聚焦行业发展:对干细胞低氧培养的总结和反思

2021
06/02

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干细胞者说
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撰文:东海先生

首发:间充质干细胞



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间充质干细胞 (MSCs) 作为细胞治疗领域应用最广泛的细胞类型,MSCs的产业规模化培养至关重要。如果低氧培养能明显提升MSCs的功能,为何世界大部分干细胞企业不采用低氧的培养方式?

本文对MSCs的低氧培养做一个总结,并尝试着去分析相关的原因,希望对干细胞行业的发展有一点点的帮助。 从文章发表的数量来看,2018年达到巅峰后,研究低氧对MSCs的影响的文章数量开始回落,似乎热点逐渐褪去。


1

低氧环境下MSCs的代谢变化

供氧不足,后果很严重


氧气很重要,没有了氧气,任何细胞都活不了,人也活不了。所以,如果有文章证明无氧培养能促进MSCs的功能和疗效,大可不必较真。很简单,没有氧气,细胞都活不了,还能指望无氧的MSCs功能更强大?这就很魔幻了。


正常细胞在氧气充足的条件下,主要通过氧化磷酸化产生ATP;在无氧条件下,细胞只能通过糖酵解产生ATP。ATP是细胞能量的最主要来源,给细胞的功能提供了能量供应的保证。MSCs也不例外,在供氧不足的情况,细胞依然需要ATP来支撑生理功能,故而能量代谢由三羧酸循环供能转向糖酵解供能,葡萄糖消耗和相应的乳酸产生显著增加,但是细胞内ATP浓度降低[1-3]

所以,每个细胞对周围环境中氧浓度的变化都很敏感。氧浓度的变化代表了一种生理刺激,低氧能触发了细胞内的某些机制,这些机制要么导致细胞死亡,要么导致细胞适应新的环境条件[4]。与缺氧相关的另一个关键因素是氧化应激增加,这可能导致线粒体功能障碍。ROS形成的增强可能是由于低氧条件下氧化应激酶NAD(P)H氧化酶的表达增加,同时内源性清道夫SOD的减少将导致过氧化氢在细胞内积累,对细胞产生有害影响[5, 6]。短期缺氧引起MSC线粒体跨膜电位显著降低,并导致细胞色素c的释放和caspase-3的激活,启动细胞凋亡程序导致出现细胞凋亡[7, 8]

细胞如何感知氧分压

作为调节细胞对缺氧反应的关键分子,缺氧诱导因子-1(HIF-1)的诱导表达是细胞面对低氧环境下的非常重要的适应性反应[9]。缺氧诱导因子-1是由一个结构性表达的HIF-1β亚基和一个受高度调控的HIF-1α亚基组成的异源二聚体,HIF-1α的合成是通过氧不依赖机制调节的,而其降解是氧依赖的[10]

HIF通过缺氧反应元件(HRE)为调控基序来调控多种基因的表达[11]。在HIF靶基因中,启动子或增强子中含有HRE的基因是直接靶基因,其余的被认为是间接靶基因。HIF靶基因参与不同的细胞功能,包括新陈代谢、炎症、激素调节等,尤其是影响体重增加和代谢障碍(如胰岛素抵抗)[12]


其实,成年人骨髓MSCs在正常氧条件下也有表达HIF-1mRNA,,但其mRNA通常被HIF脯氨酰4-羟化酶完全降解,而且其表达量大约是儿童骨髓和脐血MSCs的40%;MSCs在常氧条件下高表达HIF-1,常伴随着糖酵解的增加[13]

HIF-1改变线粒体功能,抑制线粒体呼吸,促进了糖酵解,即通过上调丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK1),使得丙酮酸脱氢酶(PDH)失活,从而抑制了乙酰辅酶A向三羧酸循环和线粒体呼吸的输送[14-16]。所以,HIF-1会导致细胞没法高效地产生大量ATP。


简而言之,MSCs感知到氧分压不足,为了适应低氧的环境(就是为了活命),细胞表达的HIF-1α亚基,而且让HIF-1迁移至细胞核内,参与一些列的基因转录,能量代谢途径切换到低效率产出ATP的糖酵解途径,最终的结果就是MSCs在能量ATP相对不足的情况影响了自身的功能。比如,1%的氧浓度下培养的MSCs,虽然细胞周期和细胞增殖的相关基因上调了,但是其线粒体、能量和代谢、抗氧化功能相关的基因表达均出现下调[17]


2

MSCs在低氧下截然相反的实验结果

大量研究表明,在低氧(1-5%)条件下持续培养的MSCs通常表现出增强的增殖潜能和很好地维持了MSCs的干性[3, 18-23]。体外低氧预适应(2%-5%)可保持同质性和分化潜能,延缓细胞衰老过程,增加MSCs趋化因子受体表达[24]。在低氧(1%)中培养24小时后,观察到MSCs的抗凋亡蛋白Survivin的水平增加[25]。虽然低氧环境还能增加DNA基因组的稳定性和克隆形成能力[26] 


