科研 | Cell Host & Microbe: 细菌通过IL-1β信号传导诱导皮肤再生

2021
06/15

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微生态
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编译:微科盟R.A,编辑:微科盟木木夕、江舜尧。

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导读  

增强再生的环境因素在很大程度上尚不清楚。免疫系统和微生物组在修复和再生结构中起着重要作用,但它们之间的精确相互作用尚不清楚。本研究中,作者评估了皮肤细菌在伤口愈合和伤口诱导的毛囊再生(WIHN)(一种罕见的成人器官发生模型)中的功能。WIHN水平和细菌数量相关,在无菌(GF)中最低,在常规无特定病原体(SPF)的研究组中最低,在野生型小鼠中最高,即使是感染了致病性金黄色葡萄球菌的小鼠也是如此通过更换笼子减少皮肤微生物或局部使用抗生素会降低WIHN。作者发现,炎性细胞因子IL-1β和角质形成细胞依赖性IL-1R-MyD88信号对于细菌促进再生是必要和充分的。最后,在一个小型试验中,局部广谱抗生素也减缓了成年志愿者皮肤伤口的愈合。这些结果证明了IL-1β在控制形态发生和支持重新考虑局部预防性抗生素常规应用方面的作用


 

论文ID


 

名:Bacteria induce skin regeneration via IL-1β signaling

细菌通过IL-1β信号传导诱导皮肤再生

期刊Cell Host & Microbe

IF:15.923

发表时间:2021.3.26

通讯作者:Luis A Garza

通讯作者单位:约翰霍普金斯大学医学院皮肤科


实验设计


 
1.     皮肤损伤建模:为了测试微生物组在再生中的作用,通过GF气泡使无菌(GF)小鼠受损伤;对正常的特定无病原体(SPF)小鼠进行标准伤口治疗并评估伤口引起的头发再生(WIHN)水平。  
2.     菌群失调改变再生能力:探究清洁笼子,更换笼子频率的影响等,经illumina16srDNA 基因测序,菌群分析,发现:皮肤共生菌群的减少抑制WIHN。  
3.     金黄色葡萄球菌是否促进再生:假设即使是致病性皮肤感染也可能增强WIHN,为此皮下注射细菌以确定其对皮肤的影响,并消除潜在的摄入/肠道微生物群变化,发现这些不同的实验背景表明金黄色葡萄球菌感染反应与高WIHN相关;经过检测金黄色葡萄球菌对毛囊周期的影响发现:其诱导周围的毛囊从静止期转移到生长期;  
4.     探究金黄色葡萄球菌诱导再生的机理:接下来鉴于MyD88在免疫信号传导中的核心作用,首先测试了添加或不添加金黄色葡萄球菌的MyD88−/−小鼠的WIHN,发现:金黄色葡萄球菌诱导的角质形成细胞再生需要MyD88信号,证实Myd88对于细菌诱导的WIHN和愈合至关重要。  
5.     诱导的信号的确定:为了确定哪个信号对Myd88诱导再生起作用,根据之前的WIHN基因和蛋白质筛选筛选了候选基因,发现角质形成细胞中的L-1β-IL-1R是促进皮肤再生的主要MyD88上游信号;也发现:金黄色葡萄球菌通过IL-1R信号途径诱导再生。  
6.     探究共栖细菌是否也能促进人类伤口愈合:在志愿者皮肤经过抗生素处理来降低微生物的丰度,最终发现皮肤驻留微生物的减少同时抑制了人类的伤口愈合的能力。  

 

图文摘要  
 

 

结果


共栖菌群诱导毛发再生
为了测试微生物组在再生中的作用,我们通过GF气泡使无菌(GF)小鼠受损伤(图S1A)或对正常的特定无病原体(SPF)小鼠进行标准伤损伤处理并评估毛囊再生(WIHN)水平。GF小鼠的WIHN明显更低(倍数=-17.9,p=1.9×10-6)(图1A)。我们证实GF小鼠具有较低的α多样性和成簇的β多样性(图1B和1C),并且发现,假单胞菌和葡萄球菌是SPF小鼠皮肤中的优势细菌(图S1B)。因此,较低的细菌数量和多样性与较低的再生相关。
 

图1.GF小鼠的WIHN明显低于SPF小鼠
(A)通过共聚焦扫描激光显微镜(CLSM)(右上),苏木精和曙红(H&E)染色(右下)和定量(左)检测到,GF小鼠比SPF小鼠表现出明显更低的WIHN。红色虚线框示出了再生的毛囊(每组n=6–7只独立的动物)。(B)基于Shannon和观察到的GF小鼠物种的微生物群α多样性显著低于SPF小鼠,大致相当于空气控制(每组n=4至14只独立动物)。(C)基于微生物群β多样性的主成分分析(PCA)聚类显示,具有空气控制的GF小鼠聚类,并与SPF小鼠分离。(每组n=4–14只独立的动物)。(D)形态发生和分化类别包括在WD 12伤口病床附近的SPF和GF小鼠之间的顶部和底部500种差异表达基因的基因本体(GO)富集分析中,结sc分离(SD0)的当天(每组n = 3独立动物)。(E)SPF小鼠中干细胞标志物(Krt15)和毛发再生标志物(Wnt7b和tgfb1)的mRNA表达更高,而GF小鼠中角质形成分化标志物(Flg和Krt1)更高(每组n=3只独立动物)。(F)通过免疫荧光染色(上)和定量(下)检测,SPF小鼠中SD0伤口床表皮的β-连环蛋白表达相对于正常皮肤,高于GF小鼠中的β-连环蛋白表达。白色虚线划定了伤口床和正常组织之间的边界,白色比例尺为200μm(每组n=3只独立的动物)。(G)根据照片(上)和定量(下)(每组n=5-6只独立小鼠),在WD5时,GF小鼠的伤口大小明显大于SPF小鼠。(H)通过CLSM(右上),H&E染色(右下)和定量(左)(每组n=6只独立的动物)检测到,与SPF小鼠共栖后,WIHN在GF小鼠中升高。显示了2〜3个独立实验的代表性数据。箱线图显示了最小值,第一四分位数,中位数,第三四分位数和最大值的值。散点图和直方图表示的是平均值±SEM;paired Student t- test用于比较统计学差异,** p< 0.05,** p< 0.01,** p< 0.001,** p< 0.0001。“NS”表示无显著差异。
 
