聚焦行业发展：对干细胞低氧培养的总结和反思

撰文：东海先生

首发：间充质干细胞

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低氧环境下MSCs的代谢变化

氧气很重要，没有了氧气，任何细胞都活不了，人也活不了。所以，如果有文章证明无氧培养能促进MSCs的功能和疗效，大可不必较真。很简单，没有氧气，细胞都活不了，还能指望无氧的MSCs功能更强大？这就很魔幻了。

正常细胞在氧气充足的条件下，主要通过氧化磷酸化产生ATP；在无氧条件下，细胞只能通过糖酵解产生ATP。ATP是细胞能量的最主要来源，给细胞的功能提供了能量供应的保证。MSCs也不例外，在供氧不足的情况，细胞依然需要ATP来支撑生理功能，故而能量代谢由三羧酸循环供能转向糖酵解供能，葡萄糖消耗和相应的乳酸产生显著增加，但是细胞内ATP浓度降低[1-3]。

所以，每个细胞对周围环境中氧浓度的变化都很敏感。氧浓度的变化代表了一种生理刺激，低氧能触发了细胞内的某些机制，这些机制要么导致细胞死亡，要么导致细胞适应新的环境条件[4]。与缺氧相关的另一个关键因素是氧化应激增加，这可能导致线粒体功能障碍。ROS形成的增强可能是由于低氧条件下氧化应激酶NAD(P)H氧化酶的表达增加，同时内源性清道夫SOD的减少将导致过氧化氢在细胞内积累，对细胞产生有害影响[5, 6]。短期缺氧引起MSC线粒体跨膜电位显著降低，并导致细胞色素c的释放和caspase-3的激活，启动细胞凋亡程序导致出现细胞凋亡[7, 8]。

作为调节细胞对缺氧反应的关键分子，缺氧诱导因子-1（HIF-1）的诱导表达是细胞面对低氧环境下的非常重要的适应性反应[9]。缺氧诱导因子-1是由一个结构性表达的HIF-1β亚基和一个受高度调控的HIF-1α亚基组成的异源二聚体，HIF-1α的合成是通过氧不依赖机制调节的，而其降解是氧依赖的[10]。

HIF通过缺氧反应元件（HRE）为调控基序来调控多种基因的表达[11]。在HIF靶基因中，启动子或增强子中含有HRE的基因是直接靶基因，其余的被认为是间接靶基因。HIF靶基因参与不同的细胞功能，包括新陈代谢、炎症、激素调节等，尤其是影响体重增加和代谢障碍（如胰岛素抵抗）[12]。

其实，成年人骨髓MSCs在正常氧条件下也有表达HIF-1mRNA，，但其mRNA通常被HIF脯氨酰4-羟化酶完全降解，而且其表达量大约是儿童骨髓和脐血MSCs的40%；MSCs在常氧条件下高表达HIF-1，常伴随着糖酵解的增加[13]。

HIF-1改变线粒体功能，抑制线粒体呼吸，促进了糖酵解，即通过上调丙酮酸脱氢酶激酶1（PDK1），使得丙酮酸脱氢酶（PDH）失活，从而抑制了乙酰辅酶A向三羧酸循环和线粒体呼吸的输送[14-16]。所以，HIF-1会导致细胞没法高效地产生大量ATP。

简而言之，MSCs感知到氧分压不足，为了适应低氧的环境（就是为了活命），细胞表达的HIF-1α亚基，而且让HIF-1迁移至细胞核内，参与一些列的基因转录，能量代谢途径切换到低效率产出ATP的糖酵解途径，最终的结果就是MSCs在能量ATP相对不足的情况影响了自身的功能。比如，1%的氧浓度下培养的MSCs，虽然细胞周期和细胞增殖的相关基因上调了，但是其线粒体、能量和代谢、抗氧化功能相关的基因表达均出现下调[17]。

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MSCs在低氧下截然相反的实验结果

大量研究表明，在低氧（1-5%）条件下持续培养的MSCs通常表现出增强的增殖潜能和很好地维持了MSCs的干性[3, 18-23]。体外低氧预适应（2%-5%）可保持同质性和分化潜能，延缓细胞衰老过程，增加MSCs趋化因子受体表达[24]。在低氧（1%）中培养24小时后，观察到MSCs的抗凋亡蛋白Survivin的水平增加[25]。虽然低氧环境还能增加DNA基因组的稳定性和克隆形成能力[26]。 

