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上海理工 | Food Funct：樟芝中的Antrodia A调节急性摄入酒精小鼠的肠道菌群和肝脏代谢

2021

06/04

微生态

A-

A+

AdA通过调节微生物和代谢组学反应，对酒精摄入引起的肝脏脂质积累、氧化应激、炎症和肝损伤产生积极影响。

导读

随着酒文化的发展，酒精性肝病（ALD）的发病率逐年增加。研究和开发保护人们免受酒精引起的肝损伤的有效疗法正引起越来越多的关注。本研究旨在探讨樟芝菌丝中的Antrodia A（AdA）对摄入酒精引起的肠道菌群和肝脏代谢紊乱的保护作用。在急性酒精性肝损伤小鼠中，AdA通过调节肠道菌群和代谢反应改善摄入酒精引起的肝脂质沉积（TC和TG）、氧化应激（MDA）、炎症（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17和IFN-γ）和肝损伤。AdA恢复了肠道菌群的组成，增加了乳酸杆菌（Lactobacillus）和杜氏乳杆菌（Dubosiella）的相对丰度，减少了Clostridium_sensu_stricto_1、Lachnospiraceae_NK4A136_group、和Prevotellaceae_NK3B31_group的相对丰度。此外，AdA对摄入酒精引起的代谢紊乱具有良好的调节作用，包括谷胱甘肽代谢（S-（2-羟乙基）谷胱甘肽和谷胱甘肽氧化）、抗坏血酸（L-抗坏血酸）和醛糖代谢、牛磺酸和次牛磺酸代谢。总之，樟芝菌丝中的AdA是一种治疗摄入酒精引起的肠道菌群和代谢紊乱的有益活性成分。

论文ID

原名：Antrodin A from Antrodia camphorata modulates the gut microbiome and liver metabolome in mice exposed to acute alcohol intake

译名：樟芝中的AntrodiaA调节急性摄入酒精小鼠的肠道菌群和肝脏代谢

期刊：Food & Function

IF：4.171

发表时间：2021.2

通讯作者：夏永军

通讯作者单位：上海理工大学医疗器械与食品学院

实验设计

从樟芝菌丝体中分离出AdA。将小鼠分为四组：（1）对照组（NC）；（2）摄入酒精组（AL）：灌胃红星二锅头，56%，v/v，每天5.6 g/kg体重；（3）治疗组（ADAL）：每天灌胃酒精5.6 g/kg体重和AdA75 mg/kg体重；（4）治疗组（ADAH）：每天灌胃酒精5.6g/kg体重和AdA 150 mg/kg体重。所有小鼠连续灌胃15天，禁食16 h。取眼球采血，解剖取肝脏称重并进行肝脏组织病理学检查。测定了血清和、样品中的丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。并定量血清中的细胞因子水平，包括肿瘤坏死因子（TNF）-α，白细胞介素（IL）-10、 IL-6、 IL-1β、干扰素（INF）-γ和IL- 17a。测定了肝组织中的丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）测定。采用16S rDNA高通量测序分析粪便样品的微生物组成。UPLC-TOF/MS用于分析的肝脏代谢。

结果

1 AdA 减轻摄入酒精引起的小鼠肝损伤

治疗15天后，四组之间的体重没有显著差异（图1A）。然而，各组小鼠的体重增加有显著差异。AL组小鼠体重增加明显低于NC组（p < 0.05）。AdA阻止了摄入酒精引起的体重增加减少，体重增加被AdAH正常化（图1B）。肝脏重量指数、血清ALT、AST活性被用作酒精性肝病的指标。与NC组相比，酒精摄入显著提高了肝脏指数、血清 ALT、AST活性，且均被AdAH正常化（图1C-E）此外，AdA减轻了摄入酒精引起的肝脏炎症和脂质积累，如肝脏组织学切片所示（图1F和G）。与NC组相比，AL和AdAL组具有明显的脂肪变化，如有明显的脂滴、脂肪空泡化和炎性细胞浸润（图1F）。与AL组相比，AdAH组没有出现明显的脂肪变性和炎性细胞浸润，只有轻微的脂滴积聚（图1G）。这些结果表明，AdA减轻了摄入酒精对肝细胞的影响，抑制了炎症浸润，导致肝细胞结构的恢复。

