计和数据分析

这项实验是在2005年建立的一个苹果园里进行，该实验地点位于陕西省白水县西北农林科技大学实验站，以季风气候为主，年平均降雨量为570 mm。2008年，采用分区设计建立了施肥实验，该设计包括两个主区和两个子区。两个主区包括无作物覆盖处理和有作物覆盖处理，这两个子区包括不施肥和施肥处理，每种处理重复三次。覆盖的作物主要是豆科小冠花（Coronilla Varia L.），施肥处理为尿素（46% N）、过磷酸钙（12% P₂O₅）和硫酸钾（50% K₂O）。有关实验设置的详细信息参照一项先前研究（Zheng et al., 2018b）。共设置四个实验处理：不覆盖作物和不施肥（Control）、施肥（Fertilizer）、覆盖作物（Cover crop）、施肥+覆盖作物（Fer. + Cover）。在9年覆盖作物和施肥后进行土壤采样，随机采集6个20 cm深土样并混合。采用湿筛法对土壤团聚体进行分级处理，获得大团聚体（>0.25 mm；Macro）、微团聚体（0.053-0.25 mm；Micro）和小的微团聚体（<0.053 mm；SMicro）。分别用重铬酸钾-硫酸氧化法和凯氏定氮法测定土壤有机碳和总氮。采用16S rRNA基因高通量测序对土壤细菌和真菌群落进行分析。

OTU根据其相对丰度分为丰富或稀有。丰富的OTU定义为相对丰度>0.1%的OTU。稀有OTU定义为相对丰度<0.01%的OTU。以下统计分析均是采用R语言中的软件包进行：最近分类单元指数（NTI）测定微生物（细菌和真菌）丰富的和稀有的亚群落的系统发育多样性；基于Bray-Curtis距离估计了微生物丰富和稀有亚群落的β多样性；使用β平均最近分类单元距离（βMNTD）度量评估群落之间的成对系统发育周转；在检验数据的正态和方差均质后，用Kruskal-Wallis检验确定不同大小的团聚体和处理之间微生物α和β多样性的差异；使用阈值指示类群分析（TITAN）确定了细菌和真菌群落中由于环境变量的变化而发生显著变化的丰富和稀有的OTU；使用网络分析确定了丰富、稀有的细菌和真菌的共生关系；Raup-Crick指数（RC-Bray）和βNTI被计算来评估丰富、稀有的亚群落的确定性和随机性；使用Spearman相关系数评估群落βNTI和环境变量变化之间的关系；使用随机森林分析确定环境因子在丰富、稀有的亚群落中的重要性；使用PERMANOVA分析了覆盖作物和施肥对土壤微生物丰富性和稀有性的影响；使用Spearman相关系数确定了丰富、稀有的亚群落组成与生物和非生物因子的关系。

图文摘要

结果

1 丰富和稀有亚群落的分布及其α和β多样性

在细菌中，每个样本中平均65.14%的细菌OTU被鉴定为稀有细菌，但每个样本的平均相对丰度仅为11.37%（图1a）。相比之下，所占比例很低的细菌OTUs被鉴定为丰富细菌（平均为4.45%），占每个样品平均相对丰度的49.91%。补充文件中显示了丰富和稀有的细菌和真菌OTUs。丰度-占用关系表明，丰富和稀有的细菌类群的相对丰度与位点占有率之间都有很强的正相关关系（图1b）。本研究未发现总是属于稀有细菌类群的OTUs（图1c）。真菌OTUs在每个样本中被鉴定为稀有真菌的比例很高（平均为61.33%），但它们的平均相对丰度仅为2.11%。相比之下，约9.74%的真菌OTUs被鉴定为丰富的真菌，占每个样品平均相对丰度的90.96%。丰度-占用关系表明，丰富和稀有的真菌类群的相对丰度与位点占有率之间都有很强的正相关关系。本研究也未发现总是属于稀有真菌类群的OTUs。

