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南京农业大学 | NPJ BIOFILMS MICROBI：土壤微生物群操纵对青枯菌和尖孢镰刀菌的直接和可能的间接抑制作用

2021

05/31

微生态

A-

A+

我们通过土壤熏蒸模拟了干扰作用，并研究了生物有机和有机改良剂的后续应用如何重塑土壤微生物群落的分类和功能潜力，以抑制番茄单作中的病原菌青枯菌和尖孢镰刀菌。

编译：微科盟阿Z，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载。

导读

土壤微生物群操纵可以通过提高土壤抵抗病原菌侵袭或从病原菌侵袭中恢复的能力来潜在地减少杀虫剂的使用，从而产生自然的抑制性。我们通过土壤熏蒸模拟了干扰作用，并研究了生物有机和有机改良剂的后续应用如何重塑土壤微生物群落的分类和功能潜力，以抑制番茄单作中的病原菌青枯菌和尖孢镰刀菌。单独使用有机改良剂在细菌和真菌群落组成中引起较小的变化，而没有抑制作用。熏蒸直接降低了尖孢镰刀菌的数量，并引起土壤微生物群的剧烈变化。由于有机改良剂的应用，这进一步从一种有利于土壤微生物群抑制的疾病转变而来，影响了细菌和真菌群落的重组方式。这些直接和可能的间接影响导致了很高的疾病控制率，为控制由多种病原菌引起的疾病提供了一种很有希望的策略。

论文ID

原名：Soil microbiome manipulation triggers direct and possible indirect suppression against Ralstonia solanacearum and Fusarium oxysporum

译名：土壤微生物群操纵对青枯菌和尖孢镰刀菌的直接和可能的间接抑制作用

期刊：npj Biofilms and Microbiomes

IF：7.067

发表时间：2021.4.12

通讯作者：李荣

通讯作者单位：南京农业大学教育部资源节约型肥料工程中心，植物免疫重点实验室

实验设计

团队在江苏省南京市横溪镇（32°02′N，118°50′E）进行了野外实验。实验于2014年3月至2015年6月连续进行了三个田间季节，其中2014年两个季节，2015年一个季节。田间实验包括4个处理：CKOF，在未熏蒸（CK）土壤中施用0.3 kg/m²有机肥（OF）；CKBF，在未熏蒸土壤上施用0.3 kg/m²生物有机肥（BF）；FOF，在熏蒸（F）土壤中施用0.3 kg/m²有机肥；和FBF，在熏蒸土壤中施用0.3 kg/m²生物有机肥。每个处理有三个随机独立重复区，每个重复区包含40株番茄植株。熏蒸采用0.15 kg/m²碳酸氢铵和0.15 kg/m²石灰混合熏蒸，施用熏蒸剂后，所有处理在施肥前用塑料薄膜覆盖15天。施肥方式为：鸡粪堆肥（N：2.0%，P：0.9%，K：0.9%）和生物有机肥（N：2.2%，P：1.0%，K：1.0%）分别施用于OF和BF。我们用无机肥来补偿这两种肥料之间的养分差异。将淀粉溶解芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens T-5⁶³）以1:4（dw/dw）的比例接种到菜籽粕和鸡粪的有机混合物中进行固态发酵生产生物有机肥。在此基础上，测定番茄病发病率、土壤化学成分和微生物变化。

结果

1 不同处理间的发病率

各季节不同处理间熏蒸处理后番茄枯萎病发病率显著低于不熏蒸处理（F_ANOVA = 188.8，p < 0.001；图1），与未熏蒸处理（CKOF、CKBF；97%-100%）相比，熏蒸处理（FOF、FBF）的发病率为33%-48%。2015年获得的结果与2014年春季观察到的结果一致（补充图2）。此外，方差分解分析（VPA）显示，熏蒸对病害控制的贡献率为100%，不同类型的有机改良剂只有1.18%的贡献率（补充图3）。由于难以区分每种病原菌引起的疾病症状，且发病率往往与病原菌密度显著相关，因此本研究利用qPCR技术检测青枯菌和尖孢镰刀菌的丰度来表征熏蒸和生物有机肥的潜在防治效果。