图1 AdA减轻摄入酒精所致的小鼠急性肝损伤。（A）体重增长；（B）体重增加，（C）肝指数；（D）血清ALT；（E）血清AST；（F） 200倍镜下HE染色的肝脏切片组织学变化；（G） 200倍镜下油红O染色的肝脏切片组织学变化。

2 AdA 对摄入酒精小鼠血脂含量的影响

为了确定AdA在改善ALD小鼠脂质积累方面的潜在作用，测定了小鼠血清TG、TC、HDL-C和LDL-C水平。如表1所示，AL组小鼠TG、TC、LDL-C的水平高于NC组，HDL-C的水平低于NC组，表明摄入酒精引起脂质代谢紊乱（ p < 0.05）。这与肝油红O染色结果一致。与AL组比较，AdAH组TG、TC、LDL-C的水平显著降低（32.37%、27.82%、21.57%），与NC组比较，AdAH组TG、TC、LDL-C的水平无显著差异。AdAH组HDL-C的水平显著升高（50.37%，p < 0.01），而AdAH组与NC组LDL-C无显著差异。上述结果表明，AdAH能有效降低酒精性肝损伤小鼠肝脏中TG和TC的含量，提高肝脏胆固醇的转运能力。

表1 AdA对酒精摄入小鼠血脂含量的影响。

3 AdA 对摄入酒精小鼠血清中炎性细胞因子的影响

测定了小鼠血清中促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17和IFN-γ）和抗炎细胞因子IL-10水平的变化，以确定AdA的抗炎作用。如表2所示，与NC组相比，AL组促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17和IFN-γ水平显著升高（分别为110.11%、48.65%、71.01%、83.31%和118.97%）。然而，与酒精摄入的小鼠相比，用低剂量和高剂量AdA治疗导致这些促炎细胞因子显著减少。AdAH可清除酒精性炎症，血清中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17和IFN-γ均显著降低（分别为48.41%、22.91%、32.34%、34.99%和42.15%）。同时，AdAH组小鼠IL-10水平较摄入酒精组显著升高（120%）。因此，这些结果表明AdA可以剂量依赖性地减少摄入酒精诱导的炎症，并且大剂量似乎在减少促炎细胞因子方面更有效。

表2 AdA对摄入酒精小鼠血清中炎性细胞因子的影响（pg/mL）。

4 AdA 对摄入酒精小鼠肝脏抗氧化能力的影响

为了分析AdA在体内的抗氧化活性，测定了肝脏抗氧化酶SOD、GSH和GSH-px及其脂质产物MDA，结果如图2所示。可见，MDA的水平明显升高（120%，图2D），而SOD、GSH和GSH-px含量则显著下降（47.39%、73.23%和44.48%，图2AC），AL组小鼠肝脏组织中氧化应激水平明显高于NC组小鼠（图2A-D），说明ALD小鼠肝脏氧化应激水平明显升高。大剂量AdA可通过降低MDA（50.91%，图2D）和增加SOD（16.76%，图2A）、谷胱甘肽（72.86%，图2B）和GSH-Px（43.70%，图2C）在肝脏中的浓度。AdAH组小鼠肝脏的GSH、GSH-px的水平显著高于AL组，与NC组无显著性差异（p> 0.05）。表明大剂量AdA可减轻氧化应激，对酒精性肝损伤具有保护作用。