比如，有实验数据证明低氧培养MSCs是治疗缺血性疾病如缺血性卒中、心肌梗死和后肢缺血等提高疗效的有效策略[27-29]。理论上，低氧培养对年老的MSCs确实有帮助，因为年老小鼠脂肪MSCs的促血管生成能力下降，而低氧能诱导HIF-1的表达，HIF-1促进了VEGF的表达，所以低氧环境能稍微挽救这种式微的功能[30]。低氧预处理也被证明可以增加MSCs的旁分泌活性，增强MSC治疗心梗后的修复[31]，并且不会增加心律失常并发症的发生率[32]。

IFN-γ可以增强MSCs的抗炎和治疗纤维化的能力，促进自身存活；低氧诱导MSC细胞对低氧的适应，包括上调参与无氧代谢、自噬、血管生成和细胞迁移的蛋白质；IFN-γ和低氧培养的叠加，理论上有助于提高MSCs的治疗功能[33]。

对MSCs低氧预处理的详细机制，包括以下几个方面[34, 35]：

• 迁移能力增强。低氧环境培养MSCs，能增强MSCs的迁移趋化能力[5, 28, 36-40]。MSCs暴露于低氧可显著增加CXCR4的表达，由于缺血后其配体SDF-1的高表达，CXCR4有利于向靶组织迁移[41-43]。

• 生存能力增强。在缺氧环境激活MSCs的Akt，从而促进HGF及其受体c-Met和抗凋亡因子Bcl-2的表达，增强MSCs在缺血组织中存活能力[28, 34]。

• 自分泌和旁分泌功能增强。低氧可明显诱导骨髓MSCs分泌大量的血管生成、抗炎细胞因子和外泌体，如VEGF、FGF-2、HGF、IGF-1、Ang-1和EPO[38, 44-47]。

• 促血管新生能力得到增强。低氧诱导MSCs后，MSCs的Wnt4表达的大幅增加，促血管生成的效果更优；如果抑制MSCs中Wnt4的表达，则消除了缺氧诱导的MSCs在小鼠后肢缺血模型中的血管再生特性[27]。

虽然前面提到低氧提高了MSCs的增殖速度，但是也有不少实验证明MSC在常氧和低氧环境下的增殖速度没有差异[26, 30, 48, 49]。

在低氧（2%）条件下培养几周后，MSC的增殖才能显著增加，才会引起代谢途径和组织形成过程的显著改变，从而增加多能性相关基因的增殖和表达[18]。也有实验证明大鼠骨髓MSC在低氧（1%）环境下培养3天，MSC的活性也出现降低，然后再升高[6]。相反，也有数据证明，在长期（10天）的低氧培养中，MSC的增殖速度明显慢于常氧培养的MSCs[50]。

不同的细胞接种密度，人骨髓MSCs在低氧（1%）环境下培养，10天内的增殖速度和克隆形成能力，均不如常氧环境[36]。原代培养的MSCs，与常氧条件下形成的克隆相比，在缺氧条件下的克隆形成能力明显降低，克隆团数量更少和体积更小[22]。也有团队发现常氧和低氧（2%）培养的MSCs，克隆形成数量没有差异，但是低氧条件下的克隆体积小很多[49]。

前面讲到低氧提高了MSCs表达趋化受体CXCR4的水平，从而促进了MSCs的迁移趋化能力[41-43]。但是也有实验证明低氧却抑制了小鼠骨髓MSCs的趋化受体CXCR4的基因表达[51]。甚至，早在2004年blood杂志就有文章证明只有极少部分的MSCs表达CXCR4受体[52]。本小编也曾经用流式细胞仪检测过MSCs是否表达CXCR4膜受体，结果也是发现MSCs较低表达或者不表达的CXCR4膜受体。有条件的实验室，可以随时检测一下MSCs的CXCR4膜受体的表达量。虽然有体外培养实验发现，低氧培养能抑制MSCs的复制性衰老[53

]。

然而，身体整体处于低氧状态，比如慢性缺氧的发绀型先天性心脏病患者和低氧大鼠模型，体内骨髓的MSCs却出现明显的衰老，同时伴随着体内D-半乳糖的堆积[54]。协和阜外医院心血管疾病国家重点实验室团队，至少证明了体内的低氧并不能促进患者骨髓MSCs的增殖和提高抗凋亡能力。

美国的团队分析了特发性肺纤维化患者的BMSCs，也发现患者BMSCs出现明显的衰老，伴随着DNA损伤、线粒体功能下降和迁移能量下降[55]。慢性缺血性心脏病患者，其骨髓干细胞（指的是BMNC）出现衰老明显增加，同时伴随着克隆形成能力和血管新生能力下降、端粒长度的缩短[56, 57]。虽然人体整体低氧的情况比培养的低氧复杂很多，但是至少说明了体内低氧和促进体内的MSCs增殖没有很强的关联性，反而观察到体内的低氧损伤了BMSCs的功能。