为了表征上述组织变化,我们分析了损伤的GF和SPF小鼠皮肤在伤口第12天(WD12),该天也是结ab分离第0天(SD0),即新上皮细胞完成伤口覆盖的那一天并且结the被释放,但是在形态发生或再生开始之前。微阵列结果证明了SPF小鼠的形态发生和免疫激活转录本的升高(图1D和S1C)。相反,GF小鼠的角质形成细胞分化,角质化和角质化包膜的转录物明显更高(图1D)。先前的研究表明,在头发再生之前,创面床中增加的干性基因可以延长去分化角质形成细胞的维持时间,并最终改善毛囊细胞的分化和毛囊再生。这些包括较高水平的干细胞标记物(例如Krt15)和再生信号(例如Wnt7b,Tgfb1和β-连环蛋白)以及较低水平的角质形成细胞分化标记物。在验证性qRT-PCR中,SPF小鼠的干细胞标志物Krt15和再生信号Wnt7b和Tgfb1显著高于GF小鼠(图1E)。相反,GF小鼠中的角质形成细胞分化标记Krt1和Flg显著升高(图1E)。免疫荧光染色证实了SPF中β-连环蛋白的含量高于GF小鼠中的变化(图1F)。我们还观察到WD5上GF小鼠的伤口愈合延迟,这表明SPF小鼠的皮肤生物群落促进了愈合能力(图1G)。与先前关于免疫细胞对WIHN的积极作用的研究一致,M2SPF小鼠创面中的巨噬细胞,CD4+T细胞和γδT细胞显著高于GF小鼠(图S2A和S2B)。这些结果与SPF相比GF小鼠具有更大的再生能力是一致的。
接下来,我们探索了GF小鼠中减少的再生是否是一种免疫训化功能并且是不可逆的,或与之相反:是否可以通过暴露于微生物来挽救GF小鼠的再生。为此,我们在受损伤后将GF小鼠转移到SPF设施中,以将GF小鼠与SPF小鼠共同收容,并将SPF微生物群转移到以前的GF小鼠。与可逆性一致,共同饲养的GF小鼠WIHN升高至明显高于对照GF小鼠的水平(倍数为8.0,p=4.7×10-5)(图1H)。该功能证据支持了一种局部皮肤栖居的微生物群在伤口愈合过程中促进了再生的模型。
 
菌群失调改变再生能力
在诸如 WIHN之类的体内分析中可能会有差异,例如,即使在不同的研究单位使用相同的小鼠品系,结果也可能会有所不同。鉴于先前的研究表明笼子床上用品的清洁频率如何影响小鼠皮肤的微生物群,以及我们上面的结果,我们假设笼子更换频率也会改变再生。我们比较了两组SPF小鼠:每天更换(CED)和永不更换(NC)。NC小鼠在不更换笼子的情况下也受到类似的干扰,以减少压力和睡眠周期干扰的潜在混杂因素。不出所料,NC小鼠的WIHN明显高于CED小鼠(倍数3.7,p=3.2×10-4)(图2A)。而且,与我们对GF小鼠的研究结果一致,与NC小鼠相比,α和β多样性均与CED中微生物组的减少一致(图2B和2C)。接下来,我们分析了这些小鼠的微生物组的分类,并观察到在NC小鼠中葡萄球菌和链球菌的含量更高(图2D和S2C)。这些发现表明环境变化可以通过微生物组改变再生能力。
对于功能丧失,我们探讨了减少SPF小鼠皮肤中微生物群落的局部抗生素是否会抑制WIHN。先前的研究表明,外用新孢菌素是一种常用的非处方三抗生素软膏,其中含有杆菌肽,新霉素和多粘菌素,可减少皮肤上的微生物群并抑制细菌繁殖。最近的一份报告还表明,新孢菌素可抑制小鼠伤口的愈合。鉴于这种一致性,我们将新孢菌素应用于受损伤的SPF小鼠,并比较WIHN水平与用媒介物处理的SPF小鼠。与我们上面的结果一致的是,新孢菌素的应用显著抑制WIHN(倍数=-7.9,p=8.4×10-5)(图2E)。这些结果证实了共栖菌群促进再生的作用。
 