图2 AdA对摄入酒精小鼠肝脏抗氧化能力的影响。（A）SOD；（B）GSH；（C）GSH-px；（D）MDA。

5 AdAH调节酒精性肝损伤小鼠肠道菌群

由于摄入酒精可以引起肠道菌群的变化，通过16SrDNA高通量测序分析，研究了AdAH对摄入酒精小鼠肠道菌群的影响。通过Shannon、Simpson、Ace和Chao指数对α多样性进行评价，结果表明AL组的群落多样性和丰富度显著低于NC组（p < 0.001），并在AdAH处理后恢复（图3A-D）。基于主成分分析（PCA）（图3E）和主坐标分析（PCoA）（图3F）进行β多样性分析，研究AdA干预后肠道菌群的整体结构变化。PCA评分图显示实验组之间有明显的差异。AdAH处理明显使肠道菌群结构向PC1（59.05%）的负方向迁移，说明添加AdA可在一定程度上恢复酒精破坏的肠道菌群。PCoA显示AL组样品与其他组样品的群落结构有显著差异，且AL组PC1与其他组明显不同（43.73%）。群落组成分析显示，在门水平（图3G），厚壁菌门（57.05%）、拟杆菌门（37.65%）和放线菌门（0.23%）是NC组小鼠肠道菌群的主要组成部分。而小鼠酒精灌胃后，厚壁菌门（47.96%）和拟杆菌门（45.73%）的群落丰度下降，而放线菌门（1.26%）的群落丰度有所增加（图3 C）。AdAH增加了肠道厚壁菌门（59.83%）的丰度，降低了拟杆菌门（33.81%）的丰度。在属水平（图3H），肠道菌群主要由Lactobacillus（35.96%）， norank_f_Muribaculaceae（29.24%），Dubosiella（10.26%），和 Lachnospiraceae_NK4A136_group（1.23%）组成（图3D）。然而，酒精摄入增加了Lachnospiraceae_NK4A136_group（3.59%），Prevotellaceae_NK3B31_group（5.0%），Prevotellaceae_UCG-001（3.7%），和Clostridium_sensu_stricto_1（4.29%）的丰度，减少了Lactobacillus（23.97%）和Dubosiella（4.71%）的丰度。药物治疗后，Lactobacillus（37.34%）和Dubosiella（6.60%）丰度增加，而Lachnospiraceae_NK4A136_group（2.21%），Prevotellaceae_NK3B31_group（0.06%），Prevotellaceae_UCG-001（0.46%），和Clostridium_sensu_stricto_1（0.01%）丰度减少。间差异显著性检验结果（图3I）表明，在属水平，酒精摄入显著降低了Lactobacillus的丰度，增加了Prevotellaceae_UCG-001，Prevotellaceae_NK3B31_group，和Clostridium_sensu_stricto_1的丰度。然而，AdAH的治疗增强了肠道内环境稳定，并显著减轻了摄入酒精引起的损伤。

为了确定摄入酒精或AdAH诱导的肠道菌群组成变化与血清/肝脏生化参数之间是否存在潜在的相关性，我们使用Spearman相关热图进行分析。图3J显示了肠道菌群与血清/肝脏生化参数之间正相关和负相关。血清/肝脏中的参数水平与几种细菌的丰度相关。例如，肝脏促炎因子TNF-α，IL-1β和IL-6与norank_f_Erysipelotrichaceae（r = 0.67，r = 0.73和r = 0.66），Clostridium_sensu_stricto_1（r = 0.76，r = 0.77和r = 0.77）和Coriobacteriaceae_UCG-002（r =0.63，r =0.59和r =0.68）呈显著正相关。TNF-α与Rikenella呈负相关（r = - 0.47）。IL-1β与Mucispirillum（r = - 0.50）、Ruminococcus（r = - 0.50）、Helicobacter（r = - 0.46）、Desulfovibrio（r = - 0.57）和Roseburia（r = - 0.49）呈负相关。IL-10为抗炎因子，与Muribaculum（r = 0.50）和Odoribacter（r = 0.58）呈正相关，与Turicibacter（r = - 0.63）和Clostridium_sensu_stricto_1（r = - 0.65）呈负相关。此外，MDA与norank_f_Erysipelotrichaceae（r = 0.78），Faecalibaculum（r = 0.65），Turicibacter（r = 0.48），Clostridium_sensu_stricto_1（r = 0.78）和Coriobacteriaceae_UCG-002（r = 0.68）呈正相关，与Ruminococcus（r = - 0.47）和norank_f_Coriobacteriales_Incertae_Sedis（r = - 0.52）呈负相关。同样，血清中ALT和AST与norank_f_Erysipelotrichaceae（r = 0.62和r = 0.71），Faecalibaculum（r = 0.51和r = 0.65），Clostridium_sensu_stricto_1（r = 0.77和r = 0.78）和Coriobacteriaceae_UCG-002（r = 0.58和r = 0.61）呈正相关。AST与Desulfovibrio呈负相关（r = - 0.47）。TG与norank_f_erysipelotricaceae（r = 0.79）、Faecalibaculum（r = 0.62）、Clostridium_sensu_stricto_1（r = 0.75）、Coriobacteriaceae_UCG-002（r = 0.75）呈正相关，与Mucispirillum（r = - 0.57）呈负相关。