正如预期，稀有的细菌和真菌亚群落的Shannon和丰富度指数高于丰富的细菌和真菌亚群落（图2a和b）。然而，丰富的细菌和真菌的NTI平均值明显高于稀有的细菌和真菌的NTI平均值，且均低于零。Macro和SMicro中稀有细菌群落的Shannon和丰富度指数高于全土（whole soil），且SMicro中的这些指数高于Micro。线性回归分析表明，丰富和稀有的细菌和真菌亚群落的α多样性（Shannon、richness和NTI）与相应整体群落（所有细菌和真菌OTU均未分成丰富和稀有亚群落）的α多样性有显著的相关性（图S1）。稀有细菌亚群落的β多样性和βMNTD高于丰富的细菌亚群落（图2c和d）。土壤团聚体大小对丰富细菌群落和稀有细菌群落的β多样性和βMNTD均有较大影响（p < 0.05）。稀有真菌亚群落的β多样性和βMNTD也高于相应的丰富的亚群落。稀有真菌群落的βMNTD值受土壤团聚体大小的影响很大（Kruskal–Wallis检验，p < 0.05）。

图1 土壤和团聚体中稀有（相对丰度<0.01%）和丰富（相对丰度>0.1%）细菌和真菌的分布。（a）每个样本的OTUs丰富度（“Richness”）和丰富和稀有类群的相对丰富度占整个细菌和真菌群落的比例。（b）通过Spearman相关分析估计的丰富和稀有类群的丰度-占用关系。（c）丰富或稀有类群的OTU数量。

图2 全土和不同土壤团聚体中丰富和稀有的微生物α多样性和β多样性。（a）全土和不同团聚体中丰富和稀有的细菌的Shannon、richness和NTI。（b）全土和不同团聚体中丰富和稀有的真菌的Shannon、richness和NTI。（c）丰富（稀有）细菌和真菌之间，以及丰富和稀有细菌和真菌的土壤团聚体之间的Bray-Curtis差异。（d）丰富（稀有）细菌和真菌之间以及丰富和稀有细菌和真菌的土壤团聚体之间的βMNTD差异。

2 稀有和丰富亚群落的组装过程

丰富和稀有的细菌和真菌群落的重要系统发育信号被发现（图S2），并用RC-Bray和βNTI对微生物群落组装的确定性和随机性进行了量化。不同亚群落间的βNTI差异显著（图S3）。随机性（52.30%）和确定性（47.70%）的组装过程都控制着丰富的细菌群落（图3a）。相比之下，稀有的细菌群落主要以确定性组装为主（同质选择，99.91%）。丰富的真菌群落以随机性组装为主（93.62%）。稀有真菌群落以同质选择为主（74.11%），随机性组装仅占25.89%（尤其是扩散限制，占24.11%）。稀有和丰富的亚群落的组装过程在不同团聚体和处理之间有所不同（图3b和c）。丰富的细菌群落随着土壤团聚体粒径的减小，变量选择的贡献增加。在Macro和Micro中，覆盖作物和施肥+覆盖的变量选择贡献高于对照和施肥；而在SMicro中，对照、施肥和覆盖作物的变量选择的贡献高于施肥+覆盖。稀有细菌群落的组装主要以同质选择为主（>95%），且同质选择是在四个处理中稀有细菌群落组装的主导因素。相反，不同团聚体中丰富的真菌群落的组装主要以随机组装为主（>95%）。

不同团聚体中稀有的真菌群落均以同质性选择为主，且在四个处理中同质性选择所占比例较大。根据Spearman相关系数和随机森林进行的分析表明，SOC、稀有真菌丰富度、TN和丰富真菌丰富度的变化是影响丰富和稀有的细菌和真菌群落βNTI的最重要因素（表S1和图S4）。随着SOC的增加，丰富细菌群落的βNTI从-2<βNTI<+2变为βNTI>+2（图4a）。随着稀有真菌丰富度的增加，稀有细菌群落的βNTI降低（图4b）。随着TN的增加，丰富的真菌群落的βNTI从-2 <βNTI<+2变为βNTI<-2（图4c）。随着丰富真菌丰富度的增加，稀有真菌群落的βNTI从-2<βNTI<+2变为βNTI<-2（图4d）。

图3 群落组装中的确定性和随机性。确定性和随机性是从两个指标值βNTI和RC-Bray中检测出来的。（a）确定性和随机装配过程对形成丰富和稀有的细菌和真菌亚群落的相对影响。（b）全土和不同大小的团聚体中，丰富和稀有的细菌和真菌的群落组装中确定性和随机性的差异。（c）确定性和随机性组装过程对形成不同处理的每个团聚体中的丰富和稀有的细菌和真菌亚群落的相对影响。