图2.皮肤共栖菌群的减少抑制WIHN

(A)通过CLSM(右上),H&E染色(右下)和定量(左)检测到,床上CED小鼠的WIHN显著小于床上NC小鼠(n=每组4只独立的动物)。(B)在CED小鼠中,微生物群α多样性(Shannon和观察到的物种)显著低于NC小鼠(每组n=4只独立动物)。(C)基于微生物群β多样性的PCA显示CED小鼠和NC小鼠分别聚集。(每组n=4只独立的动物)。(D)来自CED和NC小鼠皮肤的16SrDNA序列属水平的分类学分类的绝对值(每组n=4只独立的动物)。(E)通过CLSM(左上方),H&E染色(左下方)和定量(右)检测,局部新孢菌素处理后WIHN低于对照小鼠。红色虚线框表示再生毛囊(每组n=5只独立的动物)。显示了2〜3个独立实验的代表性数据。箱线图显示了最小值,第一四分位数,中位数,第三四分位数和最大值的值。散点图和直方图表示的是平均值±SEM;pairedStudent t- test用于比较统计学差异,**p<0.05,**p<0.01,**p<0.001,**p<0.0001。

 
金黄色葡萄球菌促进再生
考虑到共栖微生物组的重要性,我们假设甚至病原性皮肤感染也可能增强 WIHN。我们将细菌皮下注射,以定位其对皮肤的作用,并消除潜在的摄入/肠道菌群变化。我们首先对多个先前的高和低WIHN模型中的基因表达差异进行了生物信息学分析,以查询可能预测皮肤感染对WIHN影响的任何体征。有趣的是,RNA测序(RNA-seq)基因分析表明,高再生的多个实例与细菌性皮肤感染的基因特征相关(图3A-3C)。例如,在Rnasel-/-小鼠(高WIHN)中,根据我们之前对高和低WIHN小鼠品系进行比较的微阵列分析(我们发现金黄色葡萄球菌感染的基因转录本),发现它们具有增强的再生能力是第二重要的上调类别(图3A)。在对WT小鼠(WIHN高)与Rara-/-小鼠(WIHN低)的分析中,金黄色葡萄球菌感染涉及的基因转录本排名第七(图3B)。在蛋白质组学的第三次分析中,比较了伤口中心(WIHN高)与伤口周围(WIHN低)),金黄色葡萄球菌感染排名第三(图3C)。这些不同的实验结果汇聚在一起,表明金黄色葡萄球菌感染反应与高WIHN相关。为了进一步探索金黄色葡萄球菌感染途径中涉及的信号,我们搜索了丰富此类基因。我们发现大多数基因是已知的,在急性炎症中起先天免疫作用的补体信号(图S3A)。我们还发现,IL-1家族的表达与高WIHN相关:在Rnasel-/-小鼠中较高,而在Rara-/-小鼠中较低(图S3B和S3C)。这表明先天免疫和IL-1家族激活信号可能对毛囊再生很重要。
 

图3.金黄色葡萄球菌诱导WIHN

(A)Rnasel-/-小鼠中WIHN升高(左)与KEGG的基因表达的金黄色葡萄球菌基因本体论类别相关.KEGG)对Rnasel-/-的前500个差异表达基因进行富集分析WT小鼠SD0伤口床(右)。(B)与(A)中相同,除了比较WT(较高的WIHN)与Rarα-/-(较低的WIHN)。(C)示意图的头发新生优先定位到伤口中心(WIHN高),而不是边缘(WIHN低)(左)。在野生型小鼠中SD0伤口中心与伤口边缘的蛋白质组KEGG富集分析(右),也显示了金黄色葡萄球菌。(D)14天后,对小鼠皮肤的金黄色葡萄球菌处理诱导的毛发生长阶段比处理的小鼠更多(见左图)。生长期的毛囊表面积用红线标记并定量(右)(每组n=5只独立的动物)。(E)经CLSM(右上),H&E染色(右下)和定量(左)检测,经表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌处理的小鼠的WIHN显著高于对照小鼠(n=6-7独立)每组动物)。(F)由金黄色葡萄球菌诱导的从头开始的毛囊模拟了发芽中具有高Krt17的胚胎毛囊发育模式。形态发生后,卵泡在隆起和鳞茎区域适当表达β-连环蛋白和Wnt7b,并带有完整的皮脂腺(油红O)。缩写:BU,凸出;SG,皮脂腺;和HS,发干。(G)金黄色葡萄球菌在皮肤中的持续时间长于表皮葡萄球菌(右),这是根据体内生物发光信号中的总通量(p/s)(左上)和归一化通量(p/s)(左下)(n每组=6只独立的动物)。(H)经免疫荧光染色和定量检测,经金黄色葡萄球菌处理的小鼠表皮中Krt5和Krt15的表达(相对于正常皮肤正常)显著高于对照小鼠。白色虚线表示伤口和正常组织之间的边界,白色比例尺为200μm。(n=每组3只独立的动物)。(I)金黄色葡萄球菌与对照组相比,毛发再生信号传导(Wnt7b,Shh和tgfb1),炎性细胞因子(Tnf)的mRNA表达更高,而金黄色葡萄球菌分化标记物(Flg和Krt1)的表达更低。(n=每组3只独立的动物)。(J)对顶部和底部500个差异表达基因的GO富集分析表明,与对照处理的小鼠SD0伤口床相比,金黄色葡萄球菌具有更高的免疫力和降低的分化类别。插图是从显著类别中选择的基因(每组n=3只独立的动物)。(K)通过CLSM(右上),H&E染色(右下)和定量(左)检测到,与金黄色葡萄球菌感染的小鼠共存的WT小鼠的WIHN显著高于对照小鼠(n=4-7每组独立的动物)。(L)基于Shannon和与金黄色葡萄球菌感染的小鼠和金黄色葡萄球菌感染的小鼠共同饲养的小鼠的观察物种的微生物群α多样性低于对照小鼠(每组n=3至14只独立动物)。(M)基于微生物群β多样性的PCA显示与金黄色葡萄球菌感染的小鼠和金黄色葡萄球菌感染的小鼠共同饲养的小鼠成群聚集,而对照小鼠除外(每组n=3-14只独立的动物)。(N)来自C57/B6j对照小鼠,与金黄色葡萄球菌感染的小鼠和金黄色葡萄球菌感染的小鼠共同饲养的C57/B6j的皮肤的16SrDNA序列属水平的分类学分类(每只n=3-14只独立的动物)团体)。显示了2〜3个独立实验的代表性数据。箱线图显示了最小值,第一四分位数,中位数,第三四分位数和最大值的值。散点图和直方图表示的是平均值±SEM;pairedStudent t- test用于比较统计学差异,**p<0.05,**p<0.01,**p<0.001,**p<0.0001。“NS”表示无显著差异。