图 3 AdAH调节酒精性肝损伤小鼠肠道菌群。（A、B、C、D）属水平的Shannon， Simpson， Ace和Chao指数；（E、F）PCA和PCoA评分图；（G、H）在门或属水平的群落丰度百分比；（I）NC、AL、AdAH组间差异显著性检验；（J）粪便肠道菌群中特定属的丰度与血清和肝脏参数的Spearman相关性分析。

6 AdAH 对酒精性肝损伤小鼠肝脏代谢组学特征的影响

为了进一步了解AdA对ALD小鼠肝脏生理反应的影响，基于LC-MS在正负离子模式下对肝脏进行了代谢谱分析。用PCA、PLS-DA和OPLS-DA对NC、AL和AdAH处理的小鼠进行区分，以寻找肝脏中潜在的生物标志物。PCA结果显示，三个QC样本的主成分得分非常接近，说明仪器稳定，得到的结果可靠（图4A和B）。在PCA评分图中，不同组的代谢谱明显分离，表明不同组的肝脏代谢谱存在显著差异。应用PLS-DA来揭示AdAH的干预效果。如图4C和D所示，无论在正离子还是负离子模式下，NC、AL和AdAH组都有明显的聚类现象。NC组和AL组之间有明显的分离，表明酒精灌胃后发生了明显的生化变化。AdAH组表现出较好的聚类趋势，这可能是AdAH的干预作用所致。采用OPLS-DA检测AL组与AdAH组间差异。通过OPLS-DA在正离子和负离子模式下的评分图，可以清楚地分离出不同组肝脏样本的代谢谱（图4E和F）。在正离子模式下，R²X、R²Y、q²的值分别为0.536、0.956、0.828，而在负离子模式下，R²X、R²Y、q²的值分别为0.51、0.953、0.779，表明该模型质量较好，可用于后续搜索分析组间差异。不同显著代谢物的相对丰度热图显示，AL和AdAH组之间部分代谢物的表达存在差异（图4G）。在正离子和负离子模式下，共有65种差异代谢物被选为潜在生物标志物，VIP值超过1.0，且各组之间存在显著差异（p < 0.05）。与AL组相比，AdAH组有15种代谢物显著上调，50种代谢物显著下调。大多数差异表达显著的代谢产物可分为氨基酸、脂肪酸、胆汁酸、醇类及衍生物。用基于KEGG的代谢分析进行不同肝脏代谢物的代谢途径富集分析，以确定受影响的重要代谢途径。KEGG拓扑分析了泛酸、辅酶A、氨酰-tRNA、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸、精氨酸生物合成和谷胱甘肽、抗坏血酸、醛固酮代谢及初级胆汁酸生物合成、牛磺酸和次牛磺酸代谢。与摄入酒精诱导的AL组小鼠相比，高剂量的AdA干预改变了脂肪酸降解、精氨酸和脯氨酸代谢的主要代谢途径（图4H）。图4I显示肝脏代谢物与血清/肝脏参数正相关和负相关。显然，血清/肝脏中炎症因子水平和抗氧化能力与肝脏的某些代谢物相关。例如，IL-10、SOD和GSH与sulfoglycolithocholate（2-）（r = - 0.72， r = - 0.52， and r = - 0.63）、3a，7a，12b-trihydroxy-5b-cholanoic acid（r = - 0.68， r = - 0.52， and r = - 0.64-）、piperidine（r = - 0.69， r = - 0.57， and r = - 0.60）和（E）-3-methylglutaconic acid（r = - 0.63， r = - 0.56， and r = - 0.68）呈负相关。但与glutathioneoxidized （r =0.70， r= 0.58，and r = 0.56）呈正相关。相反，TNF-α与glutathione oxidized（r = - 0.56）呈负相关，并与sulfoglycolithocholate（2-）（r = 0.52）、3a，7a，12b-trihydroxy-5b-cholanoic acid（r = 0.48）和（E）-3-methylglutaconic acid （r = 0.64）呈正相关。