图1. 2015年春季番茄移栽3个月后枯萎病的结果。CKOF：在未熏蒸土壤中施用有机肥；CKBF：在未熏蒸土壤中施用生物有机肥；FOF：在熏蒸土壤中施用有机肥；FBF：在熏蒸土壤中施用生物有机肥。所有值都是三次重复的平均值，误差棒表示平均值的标准偏差。带有不同字母的条柱表示Tukey检验定义的四种处理方法之间的显著差异（p < 0.05）。

2 病原菌丰度及其在不同隔室的关系

通过qPCR定量测定病原菌丰度，揭示了取决于病原菌的复杂模式。关于青枯菌的丰度，我们在种植前熏蒸和未熏蒸的土壤样品之间没有观察到显著差异（t检验，p = 0.611），而在收获期间（熏蒸处理FOF和FBF）在总体（t检验，p = 0.005）和根际（t检验，p < 0.001）的土壤样品中观察到显著较低的丰度（图2a）。对于尖孢镰刀菌，种植前的熏蒸处理（FOF和FBF）后可见丰度明显较低（t检验，p < 0.001），这一趋势在收获时的非根际土壤（t检验，p < 0.001）和根际（t检验，p < 0.001）中持续存在（图2a）。此外，青枯菌丰度在移栽前和收获期之间没有显著的相关性，而尖孢镰刀菌则能观察到显著的相关性（图2b）。最后，在收获时的根际，qPCR和MiSeq测序的结果都表明青枯菌（p_（丰度） < 0.001，p_{（相对丰度）} = 0.001）和尖孢镰刀菌（p_（丰度） < 0.001，p_{（相对丰度）} < 0.001）与发病率相关（补充图4）。所测量的土壤性质均不影响青枯菌和尖孢镰刀菌的丰度（p > 0.05；表1）。

图2. 非根际和根际土壤青枯菌和尖孢镰刀菌的定量PCR检测结果。a 青枯菌和尖孢镰刀菌数量丰富。b 不同隔室两种病原菌丰度的相关性。CKOF：在未熏蒸土壤中施用有机肥；CKBF：在未熏蒸土壤中施用生物有机肥；FOF：在熏蒸土壤中施用有机肥；FBF：在熏蒸土壤中施用生物有机肥。用不同的字母表示根据Tukey检验定义的四个处理之间的显著差异（p < 0.05）。

表1. 土壤性质与两种病原菌丰度的偏相关检验

3 微生物丰度、多样性及其与发病率的关系

对于细菌，尽管种植前和收获期间FOF在非根际土壤中观察到明显更高的细菌丰富度（观察到的物种数量）和多样性（Shannon），但收获期间在根际样品中没有观察到显著的细菌丰度、丰富度和多样性（图3a）。对于真菌，在种植前的熏蒸（FOF和FBF）处理和收获时非根际土壤中，真菌的丰度、丰富度和多样性都有所降低。然而，在根际，只有FBF的丰富度和多样性显着低于其他处理方式（图3b）。根际微生物群与发病率间的相关性表明，真菌丰富度（r = 0.712，p = 0.001）和多样性（r = 0.480，p = 0.037）与发病率呈正相关，与真菌丰度（r = -0.158，p = 0.506）、细菌丰度（r = 0.434，p = 0.056）、细菌丰富度（r = 0.017，p = 0.944）或细菌多样性（r = -0.167，p = 0.482）无显著相关性（补充图4）。

图3. 丰度、丰富度（sobs）和多样性（Shannon）指数的箱型图。a细菌群落；b真菌群落。CKOF：在未熏蒸土壤中施用有机肥；CKBF：在未熏蒸土壤中施用生物有机肥；FOF：在熏蒸土壤中施用有机肥；FBF：在熏蒸土壤中施用生物有机肥。用不同的字母表示根据Tukey检验定义的四个处理之间的显着差异（p < 0.05）。