 
为了开始测试金黄色葡萄球菌暴露对再生的影响,我们首先测试了其对毛囊循环的影响。金黄色葡萄球菌诱导周围的毛囊从静止的休止期转为生长期(图3D)。接下来,为了评估它们在WIHN中的作用,将发光金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌(1×107CFU/每个)分别注入SPF小鼠的早期伤口中。与对照相比,表皮葡萄球菌明显增加WIHN1.5倍(p=0.014);此外,金黄色葡萄球菌将WIHN增加3.3倍(p=7.5×10-5)(图3E)。为了确定金黄色葡萄球菌诱导的从头开始的毛囊在胚胎时期是否遵循毛囊的发育模式,我们在受损伤后的不同时间点跟踪了毛囊的形态和标志物。我们发现从WD14-WD27中,金黄色葡萄球菌可促进伤口床干细胞发展为毛发芽并具有皮脂腺的完整毛囊结构(图3F)。在此期间,Krt17在发芽中也高度表达。Wnt7b和β-连环蛋白在毛发的毛发基质细胞和毛发的毛囊干细胞中高表达(图3F)。这证实了细菌诱导的新生毛囊遵循胚胎毛囊发育的模式。重要的是,与表皮葡萄球菌相比,金黄色葡萄球菌对WIHN的刺激作用更大,与其在皮肤中的寿命有关。注射2天后表皮葡萄球菌的丰度降低90%,而金黄色葡萄球菌需要7天才能降低90%(图3G),这结果与先前的报道一致。我们随后测试了多种革兰氏阳性和阴性细菌,发现它们以某种剂量依赖性方式类似地诱导WIHN(图S4A–S4E)。总之,这些数据表明更强和更持久的炎症信号刺激了更高的WIHN,可能来自不同细菌物种的异质贡献。
为了表征以上变化,我们分析了mRNA和蛋白质表达的变化。与我们之前的发现一致的是,金黄色葡萄球菌感染与更大的炎症,更多的生长生长因子和更少的分化相关,而对照显示相反(图3H,3I,S4F和S4G)。微阵列结果证实了金黄色葡萄球菌处理的小鼠中免疫细胞激活转录本的升高(图3J和S4H)。尽管在注射金黄色葡萄球菌的皮肤中某些毛囊发育基因被下调,但这些基因是终末分化标志物,如Krt27,Krt83,Krt25和Krt71,它们参与了毛干的形成(图3J)。这些结果表明,金黄色葡萄球菌抑制角质形成细胞的分化,从而有可能促进再生过程中干细胞的维持。
考虑到共栖(co-housing)可以挽救GF小鼠的低WIHN,我们接下来探索与金黄色葡萄球菌感染的动物共栖是否也可以改善未感染笼友的WIHN。即使没有直接注射并且可能没有肠道细菌的任何修饰,共饲养的小鼠的WIHN仍显著增加(倍数=2.7,p=7.2×10-5)(图3K)。在这种情况下,鉴于金黄色葡萄球菌抑制其他细菌,α多样性降低,并且β多样性呈簇(图3L3M如我们所料,共同饲养和注射的小鼠也比对照小鼠具有明显更高的葡萄球菌量(图3NS5A这些结果证明增加的金黄色葡萄球菌的表皮暴露诱导了WIHN
 
金黄色葡萄球菌诱导的再生需要角质形成细胞中的MyD88信号转导
接下来,我们试图定义需Myd88再生的细胞类型。受损伤后,我们评估了纯合和杂合的小鼠LysMcreXMyd88fl/fl(骨髓细胞)和K14creXMyd88fl/fl(角质形成细胞)的WIHN水平。对于髓样细胞,纯合子(Lym-Myd88-/-)和杂合子(Lym-Myd88+/-)都保留了与WT小鼠相似的WIHN。金黄色葡萄球菌注射也可以诱导增强的WIHN(图4C),这表明再生不需要髓样细胞中的Myd88信号传导。但是,K14-Myd88-/-小鼠的WIHN显著低于野生型小鼠,不能通过金黄色葡萄球菌注射来挽救(图4C)。这些结果表明,角质形成细胞中的Myd88信号传导对于伤口诱导的再生和细菌诱导的再生是必需的。尽管增加的皮肤细菌并不能挽救Myd88-/-和K14-Myd88-/-小鼠的低WIHN,但我们假设缺乏Myd88可能还会改变小鼠表皮微生物组,因为上述伤口愈合速度较慢。我们发现Myd88-/-和K14-Myd88-/-小鼠均具有比WT小鼠更低的微生物组α多样性(图4D)。假单胞菌或链球菌的比例增加,而其他细菌(包括葡萄球菌)在Myd88缺陷的小鼠皮肤中减少(图4E)。这些结果与先前的研究一致,该研究表明Myd88-/-小鼠易患假单胞菌,并表明Myd88在平衡和维持受损伤皮肤上的微生物组中的重要作用。
 