图4 AdAH对酒精性肝损伤小鼠肝脏代谢组学特征的影响。（A、C、E）阳性模型（ESI+）的NC、AL和AdAH组PCA、PCoA和OPLA-DA评分图；（B、D、F）阴性模型（ESI）DE NC、AL、AdAH组PCA、PCoA和OPLA-DA评分图；（G）AL与AdAH组间显著不同代谢物相对丰度的热图（VIP > 1.0，p < 0.05）；（H）基于KEGG在线数据库的AL1和AdAH组之间的肝脏代谢途径影响预测；（I）肝代谢物与血清及肝脏参数的Spearman相关分析。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

7 酒精性肝损伤小鼠肠道菌群与肝脏代谢产物的相关性

通过计算Spearman相关系数，研究肠道菌群与肝脏代谢的关系。发现一些细菌与各种代谢物有很强的相关性（cor > 0.5或cor < 0.5），包括Faecalibaculum，norank_f_Erysipelotrichaceae，Lactobacillus，Muribaculum，Prevotellaceae_NK3B31_group，Ruminococcus，Turicibacter，Clostridium_sensu_stricto_1，Mucispirillum，Desulfovibrio，Parabacteroides和Helicobacter。在潜在的生物标志物方面，肌苷、牛磺酸、谷氨酸硫酮、氨基羟基丁酸、胆酸和L-赖氨酸也与肠道菌群密切相关。如图5所示，在属水平，Turicibacter和Clostridium_sensu_stricto_1与sulfoglycolithocholate（2-）、3a，7a，12b-trihydroxy-5b-cholanoic acid、cholic acid、7-ketodeoxycholic acid、l-valine、piperidine、osmundalactone、（E）-3-methylglutaconic acid、l-ornithine和3-buten-1-amine呈正相关，而与glutathione oxidized成负相关。Prevotellaceae_NK3B31_group、Ruminococcus、Muribaculum和Desulfovibri与gamma-aminobutryic acid和formimino-l-glutamic acid 呈正相关，与inosine和pantetheine 4′-phosphate呈负相关。但是，Faecalibaculum和norank_f_Erysipelotrichaceae与inosine和pantetheine 4′-phosphate呈正相关。Lactobacillus与1-deoxy-d-xylulose呈正相关而与无代谢物正相关。

图5 肠道微生物群中主要属的相对丰度与肝脏潜在生物标志物之间的相关性。红色方块代表正相关，蓝色方块代表负相关，白色方块代表不相关。*p < 0.05，**p< 0.01，***p < 0.001。

讨论

酒精性肝病（ALD）的发病率逐年上升。酒精摄入已成为导致肝病的主要因素之一。天然产品能够调节肠道菌群并保护肠道粘膜完整性，以降低肝损伤小鼠的氧化应激和炎症反应以及肠道通透性。樟芝菌丝体的乙醇提取物（富含马来酸/琥珀酸衍生物，特别是AdA）可以保护肝脏免受酒精损伤通过提高肝脏的抗氧化和抗炎能力以及维持肠道菌群的稳定性。然而，AdA对肠道菌群的作用机制及其与肝脏酒精代谢的关系仍不清楚；需要进一步的研究来揭示ALD小鼠肝脏代谢和肠道菌群之间的关系。因此，本研究从肝脏代谢组学和肠道微生物组水平研究了AdA对肝脏保护作用及其潜在机制。

血清ALT和AST活性的变化是反映肝细胞损伤程度最直观的生化参数。此外，酒精性肝病还表现为肝脏指数显著升高。结果表明AdA治疗显著降低了摄入酒精引起的ALT和AST升高。同时，被认为是酒精性肝病的指标之一的肝脏指数在酒精摄入后而显著增加，但是高剂量的AdA 使肝脏指数恢复到正常水平。H&E染色肝脏切片的组织学分析进一步证实了AdA的肝保护作用，AdA可以减轻酒精摄入后肝小叶破坏和肝细胞体积的增加，且呈剂量依赖性。上述数据充分表明， ALD小鼠模型成功建立，AdA可保护肝细胞免受饮酒所致的损伤。