图4 亚群落的βNTI与环境变量之间的关系。（a）丰富细菌的βNTI与SOC变化之间的关系；（b）稀有细菌的βNTI与稀有真菌丰富度变化之间的关系；（c）丰富真菌的βNTI与TN变化之间的关系；（d）稀有真菌的βNTI与丰富真菌丰富度变化之间的关系。

3 丰富和稀有的亚群落组成及其相关因素

与真菌相比，土壤团聚体粒径对丰富和稀有细菌的相对丰度的影响更大（图S5）。在不同粒径的团聚体中，施肥+覆盖处理分别增加了丰富细菌（在Micro和SMicro）和丰富真菌（在Macro）的相对丰度，却减少了Micro中稀有细菌的相对丰度（表S2）。与Macro和Micro相比，SMicro中有更多的丰富和稀有的细菌OTUs（图5a）。真菌OTUs相对于细菌受土壤团聚体粒径大小的影响较小。覆盖作物显著影响全土和团聚体中丰富和稀有的细菌和真菌群落的组成，而施肥显著影响了Micro和SMicro中丰富和稀有的细菌和真菌群落（稀有真菌群落除外）的组成（图5b和表S3）。本研究使用TITAN调查了OTUs的周转率，该周转基于OTUs的丰度增加（z+）或减少（z–）（图6）。在丰富细菌中，随着SOC和TN含量的增加，属于Proteobacteria、Firmicutes和Actinobacteria的OTUs为z+，属于Acidobacteria、Bacteroidetes、Planctomycetes和Gemmatimonadetes的OTUs为z–。稀有细菌的OTUs的趋势也是这样。丰富和稀有真菌的OTUs也被SOC和TN分开。这些结果表明，养分（SOC和TN）影响着丰富和稀有的细菌和真菌群落的组成。

为了检测细菌和真菌OTUs之间的相互作用，进行了网络分析以确定丰富和稀有的细菌和真菌OTUs的共存关系（图7）。删除低代表性的OTUs（少于三个样本）后，全土、Macro、Micro和SMicro的元社区网络（meta-community）分别包含5932、6030、5828和6213个OTUs（表S4）。网络中的大多数OTU是稀有细菌（图7a），但是对于全土、Macro、Micro和SMicro而言，丰富和稀有真菌OTUs的程度，中间度中心性和紧密中心性要比稀有细菌高（图7b）。

图5 丰富和稀有微生物群落组成及其与微生物多样性和养分的关系。（a）不同粒径团聚体的OTUs丰度差异显著。（b）不同土壤团聚体和处理之间丰富和稀有的细菌和真菌群落的组成。

图6 通过阈值指示类群分析（TITAN）显示的与环境变量相关的丰富和稀有微生物OTU丰度的变化。（a）SOC、TN和真菌Shannon对丰富细菌的影响。（b）SOC、TN和真菌Shannon对稀有细菌的影响。（c）SOC、TN和细菌Shannon对丰富真菌的影响。（d）SOC、TN和细菌Shannon对稀有真菌的影响。

图7 丰富和稀有细菌和真菌在全土和不同粒级团聚体中的OTUs共存关系。（a）在全土、Macro、Micro和SMicro中，丰富和稀有细菌和真菌的OTUs的元社区网络。（b）不同网络中丰富和稀有微生物群落之间的程度、中间度中心性和紧密中心性的差异。