图4.细菌诱导的WIHN由角质形成细胞中的MyD88信号传导所介导

(A)Myd88-/-小鼠中的WIHN显著低于野生型小鼠(上),并且不能被金黄色葡萄球菌处理诱导(下)(每组n=4-7只独立的动物)。(B)根据照片(上)和定量(下)(每组n=4-7只独立小鼠),Myd88-/-小鼠的伤口愈合速度显著慢于WT小鼠。(C)经金黄色葡萄球菌处理或未处理的WT,K14-Myd88-/-,LysM-Myd88-/-,LysM-Myd88+/-和Myd88-/-小鼠的WIHN(上),定量(下)。K14-Myd88-/-小鼠中的WIHN显著低于野生型小鼠,并且对金黄色葡萄球菌无反应(每组n=4-10只独立的动物)。(D)与WT小鼠相比,微生物群α多样性(Shannon和观察到的物种)显著低于K14-Myd88-/-和Myd88-/-小鼠(每组n=4只独立动物)。(E)基于WT,Myd88缺陷小鼠,K14-Myd88-/-和Myd88-/-小鼠皮肤的16SrDNA序列属水平的百分比表明假单胞菌或链球菌增加了,而其他细菌(包括葡萄球菌(黄色))减少了(每组n=4只独立的动物)。显示了2〜3个独立实验的代表性数据。散点图和直方图表示的是平均值±SEM;pairedStudent t- test用于比较统计学差异,**p<0.05,**p<0.01,**p<0.001,**p<0.0001。“NS”表示无显著差异。