越来越多的证据表明，饮酒也会改变脂质代谢。血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平被认为是与脂质代谢紊乱有关的主要指标。在本研究中，饮酒显著降低血清HDL-C水平，升高血清TC、TG和LDL-C水平。然而，摄入酒精显著增加的TC和TG的含量在给予高剂量AdA后恢复到正常水平。此外，这些血清生化参数与油红O染色肝切片的组织学观察一致，从中我们可以清楚地看到肝脂肪变性的显著改善，表明给予AdAH可以减轻酒精性肝损伤。然而，通过酒精摄入显著增加的TC和TG的含量在给予高剂量AdA后恢复到正常水平。此外，这些血清生化参数与油红O染色肝脏切片的组织学观察一致，可以清楚地看到肝脂肪变性的显著改善，表明给予AdAH可以减轻酒精性肝损伤。

在酒精性肝损伤中，炎症细胞因子异常表达，如促炎细胞因子（TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-17和IFN-γ）和抗炎细胞因子IL-10。NF-α不仅损伤肝细胞，但也刺激和诱导其他炎症细胞因子（如IL-1β和IL-6）的产生，从而引起肝细胞凋亡。AL组血清TNF-α， IL-1β，IL-17，IL-6和IFN-γ组水平显著提高，表明炎症因子参与了早期ALD。但是通过给予高剂量AdA，这些促炎细胞因子的表达恢复到正常水平。总的来说，AdA可以减少摄入酒精引起的肝脏炎症，高剂量似乎能有效地减少促炎细胞因子。

摄入酒精引起的氧化应激是ALD发生的关键机制之一。肝脏中乙醇的代谢可增加自由基（主要是活性氧，ROS）的含量，诱导氧化应激。诱导氧化应激。饮酒可降低SOD、GSH和GSH- px的水平，增加MDA水平，导致肝组织损伤。结果显示，AL组小鼠肝脏中MDA含量显著升高，SOD、GSH、GSH- px活性显著降低，表现出明显的氧化应激。而高剂量的AdA可以通过降低MDA的产生、提高抗氧化能力来缓解摄入酒精引起的氧化应激，这可能是其减缓ALD的机制之一。

过量饮酒会影响肠道菌群的组成和微生物失调，这被认为是酒精性肝病发展的主要原因。此外，肠道微生物群落的丰富性和多样性通常与健康的肠道有关。在本研究中，发现AdA可以调节摄入酒精引起的生物失调。高剂量AdA显著提高Simpson指数，降低Shannon、Ace和Chao指数，这些指标均受到酒精摄入的干扰。酒精摄入后，肠道菌群的厚壁菌门（Firmicutes）减少，拟杆菌门（Bacteroidota）增加。然而，这些影响被高剂量AdA治疗逆转，从而维持了肠道菌群的稳定性。同样，在属水平，摄入酒精降低了乳酸杆菌（Lactobacillus）的相对丰度。但高剂量的AdA治疗显著改善了这一效果。此外，AL组Clostridium_sensu_stricto_1群落丰度也显著增加。Clostridium_sensu_stricto_1的相对丰度与结肠炎症和肠道屏障显著相关，与小鼠结肠TLR4、TLR5和NF-κB的mRNA表达呈正相关，而与之相反，与小鼠结肠紧密连接蛋白（ZO-1和Occludin）的mRNA表达水平呈负相关。在本研究中，AdAH组Clostridium_sensu_stricto_1的丰度降低。此外，肠道微生物群与肝损伤参数之间的相关性分析表明，norank_f_Erysipelotrichaceae、Clostridium_sensu_stricto_1和Coriobacteriaceae_UCG-002丰度的增加导致肝脂肪变性指标（TG和MDA）和炎症指标（TNF-α、IL-1β和IL-6）水平升高。因此，这三个属可能与酒精性肝损伤和肝损伤参数的变化有关。综上所述，AdAH可以预防摄入酒精引起的肠道菌群紊乱，使肝脏脂肪变性指标和炎症参数恢复到正常水平

肝脏是酒精代谢和解毒的重要器官。肝脏通过多种功能，包括代谢产物的产生和肠肝循环，以及对通过门静脉接收的肠道细菌最终产物和营养物质的响应，在调节肠道微生物及其作用中发挥重要作用。在这项研究中，采用UPLC-QTOF/MS肝脏代谢标志物来说明AdA 干预对摄入酒精相关肝病的改善机制。对不同肝脏代谢产物的代谢途径富集分析表明，补充AdA可以调节泛酸、辅酶A、氨酰-tRNA、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸、精氨酸生物合成和谷胱甘肽、抗坏血酸、醛固酮代谢及初级胆汁酸生物合成、牛磺酸和次牛磺酸代谢等。