讨论

最近的一些研究调查了可能影响不同粒径土壤团聚体中细菌和真菌群落组成以及微生物活动变化的因素，如干旱、覆盖作物、施肥等。线虫捕食也促进了土壤中细菌群落的动态，且在土壤团聚体水平上影响程度差异很大。此外，研究也调查了细菌和真菌对土壤团聚体形成的贡献。然而，很少有研究集中于不同粒径的团聚体中丰富和稀有的细菌和真菌群落及其对农业活动的反应。由低丰度分类群组成的部分被称为微生物“稀有生物圈（rare biosphere）”。先前研究表明，丰富和稀有的微生物类群在不同的生态系统中往往表现出不同的分布模式和功能特征。通过对丰富和稀有的亚群落的组装过程和网络结构进行分析，发现稀有亚群落对群落结构和组装有显著的影响，在不同生态系统中起着“种子库（seed bank）”的预测作用。然而，驱动农业生态系统中不同粒径土壤团聚体中丰富和稀有的细菌和真菌群落组装的过程仍不清楚，尤其是所涉及的因素。本研究中调查了覆盖作物和施肥处理的苹果园土壤团聚体中的细菌和真菌，以阐明农业措施和土壤团聚体对丰富和稀有的细菌和真菌群落组装过程的影响。

1 丰富和稀有微生物亚群落的组装过程

了解与群落组装过程相关的机制对微生物生态学很重要。决定物种存在和丰度的微生物群落组装过程包括两大类，即确定性过程和随机过程。本研究发现了丰富和稀有的细菌和真菌群落的重要系统发育信号（图S2），从而表明对近亲中的系统发生更新进行定量是合适的。因此，本研究使用NTI和βNTI来量化确定性和随机性过程是否决定微生物群落组装。结果表明，丰富细菌、稀有细菌、丰富真菌和稀有真菌的群落组装分别由非优势和变量选择、同质选择、非优势、同质选择控制（图3a）。与丰富的细菌和真菌群落相比，稀有的细菌和真菌群落受确定性过程的支配作用更强。稀有类群的平均NTI值明显较低，这表明稀有亚群落的共存类群比预期的亲缘关系更远（图2a）。之前的研究也获得了类似的趋势，即稀有微生物亚群落比丰富微生物亚群落受到确定性过程的控制更强，并且在系统发育上的聚类程度更高。

在土壤团聚体中，丰富真菌群落的组装以全土和团聚体的非优势过程为主，这可能是由于丰富真菌群落的低丰度所导致的（图2a）。与丰富真菌群落相反，丰富细菌群落的组装主要由非优势选择和变量选择共同控制，变量选择的贡献随着团聚体粒径的减小而增加（图3b）。与Micro和SMicro相比，Macro中具有较高的SOC和TN水平（图S6），Macro中的养分是新鲜且不稳定的，是由于养分主要来自植物残渣。因此，与Micro和SMicro相比，Macro中丰富细菌群落的组装中随机性占主导地位，这与先前的报道一致，即随机性随着资源可用性的增加而变得更为重要。土壤团聚体中稀有细菌群落的组装过程以同质选择为主。先前的研究还表明，稀有细菌群落的组装可能以强大的同质选择为主导，因为许多稀有类群占据的生态位很窄，并且它们通常可以与其他物种相互作用。与稀有细菌群落相反，稀有真菌群落的组装过程部分取决于散布限制，这可能是由于真菌和细菌在大小和生活方式上的差异所致。土壤细菌通常是单细胞的，并且比大多数真菌要小，这可能会影响其散布和空间聚集的能力。

覆盖作物和施肥也会影响土壤团聚体中丰富和稀有的细菌和真菌群落的组装（图3c）。在覆盖作物和覆盖+施肥处理的SMicro中的变量选择比例是低于施肥处理的。与施肥处理相比，每年的作物覆盖措施可以增加了SMicro中的TN和SOC含量（图S6d），更多的TN和SOC的可利用性可能会降低变量选择对丰富细菌群落组装的贡献。在所有四种处理方式中，同质选择被证明是稀有细菌群落组装的主要因素。与变量选择相反，同质选择导致较低的成分转换率，其中选择在时间和空间上是一致的。在所有四种处理中，丰富真菌群落的组装都由随机过程控制，这与土壤团聚体中丰富真菌群落的结果相似（图3b）。因此，丰富真菌群落组装的随机性主要由其丰富度决定，而不受土壤团聚体和农业实践的影响。与丰富真菌群落的组装不同，同质选择在稀有真菌群落的组装中所占比例较大，这一结果支持了先前的报道，即同质选择主要支配农田稀有真菌亚群落。