 
角质形成细胞中的IL-1β-IL-1R是促进皮肤再生的主要MyD88上游信号
为了确定哪个信号导致Myd88诱导再生,我们根据之前的WIHN基因和蛋白质筛选方法筛选了候选基因。我们在Tlr2-/-,Il-1r-/-和Il-36r-/-小鼠中测试了WIHN。Tlr2-/-小鼠显示正常的WIHN,然而Il-1r-/-(倍数=-9.5,p=2×10-4)和Il-36r-/-小鼠显示较低的WIHN(图 5A)。这表明Toll样受体2TLR2)信号对于再生不是必需的,但是IL-1R和IL-36R信号起着促进再生的作用。接下来我们将金黄色葡萄球菌注射入所有三只突变小鼠中。尽管金黄色葡萄球菌在Tlr2-/-(倍数= 1.9,p = 1.6×10-3)和Il-36r-/-小鼠(倍数= 3.2,p = 4.5×10-3)中增加WIHN,但在Il-  1r-/-小鼠仍然受到抑制且未改变(图5A)。我们以前的研究表明,TLR3信号传导对于毛囊再生很重要。此外,研究表明TLR3信号在细菌感染期间被激活并在激活炎症中起作用。因此,我们测试了GF,SPF,PBS处理和金黄色葡萄球菌处理的小鼠中TLR3的表达。我们发现TLR3信号在具有更高细菌载量和更好WIHN的小鼠中高表达(图S5C)。但是,金黄色葡萄球菌可以挽救Tlr3-/-小鼠的低WIHN,这表明细菌诱导的WIHN是TLR3信号独立的(图S5D)。这表明金黄色葡萄球菌通过IL-1R信号传导独特地诱导再生。
尽管细菌无法挽救Il-1r-/-小鼠的再生能力,但我们再次质疑缺乏IL-1信号传导会如何改变共性。Il-1r-/-小鼠的微生物组多样性与WT小鼠的微生物组多样性没有显著差异,尽管确实有降低的趋势(图5B)。更清楚地,类似于Myd88-/-小鼠,链球菌和假单胞菌会增加,而其他细菌(包括葡萄球菌)在Il-1r-/-小鼠皮肤上会减少,这表明IL-1信号在平衡和维持伤口上的微生物组方面具有类似作用  皮肤。
接下来,我们通过比较高和低WIHN组(分别是SPF,GF和金黄色葡萄球菌和媒介物)的mRNA转录本中白介素和趋化因子的表达来研究哪些IL-1R配体可能促进WIHN(图5C和5D)。在两个实验背景下,Il-1β基因表达与高WIHN最一致(图5C和5D)。接下来,我们在受损伤期间的不同时间点测量Il-1α和Il-1β的表达,以进一步定义它们的作用。同样,Il-1β水平与高WIHN最佳相关(图5E)。这些结果表明,在受损伤过程中,IL-1β信号传导而非IL-1α促进了再生。
为了确定伤口床中IL-1β的来源,我们用与F4 / 80共同染色的IL-1β作为巨噬细胞标记物对小鼠SD0伤口床进行了染色。先前的研究表明,IL-1β的主要来源是髓样,尤其是巨噬细胞。此外,研究表明在发炎的皮肤和疤痕中,IL-1β在角质形成细胞中高度表达。我们的结果表明,尽管在对照中(无一抗和IL-1β-/-小鼠)均不存在,但IL-1β在角质形成细胞和巨噬细胞中均高表达(图S6G,S6H和6D)。
为了从功能上测试IL-1β的重要性,我们检查了其在体外和体内的作用。首先,考虑到在伤口中发育生长因子的增加和细菌分化的减少,我们测试了IL-1β对人角质形成细胞的影响。与这些结果一致,rhIL-1β处理组显著增加WNT7B,SHH,KRT7和LEF1的表达,但以浓度依赖的方式显著降低KRT1和FLG的表达(图5F)。接下来,我们将外源rmIL-1α,rmIL-1β或热灭活的金黄色葡萄球菌应用于受损伤的小鼠。热杀死的细菌和Il-1α未能促进WIHN(图5G)。但是,rmIL-1β增强了WIHN(倍数= 2.5,p = 0.015)(图5G)。
为了将功能丧失模型与上述功能获得性测试进行比较,我们将用或未用金黄色葡萄球菌处理的Il-1α-/-和Il-1β-/-小鼠受损伤。Il-1α-/-小鼠正常再生,金黄色葡萄球菌刺激WIHN(倍数= 2.3,p = 0.028)(图5H)。相比之下,Il-1β-/-小鼠的WIHN显著低于野生型小鼠(倍数= -7.0,p = 0.001),并且不能通过金黄色葡萄球菌注射而增加(图5H)。与全体内删除后的结果一致,具有IL-1R(K14-Il-1r-/-)的角质形成细胞特异性删除的小鼠也表现出低WIHN(倍数= -7.7,p = 8.9×10-4),  金黄色葡萄球菌未能刺激(图5H)。与Myd88-/-小鼠一致,与WT小鼠相比,Il-1β-/-小鼠的伤口愈合速度明显延迟(图5I)。
如上所述,由于内源性IL-1β对于毛囊再生和加速皮肤重新上皮形成必不可少,因此我们接下来测量IL-1β的损失是否会改变愈合伤口床的抗张强度。对于WT和Il-1β-/-小鼠,健康皮肤的拉伸强度显著高于伤口床的拉伸强度。但是,WT和Il-1β-/-小鼠创口的强度之间没有显著差异(图5J)。这些发现表明细菌通过角质形成细胞IL-1R-MyD88途径的内源性IL-1β刺激增强了再生和愈合,而对整个皮肤的强度没有影响,更可能与胶原蛋白的产生和成纤维细胞有关。为了证实IL-1β在体外和体内的作用,我们测试了IL-1β对来自WT小鼠或Il-1r-/-和Myd88-/-小鼠的角质形成细胞的作用。我们发现IL-1β对增长的生长因子和抑制分化的影响取决于IL-1R和Myd88的表达(图5K)。在这种情况下,外源性rmIL-1β无法挽救K14-Myd88-/-小鼠的WIHN(图5L)。这些结果与细菌通过角质形成细胞中的IL-1β-IL-1R-MyD88信号促进再生的模型相一致。
鉴于γδT细胞在再生中不可或缺的作用以及我们发现高WIHN小鼠中γδT细胞增加的发现,我们接下来探讨了适应性免疫在我们的模型中的作用(图S2A和S5B)。有趣的是,在发表的报告中,金黄色葡萄球菌在激活Myd88信号后诱导皮肤γδT细胞产生IL-17A,IL-17A促进角质形成细胞和粘膜细胞的干性。我们同样观察到在经金黄色葡萄球菌处理的小鼠伤口床上,γδT细胞产生更高的IL-17A(图S6A)。因此,我们从WT小鼠皮肤的次级淋巴结中分离出T细胞,并将其注入Myd88-/-小鼠伤口床中,以确定IL-1β-IL1R-Myd88信号传导是否为γδT细胞和IL-17依赖性。然而,野生型小鼠的T细胞无法挽救Myd88-/-小鼠的低WIHN(图S6B),rhIL-17 HFKC的体外处理也不能增强再生和干细胞标记物(图S6C)。同样,Il-17a / f-/-小鼠的WIHN与WT小鼠没有显著差异(图S6D)。这些结果表明,通过Myd88信号传导的细菌诱导的皮肤再生不是γδT细胞和IL-17A依赖性的,更可能是通过IL-1产生的,如上所述。接下来,我们测试了IL-17如何影响皮肤微生物组。我们发现,Il-17a / f-/-小鼠的α多样性与野生型小鼠无显著差异,但假单胞菌增加,而其他细菌(包括葡萄球菌)减少。这些数据突出了葡萄球菌共感染水平对宿主免疫破坏的共同和独特的敏感性。(图S6E和S6F)。