比如,有实验数据证明低氧培养MSCs是治疗缺血性疾病如缺血性卒中、心肌梗死和后肢缺血等提高疗效的有效策略[27-29]。理论上,低氧培养对年老的MSCs确实有帮助,因为年老小鼠脂肪MSCs的促血管生成能力下降,而低氧能诱导HIF-1的表达,HIF-1促进了VEGF的表达,所以低氧环境能稍微挽救这种式微的功能[30]。低氧预处理也被证明可以增加MSCs的旁分泌活性,增强MSC治疗心梗后的修复[31],并且不会增加心律失常并发症的发生率[32]。


IFN-γ可以增强MSCs的抗炎和治疗纤维化的能力,促进自身存活;低氧诱导MSC细胞对低氧的适应,包括上调参与无氧代谢、自噬、血管生成和细胞迁移的蛋白质;IFN-γ和低氧培养的叠加,理论上有助于提高MSCs的治疗功能[33]


对MSCs低氧预处理的详细机制,包括以下几个方面[34, 35]

  • 迁移能力增强。低氧环境培养MSCs,能增强MSCs的迁移趋化能力[5, 28, 36-40]。MSCs暴露于低氧可显著增加CXCR4的表达,由于缺血后其配体SDF-1的高表达,CXCR4有利于向靶组织迁移[41-43]

  • 生存能力增强。在缺氧环境激活MSCs的Akt,从而促进HGF及其受体c-Met和抗凋亡因子Bcl-2的表达,增强MSCs在缺血组织中存活能力[28, 34]

  • 自分泌和旁分泌功能增强。低氧可明显诱导骨髓MSCs分泌大量的血管生成、抗炎细胞因子和外泌体,如VEGF、FGF-2、HGF、IGF-1、Ang-1和EPO[38, 44-47]

  • 促血管新生能力得到增强。低氧诱导MSCs后,MSCs的Wnt4表达的大幅增加,促血管生成的效果更优;如果抑制MSCs中Wnt4的表达,则消除了缺氧诱导的MSCs在小鼠后肢缺血模型中的血管再生特性[27]


非主流:低氧和常氧区别不大


虽然前面提到低氧提高了MSCs的增殖速度,但是也有不少实验证明MSC在常氧和低氧环境下的增殖速度没有差异[26, 30, 48, 49]


在低氧(2%)条件下培养几周后,MSC的增殖才能显著增加,才会引起代谢途径和组织形成过程的显著改变,从而增加多能性相关基因的增殖和表达[18]。也有实验证明大鼠骨髓MSC在低氧(1%)环境下培养3天,MSC的活性也出现降低,然后再升高[6]。相反,也有数据证明,在长期(10天)的低氧培养中,MSC的增殖速度明显慢于常氧培养的MSCs[50]


不同的细胞接种密度,人骨髓MSCs在低氧(1%)环境下培养,10天内的增殖速度和克隆形成能力,均不如常氧环境[36]。原代培养的MSCs,与常氧条件下形成的克隆相比,在缺氧条件下的克隆形成能力明显降低,克隆团数量更少和体积更小[22]。也有团队发现常氧和低氧(2%)培养的MSCs,克隆形成数量没有差异,但是低氧条件下的克隆体积小很多[49]


前面讲到低氧提高了MSCs表达趋化受体CXCR4的水平,从而促进了MSCs的迁移趋化能力[41-43]。但是也有实验证明低氧却抑制了小鼠骨髓MSCs的趋化受体CXCR4的基因表达[51]。甚至,早在2004年blood杂志就有文章证明只有极少部分的MSCs表达CXCR4受体[52]。本小编也曾经用流式细胞仪检测过MSCs是否表达CXCR4膜受体,结果也是发现MSCs较低表达或者不表达的CXCR4膜受体。有条件的实验室,可以随时检测一下MSCs的CXCR4膜受体的表达量。虽然有体外培养实验发现,低氧培养能抑制MSCs的复制性衰老[53

]


然而,身体整体处于低氧状态,比如慢性缺氧的发绀型先天性心脏病患者和低氧大鼠模型,体内骨髓的MSCs却出现明显的衰老,同时伴随着体内D-半乳糖的堆积[54]。协和阜外医院心血管疾病国家重点实验室团队,至少证明了体内的低氧并不能促进患者骨髓MSCs的增殖和提高抗凋亡能力。


美国的团队分析了特发性肺纤维化患者的BMSCs,也发现患者BMSCs出现明显的衰老,伴随着DNA损伤、线粒体功能下降和迁移能量下降[55]。慢性缺血性心脏病患者,其骨髓干细胞(指的是BMNC)出现衰老明显增加,同时伴随着克隆形成能力和血管新生能力下降、端粒长度的缩短[56, 57]。虽然人体整体低氧的情况比培养的低氧复杂很多,但是至少说明了体内低氧和促进体内的MSCs增殖没有很强的关联性,反而观察到体内的低氧损伤了BMSCs的功能。