在缺氧的MSCs培养过程中，谷氨酸主要是由转氨酶而不是谷氨酸脱氢酶代谢的[58]。转氨作用不会导致谷氨酸代谢产生氨，这可能对细胞有利，因为氨和乳酸对培养中的MSCs有一定的抑制增殖的作用[59]。而且长时间的缺氧会促进MSCs增加单羧酸转运蛋白4的表达，从而降低MSC的心血管修复功能[60]。

所以有专家认为，缺氧对MSCs行为的影响是双相的[61]。急性短期缺氧可引起细胞损伤，包括MSCs细胞凋亡；随着低氧暴露时间的延长，MSCs迅速适应微环境，将代谢转变为无氧糖酵解，同时维持未分化的多潜能状态。

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不可忽视的关键因素：葡萄糖浓度

如前所述，能量代谢转向无氧糖酵解，葡萄糖消耗和相应的乳酸产生显著增加，但是细胞内ATP浓度降低[1-3]。细胞在培养基中主要的代谢原料来源是糖，所以事实上，MSCs在长期缺氧中的存活和功能取决于培养基中的葡萄糖含量[2]。

那么，培养基中的葡萄糖含量达到什么浓度，才是有利于MSCs增殖的最佳浓度？这个问题依然在等待着科学家的研究。根据本小编的经验，高糖培养基更有利于MSCs的培养。

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MSCs工业化培养，低氧是否必要

完全不同于实验室采用的细胞培养，MSCs的工业化大规模培养需要讲究规模化、高效化和低成本。

低氧培养箱和常氧培养的培养箱不一样。要满足低氧的条件，就需要用到氮气（N2）来降低氧气的浓度，且氮气消耗速度远快于CO2的消耗速度。所以，氮气的频繁补充，造成MSCs的培养成本远高于常规培养的方式。目前大部分的干细胞公司，都不采用低氧培养模式，估计是低氧培养成本高，且增加了麻烦。

有意思的是，在肝癌细胞株，HIF-1α并不完全是由缺氧引起的，常氧状态下胰岛素和IL-1等肽可以激活HIF-1的表达[62]。MSCs同样存在类似的生理现象。比如，血管紧张素II上调大鼠骨髓MSCs中HIF-1α的表达，从而通过ERK1/2和Akt信号通路增加VEGF的表达[63]。那么，这就给偏好于低氧培养方式的企业提供了一个省事的解决方案。

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结束语

为何研究人员开始探索低氧培养MSCs？

这个问题不好回答。估计是在常氧条件下，养不好MSCs，即MSCs的增殖速度慢，快速出现复制性衰老，细胞功能又偏弱，所以想解决“养不好MSCs”的这个问题。或者说，想养质量更好的MSCs。

从公开的统计分析数据来看，有部分国外公司培养的MSCs明显存在纯度不够的问题，因为细胞表面标记物并不符合MSCs的定义标准。

人体内的细胞微环境中，氧浓度肯定远低于空气中的氧浓度，所以研究人员很自然而然地想到了降低氧浓度来培养MSCs，看看能否促进MSCs的增殖。

那么，体内MSCs存在的微环境中，氧分压是多少？

2014年，Nature 杂志发表的文章，证明骨髓腔里面的干细胞微环境的氧分压约1.3%，而脂肪组织中的最低氧分压相当于6.5%[64]。那么针对骨髓来源MSC是和脂肪来源MSCs的培养体系选择了相同的氧分压，是否合理？需要进一步研究不同组织来源的MSCs所需的不同氧分压培养方案[65]。

本小编曾经一直很认可低氧提升MSCs功能的主流观点，但是总感觉在常识上有一丝丝的疑虑。如果低氧促进MSCs的增殖和迁移趋化能力，那么人为地制造低氧环境，岂不是就可以大量促进体内MSCs的增殖来修复自己的身体？实际上，心衰患者和肺炎患者，身体都是处于比正常情况还低氧的状态，如果低氧能促进体内MSC增殖的话，为何这些患者的自身修复功能没有体现出来?人的劳动需要能量来支撑，细胞的功能同样需要能量来支撑。细胞的能量就是ATP。在低氧环境下培养，MSCs产生ATP减少，MSCs的功能难免会有所下降，那么如何理解和解释“ATP产生减少，但是MSCs的功能得到增强”的实验数据？MSCs的功能与ATP的关联性？促进MSCs增殖和让MSC依然是通过氧化磷酸化来产生ATP的最佳浓度是多少？

当我们面对完全相反的实验结果时，不能简单地归因于实验方案设计的差异，更应该静下心来，从基础理论知识入手，根据基础理论知识（比如细胞生物学和生物化学的教材）来分析和解释这些实验结果，从而判断什么样实验结果更有可能接近科学的真相。