图5.角质形成细胞中的IL-1β-IL-1R信号传导是促进WIHN的主要MyD88刺激

(A)在金黄色葡萄球菌处理或未处理的WT,Tlr2-/-(上),Il-1r-/-和Il-36r-/-(下)小鼠中的WIHN定量。Il-1r-/-小鼠中的WIHN显著低于野生型小鼠,并且对金黄色葡萄球菌无反应(每组n = 3-7只独立的动物)。(B)在Il-1r-/-小鼠中,微生物群α多样性(Shannon和观察到的物种)与WT小鼠无显著差异(每组n = 4只独立的动物)。来自WT和Il-1r-/-小鼠皮肤的16S rDNA序列属水平分类分类的百分比表明,在IL-1缺陷小鼠中,假单胞菌和链球菌增加,而其他细菌包括葡萄球菌(黄色)减少(n = 4独立)每组动物)。(C)火山图显示的差异表达基因表明,Il-1β是SPF和金黄色葡萄球菌处理的小鼠(每组n = 3只独立的动物)共有的最显著上调的基因之一。(D)GF,SPF,PBS处理和金黄色葡萄球菌处理的SD0伤口床组织中白介素和趋化因子的相对微阵列mRNA表达证明Il-1β与WIHN相关(每组n = 3只独立的动物)。(E)在基线(未受损伤),WD3和WD10的GF,SPF,PBS处理和金黄色葡萄球菌处理的小鼠的Il-1α和Il-1β的qRT-PCR mRNA表达证实IX-1β与WIHN相关(每组n = 3只独立的动物)。(F)qRT-PCR mRNA表达显示,在rhIL-1β处理的人包皮角质形成细胞中,头发再生标记(Wnt7B,Shh和Lef1)和干细胞标记(Krt7)增加,而角质形成细胞分化标记(Flg和Krt1)减少。HFKC)与媒介相比(每组n = 2-4个独立的人类样本)。(G)经rmIL-1β处理的小鼠的WIHN显著高于对照组,经热杀死的金黄色葡萄球菌处理和rmIL-1α处理的小鼠(每组n = 3至6只独立的动物)。(H)金黄色葡萄球菌处理或未处理的WT,K14-Il-1r-/-,Il-1α-/-和Il-1β-/-小鼠中的WIHN(上),定量(下)。K141-11-1r-/-小鼠和Il-1β-/-小鼠中的WIHN显著低于野生型小鼠,并且对金黄色葡萄球菌无反应(每组n = 3-7只独立的动物)。(I)根据照片(上)和定量(下)(每组n = 4-7只独立小鼠),Il-1β-/-小鼠的伤口愈合速度显著慢于WT小鼠。(J)WT和Il-1β-/-小鼠之间的WD28伤口床抗张强度没有显著差异,两者均低于其各自的健康皮肤(每组n = 6至9只独立小鼠)。(K)在rmIl-1β处理,未处理的对照,Il-1r-/-和Myd88-/-小鼠角质形成细胞(n)中毛发再生标记(Wnt7b和Shh)和角质形成细胞分化标记(Flg和Krt1)的相对mRNA表达 =每组3只独立的动物)。(L)rmIl-1β处理的K14-Myd88-/-小鼠中的WIHN与对照小鼠相同(每组n = 8–9只独立的动物)。显示了2〜3个独立实验的代表性数据。散点图和直方图表示的是平均值±SEM; paired Student t- test来比较统计学差异,** p <0.05,** p <0.01,** p <0.001,** p <0.0001。“ NS”表示无显著差异。

 

6 共栖细菌促进人类伤口愈合 
最后,在一个小型试验中,我们试图阐明这种细菌促进的再生表型在整个物种中是否保守。尚未在人类中明确确定WIHN,又如WIHN与伤口闭合相关的另一项研究的结果以及以及我们的微生物组结果(见上文),因此我们将伤口闭合速度视为人类受试者中研究的终点。
 

图6.抗生素抑制人的伤口愈合

(A)在同一个人中进行相同的全厚度打孔伤口后,按照片(上图),定量(左下图)和个体内归一化处理,新孢菌素处理的人伤口的大小显著大于凡士林处理的对照伤口  (右下)(每组n = 6个独立的人类样本)。B和C)来自凡士林和新孢菌素处理的患者皮肤的16S rDNA序列属水平的分类学分类的绝对值(B)和百分率(C)表明,葡萄球菌(黄色)是除抗生素后差异最大的细菌  处理(每组n = 6个独立的人类样本)。(D)新孢菌素通过苏木精和曙红(H&E)染色可见伤口愈合延迟(左)。通过免疫荧光染色(左)和定量(右)(每组n = 4个独立的人类样品)检测,新孢菌素还降低了伤口床表皮中KRT5和IL-1β的表达(箭头所示)。(E)经凡士林和新孢菌素处理的人受损伤皮肤的qRT-PCR mRNA表达分析(每组n = 3个独立的人类样品)。(F和G)微阵列mRNA分析表明,与新孢菌素处理过的皮肤相比,凡士林中与伤口相关的角蛋白和趋化因子表达更高(每组n = 3个独立的人类样品)。(H和I)基因本体分析显示,与新孢菌素处理过的样品中的胶原蛋白类别相比,凡士林中的金黄色葡萄球菌和表皮发育签名增加(每组n = 3个独立的人类样品)。显示了来自2个独立实验的代表性数据。散点图和直方图表示的是平均值±SEM;  paired Student t- test用于比较统计学差异,** p <0.05,** p <0.01,** p <0.001,** p <0.0001。

 