在缺氧的MSCs培养过程中,谷氨酸主要是由转氨酶而不是谷氨酸脱氢酶代谢的[58]。转氨作用不会导致谷氨酸代谢产生氨,这可能对细胞有利,因为氨和乳酸对培养中的MSCs有一定的抑制增殖的作用[59]。而且长时间的缺氧会促进MSCs增加单羧酸转运蛋白4的表达,从而降低MSC的心血管修复功能[60]


所以有专家认为,缺氧对MSCs行为的影响是双相的[61]。急性短期缺氧可引起细胞损伤,包括MSCs细胞凋亡;随着低氧暴露时间的延长,MSCs迅速适应微环境,将代谢转变为无氧糖酵解,同时维持未分化的多潜能状态。



3

不可忽视的关键因素:葡萄糖浓度

如前所述,能量代谢转向无氧糖酵解,葡萄糖消耗和相应的乳酸产生显著增加,但是细胞内ATP浓度降低[1-3]。细胞在培养基中主要的代谢原料来源是糖,所以事实上,MSCs在长期缺氧中的存活和功能取决于培养基中的葡萄糖含量[2]


那么,培养基中的葡萄糖含量达到什么浓度,才是有利于MSCs增殖的最佳浓度?这个问题依然在等待着科学家的研究。根据本小编的经验,高糖培养基更有利于MSCs的培养。


4

MSCs工业化培养,低氧是否必要

完全不同于实验室采用的细胞培养,MSCs的工业化大规模培养需要讲究规模化、高效化和低成本。


低氧培养箱和常氧培养的培养箱不一样。要满足低氧的条件,就需要用到氮气(N2)来降低氧气的浓度,且氮气消耗速度远快于CO2的消耗速度。所以,氮气的频繁补充,造成MSCs的培养成本远高于常规培养的方式。目前大部分的干细胞公司,都不采用低氧培养模式,估计是低氧培养成本高,且增加了麻烦。


有意思的是,在肝癌细胞株,HIF-1α并不完全是由缺氧引起的,常氧状态下胰岛素和IL-1等肽可以激活HIF-1的表达[62]。MSCs同样存在类似的生理现象。比如,血管紧张素II上调大鼠骨髓MSCs中HIF-1α的表达,从而通过ERK1/2和Akt信号通路增加VEGF的表达[63]。那么,这就给偏好于低氧培养方式的企业提供了一个省事的解决方案。



5

结束语

为何研究人员开始探索低氧培养MSCs?


这个问题不好回答。估计是在常氧条件下,养不好MSCs,即MSCs的增殖速度慢,快速出现复制性衰老,细胞功能又偏弱,所以想解决“养不好MSCs”的这个问题。或者说,想养质量更好的MSCs。


从公开的统计分析数据来看,有部分国外公司培养的MSCs明显存在纯度不够的问题,因为细胞表面标记物并不符合MSCs的定义标准。

人体内的细胞微环境中,氧浓度肯定远低于空气中的氧浓度,所以研究人员很自然而然地想到了降低氧浓度来培养MSCs,看看能否促进MSCs的增殖。


那么,体内MSCs存在的微环境中,氧分压是多少?

2014年,Nature 杂志发表的文章,证明骨髓腔里面的干细胞微环境的氧分压约1.3%,而脂肪组织中的最低氧分压相当于6.5%[64]。那么针对骨髓来源MSC是和脂肪来源MSCs的培养体系选择了相同的氧分压,是否合理?需要进一步研究不同组织来源的MSCs所需的不同氧分压培养方案[65]


本小编曾经一直很认可低氧提升MSCs功能的主流观点,但是总感觉在常识上有一丝丝的疑虑。如果低氧促进MSCs的增殖和迁移趋化能力,那么人为地制造低氧环境,岂不是就可以大量促进体内MSCs的增殖来修复自己的身体?实际上,心衰患者和肺炎患者,身体都是处于比正常情况还低氧的状态,如果低氧能促进体内MSC增殖的话,为何这些患者的自身修复功能没有体现出来?人的劳动需要能量来支撑,细胞的功能同样需要能量来支撑。细胞的能量就是ATP。在低氧环境下培养,MSCs产生ATP减少,MSCs的功能难免会有所下降,那么如何理解和解释“ATP产生减少,但是MSCs的功能得到增强”的实验数据?MSCs的功能与ATP的关联性?促进MSCs增殖和让MSC依然是通过氧化磷酸化来产生ATP的最佳浓度是多少?


当我们面对完全相反的实验结果时,不能简单地归因于实验方案设计的差异,更应该静下心来,从基础理论知识入手,根据基础理论知识(比如细胞生物学和生物化学的教材)来分析和解释这些实验结果,从而判断什么样实验结果更有可能接近科学的真相。

 








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关键词:
MSCs,干细胞,ATP,低氧,增殖,骨髓,浓度

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