2 丰富和稀有亚群落组装的随机性相关因素

从机理上理解微生物生态需要阐明决定随机和确定性组装过程对微生物群落的相对影响的因素。本研究发现，在群落组装过程中，与确定性和随机性有关的因素对于丰富和稀有的细菌和真菌是不同的（图S4和表S1）。与其他环境因子相比，丰富细菌、稀有细菌、丰富真菌和稀有真菌群落的βNTI值分别与SOC、稀有真菌丰富度、TN和丰富真菌丰富度的变化更密切相关。随着SOC的增加，对丰富细菌群落组装的主导作用从随机性转变为变量选择，而随着稀有真菌的丰富度增加，同质选择对稀有细菌群落的组装更具有优势（图4）。大多数稀有类群可能是寡营养细菌，如Bacteroides、Flexibacter、α-Proteobacteria、β-Proteobacteria和Firmicutes，它们的代谢高度多样，并在土壤中占据着独特的生态位。相反，丰富的类群总是异养生物，如Arthrobacter、Sphingomonas、Thermomonas和Massilia，它们能迅速利用现有资源促进生长。因此，介导丰富和稀有细菌群落组装的环境因素是不同的。

3 丰富和稀有的细菌和真菌亚群落组成

农业措施（例如覆盖作物和施肥）可能会影响土壤团聚体中细菌和真菌群落的组成。在本研究中，土壤团聚体和农业措施影响了丰富和稀有细菌和真菌的亚群落（图5和表S3）。不同处理下的不同土壤团聚体中丰富和稀有的细菌和真菌亚群落可能受到养分含量的影响（图6）。由于SOC和TN含量的增加，许多属于丰富和稀有的细菌和真菌群落的OTUs的丰度增加。在丰富和稀有的细菌和真菌群落中选择了相对丰度高的前20个OTU，且这些OTU的相对丰度也受到土壤团聚体粒径大小和农业措施的影响（图S7）。前20个OTU与土壤团聚体（Macro、Micro和SMicro）之间的关系表明，与Macro中相关的稀有细菌和真菌相比，Macro中丰富细菌和真菌的OTU更多（表S5）。另外，一些丰富的真菌OTU与Micro和SMicro有关。这些结果表明，土壤团聚体的形成和分解主要受丰富细菌和真菌，尤其是丰富真菌的影响。先前研究表明，细菌和真菌都可以通过产生微生物细胞外多糖和酶来促进团聚体的形成和分解。与细菌相反，真菌菌丝的生长、移动和缠绕可能是真菌介导团聚体形成的重要因素，菌丝的隧穿和破坏能力可能会影响土壤团聚体的解体。此外，丰富真菌在全土、大团聚体和微团聚体的细菌和真菌共生网络中也很重要。在全土、Macro和Micro的微生物网络中，丰富真菌OTUs比丰富细菌OTUs具有更高的中间度中心性；在全土和Micro的微生物网络中，丰富真菌OTUs的中程度和紧密中心性高于丰富细菌OTUs（图7）。

结论

苹果园中采用不同处理方式的土壤团聚体中，丰富和稀有的细菌和真菌亚群落的响应和组装过程不同。随机过程在驱动丰富真菌群落的组装中占主导地位，但稀有真菌群落的组装主要由同质选择和扩散限制所主导（图3）。从Macro到SMicro，随着土壤SOC和TN含量的下降，对丰富细菌群落组装的主要影响从同质选择变为随机性和变量选择，而对稀有细菌群落组装的影响则从同质选择变为弱同质选择。本研究还发现，丰富和稀有细菌和真菌群落的组成受到土壤团聚体和农业措施的影响。基于交叉OTU分析，我们发现Macro，Micro和SMicro中存在许多丰富和稀有细菌和真菌的OTUs（图8）。然而，由于分级环境条件的不同，Macro、Micro和SMicro也含有许多特定的OTUs。丰度最高的20个OTUs与土壤团聚体之间的关系表明，土壤团聚体的形成和分解主要受丰富细菌和真菌，尤其是丰富真菌的影响。本研究调查了丰富和稀有的细菌和真菌生物圈，并确定了与土壤团聚体中丰富和稀有细菌和真菌群落分布相关的机制。丰富细菌和真菌可能在土壤团聚体周转中起关键作用。未来还需要进一步测试和更多实验（例如针对不同地点，不同季节和不同土壤类型的实验）以全面评估该结论。