胆汁酸作为一种内源性信号分子，在肝脏中合成，分泌到胃肠道中，用于餐后营养物质的吸收和控制肠道微生物的过度生长。同时，肠道微生物代谢胆汁酸，这决定了循环胆汁酸组成，并调节宿主的代谢。酒精急性摄入患者表现出血清胆汁酸增加和胆汁淤积性肝损伤，摄入酒精增加胆汁酸池大小，减少胆汁酸流量和粪便排泄。胆汁酸及其衍生物是治疗炎性代谢疾病的有价值的治疗剂。此外，肝硬化和肝炎患者肝脏中的牛磺脱氧胆酸水平降低。在这项研究中，发现了3种与原发性胆汁酸生物合成相关的潜在生物标志物，包括牛磺脱氧胆酸、胆酸和别胆酸。而3种潜在的生物标志物在AdAH组中没有显示出显著的变化。结果表明AdA对酒精性肝损伤小鼠的初级胆汁酸生物合成和胆汁酸代谢无积极影响。

谷胱甘肽（GSH）是最丰富的细胞非蛋白硫醇，在维持氧化还原稳态中起着关键作用，并在抗氧化损伤方面起着重要作用。肝脏多种肝病中GSH水平在下降。GSH缺乏是多种机制的结果，包括营养缺乏、氧化应激和蛋氨酸代谢途径的半胱氨酸利用率降低。GSH缺乏被认为是促进酒精引起的脂肪毒性的关键致病因素。肝脏GSH水平降低会加剧和延续肝损伤。肝脏代谢组学结果显示，在AdA的干预下，肝脏中的S-（2-羟乙基）谷胱甘肽水平显著升高，而与GSH呈强负相关的（E）-3-甲基谷胱甘肽水平显著降低，这表明AdA可能通过调节肝脏中GSH的生物合成来改善酒精性肝损伤。肠道菌群和肝脏代谢物相关性分析也证实了这一结果。Clostrium_sensu_stricto_1和Turicibacter与GSH的氧化呈很强的负相关。高剂量的AdA抑制了由饮酒引起的Clostridium丰度的增加。因此，高剂量的AdA可能通过维持肠道Clostridium的稳定性来调节肝脏中GSH的生物合成。

此外，我们还发现，在AdAH组，肝脏代谢产物如如L- 抗坏血酸和牛磺酸增加。L-抗坏血酸通过减弱组织中抗氧化防御系统的破坏、GSH和一氧化氮的生成以及嗜中性粒细胞的浸润来保护小鼠应激的肝脏氧化损伤。抗坏血酸衍生物2-O-β-D-葡聚糖-L-抗坏血酸可调节小肠和结肠中的微生物群，并对环磷酰胺处理的小鼠产生免疫调节作用。牛磺酸通过降低肝脏氧化应激和中断酒精引起的肾脏炎症循环，对酒精性肝损伤小鼠产生保护作用。牛磺酸还能预防和修复ALD小鼠肝损伤，平衡肝脏脂质代谢指标。其机制可能与参与脂质代谢的相关酶和转录调控因子的调控有关。本研究中，LC-MS结果表明，在AdAH组升高L-抗坏血酸和牛磺酸水平，而在ALL组降低，表明抗坏血酸、牛磺酸和低牛磺酸代谢的代谢途径也在保护酒精性肝损伤中发挥积极作用。

AdA通过调节微生物和代谢组学反应，对酒精摄入引起的肝脏脂质积累、氧化应激、炎症和肝损伤产生积极影响。AdA恢复了肠道菌群组成，Lactobacillus和Dubosiella的相对丰度增加，Clostridium_sensu_stricto_1、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Prevotellaceae_NK3B31_group和Prevotellaceae_UCG-001的相对丰度降低。此外，AdA对摄入酒精引起的代谢紊乱有良好的调节作用，包括谷胱甘肽代谢（S-（2-羟乙基）谷胱甘肽和氧化谷胱甘肽）、抗坏血酸和L-抗坏血酸代谢、牛磺酸和低牛磺酸代谢。表明樟芝中活性成分AdA是一种治疗酒精摄入引起的微生物代谢紊乱的有益化合物。