因此,我们测试了细菌是否会提高人类伤口愈合的速度。在没有近期抗生素接触史的每个受试者中,我们对皮下脂肪进行了双侧相同的穿刺活组织检查伤口,并指示参与者在封闭的情况下用非处方药抗生素新孢菌素共同处理一个伤口,并用凡士林处理第二个配对对照。选择腘窝作为研究目标是因为先前的微生物组测序表明,它在身体部位中具有最高的微生物多样性,丰富性和均匀性之一,其主要细菌是葡萄球菌。令我们惊讶的是,新孢菌素显著减慢了伤口的愈合速度(图6A),这与对小鼠的研究一致。6例患者均未发生新孢菌素接触性皮炎。分类学结果表明,葡萄球菌是对照皮肤上的主要细菌,在新孢子素处理后明显减少(图6B和6C)。根据组织学,凡士林处理过的皮肤在疤痕下形成完整的上皮。相比之下,新孢子素处理过的皮肤上皮再生仍不完全,而上皮舌头仍朝伤口愈合方向迁移(图6D)。免疫荧光染色显示,凡士林处理的皮肤中KRT5和IL-1β的水平高于新孢菌素处理的皮肤中的KRT5和IL-1β的水平(图6D)。正如我们在小鼠中发现的那样,在新孢子素处理的组织中WNT7B,EGFR,PCNA和TNF的表达显著降低,而BMP6显著更高(图6E)。
接下来,我们对用凡士林和新孢子素处理的伤口进行了基因表达分析。凡士林处理过的皮肤中与伤口愈合相关的基因表达明显较高(图6F)。其中包括角蛋白KRT16和KRT6C;  细胞增殖相关基因CEP55,MAPK13和KIF18A;  与炎症激活相关的基因CCL24,Ly6G6C和C10orf99。但是,新孢菌素处理过的皮肤中的成纤维细胞激活基因(例如FAP)明显更高(图6F)。无监督的聚类分析通过健康皮肤的处理前活检(未伤口)和再上皮化皮肤的处理后活检(伤口)的聚类证实了这些发现,从而揭示了各组之间不同的角蛋白表达情况(图6G)。同样,新孢霉素和凡士林处理的样品也分别聚类,前者与大多数伤口角蛋白,皮肤再生相关基因和趋化因子的低表达有关(图6G)。
最后,基因富集分析再次证明了金黄色葡萄球菌感染途径的标志性特征与凡士林处理组伤口愈合的改善有关,从而证实了我们在小鼠中的结果(图6H)。凡士林处理过的皮肤中的免疫激活,皮肤发育和表皮发育的转录本显著较高(图6I),而新孢菌素处理过的皮肤中与胶原蛋白相关的转录本显著更高(图6I)。这些功能结果表明,皮肤栖居微生物的减少同时抑制了小鼠和人类的愈合能力。


讨论


物种的再生能力在很大程度上被认为是一种内在特性。在这里,我们表明外源性微生物组调节再生,具有明确的临床意义。当前,局部抗生素在消费者甚至一些医生轻微的皮肤创伤后被常规使用。另外,大量使用抗生素是增加抗生素耐药性的元凶。我们的结果表明减少局部使用抗生素的好处。我们表明,微生物组改善皮肤伤害模型的再生,其中新生的新毛囊形成在形态发生事件中,概括了胚胎的发育。微生物组不仅对于这种再生很重要,而且甚至增加致病菌水平也能增强效果。我们证明其机制是通过信号传导级联,其中IL-1β及其受体IL-1R激活角质形成细胞中的Myd88。我们还表明,即使在人类中,我们的共栖微生物组对于伤口愈合速度在功能上也很重要。这些结果强调了伤口愈合与共栖细菌之间的共栖关系以及常规局部使用抗生素对人体的有害影响。
鉴于各个机构对动物笼的照顾有所不同,微生物组是一个未被充分认识的因素,甚至可能使正在进行的关于再生的实验室研究普遍不知所措。我们的结果与关于皮肤和肠道微生物群的积极作用的新兴文献相一致,其中一些与通过小鼠和人类的皮肤微生物群促进伤口愈合的文献相一致。一项研究发现GF小鼠的愈合速度比传统小鼠快,这可能是由于使用不同品系,年龄较大,伤口较小以及不同的隔离方案等差异造成的。相反,最近发表的一项研究表明,抗生素可以抑制小鼠伤口的愈合,这与我们的发现一致。因此,在微生物组通过多种不同的机制促进伤口愈合的问题上,出现了一个新的共识。
我们的结果总体上与传染病报告相符,即金黄色葡萄球菌诱导的IL-1β-IL-1R-MyD88信号可加速病变皮肤中角质形成细胞的增殖并抑制角质形成细胞的分化。同样,我们的工作还加深了对常见的炎症性皮肤病(如特应性皮炎)的了解,其中金黄色葡萄球菌过多。例如,我们的工作引起了这样的猜测,即即使解决了严重的特应性皮炎,患者身上也没有出现疤痕,这可能部分是由于金黄色葡萄球菌的丰度引起的。我们的发现还表明,尽管金黄色葡萄球菌具有致病性感染的潜力,但由于其对伤口愈合的有益作用,甚至可以通过进化来维持金黄色葡萄球菌甚至在正常出现的健康皮肤中的流行。以及表皮葡萄球菌对皮肤免疫训练和伤口愈合的积极作用。考虑到IL-1,MyD88或IL-17的损失如何改变微生物组的组成,尤其是金黄色葡萄球菌的丰度,我们的发现也提出了有关微生物治理和稳定性的重要问题。
这项工作是通过对我们之前的三项独立研究进行分析而得出的,这些研究将高WIHN的基因特征与金黄色葡萄球菌感染的基因特征相关联,但其他细菌也可能对再生很重要。同样,除了本文研究的先天免疫机制外,测试适应性免疫系统如何在细菌刺激过程中支持再生是未来研究的重要且富有成果的领域。显然,重要的未来工作将定义有关微生物组促进愈合的依赖IL-1和独立机制的更多细节。

总结


总而言之,我们的研究证明了常驻微生物对人类和小鼠皮肤伤口愈合的积极作用。未来的问题将解决是否存在某些特定的共栖微生物,这些微生物对积极促进愈合和再生产生更大的影响,以及是否确实存在消极取向的微生物。我们的结果证明了停止局部使用局部预防性抗生素的重要性。



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关键词:
细菌,科研,皮肤,伤口,细胞,角质,动物

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