4 熏蒸和有机改良对微生物组成的影响

熏蒸或未熏蒸土壤中细菌和真菌群落的分类组成相似（补充图5）。为了直观显示群落组成的差异，进行了基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）。总的细菌群落组成与种植前和收获的各个部分沿第一组分（PCoA1）有明显的分离。在每个成分中，熏蒸和未熏蒸处理的细菌群落沿第二组分（PCoA2）明显分离。对于真菌，在收获期间，4个处理沿第一组分（PCoA1）直接分离，并且从非根际土壤和根际中分离出群落沿第二组分（PCoA2）分离。此外，种植前的真菌群落组成与熏蒸和非熏蒸处理沿第一组分（PCoA1）分离（图4a，补充表3）。种植前，CKBF与CKOF的细菌群落结构比FOF和FBF更接近，收获期间在非根际土壤和根际中也观察到这一现象（图4b）。此外，在熏蒸处理中，细菌和真菌群落的更替较高，并且与发病率相关（p < 0.001，图4c）。此外，多元回归树（MRT）和方差分解分析（VPA）显示，熏蒸处理比有机改良剂对已建立的微生物群落有更强的聚集性。与化肥对细菌和真菌群落的影响相比，在收获期间，熏蒸对形成细菌和根际土壤样品的细菌组成影响大于真菌（补充图6）。使用其他多变量方法，如NMDS，显示了类似的结果（补充图7），证实了数据的稳健性。

图4. 细菌和真菌群落组成。a 所有土壤样本中基于Bray-Curtis距离度量的细菌和真菌群落组成的主坐标分析（PCoA）排序。CKOF：在未熏蒸土壤中施用有机肥；CKBF：在未熏蒸土壤中施用生物有机肥；FOF：在熏蒸土壤中施用有机肥；FBF：在熏蒸土壤中施用生物有机肥。圆形是指种植前的样品，三角形是指收获时的非根际土壤样品，正方形是指收获时的根际样品。b Bray-Curtis在CKOF和其他处理之间细菌和真菌群落的不同。用不同的字母表示根据Tukey检验定义的四个处理之间的显着差异（p < 0.05）。c Bray-Curtis差异与对照处理和发病率之间的线性回归。通过Spearman相关分析计算r值和p值。

5 微生物群落、两种病原菌与植物病害的关系

将土壤和根际微生物群落的变化、病原菌和发病率联系起来的三个结构方程模型（SEMs）表明，青枯菌比尖孢镰刀菌更能直接引起番茄病害，细菌群落是抑制这两种病原菌的主要指标（图5a，b）。在建立了将这两种病原菌结合在一起的一系列失败和成功的模型之后（补充图8），建立了一个有效的模型来说明青枯菌和尖孢镰刀菌之间的关系（图5c）。根据该模型，番茄枯萎病可能是由两种病原菌引起的，但根际青枯菌对番茄枯萎病的解释更多，其丰度被根际细菌群落直接抑制，而非根际土壤细菌群落通过抑制枯萎病菌间接抑制番茄枯萎病的发生。因此，SEM模型表明，该病是通过复杂的联合作用并由病原菌减少控制的。

图5. 影响两种病原菌发病率的直接途径和间接途径的结构方程模型（SEM）。a 在扫描电镜中只考虑青枯菌；b 在扫描电镜中只考虑尖孢镰刀菌；c 在扫描电镜中同时考虑青枯菌和尖孢镰刀菌。箭头代表因果关系的流动。实线和虚线分别代表统计学上显著（P ≤ 0.05）和不显著的关系。图中显示了与重要关系的每个箭头相关联的路径系数。

6 潜在的关键分类群

鉴于抑制非根际土壤尖孢镰刀菌和根际青枯菌的重要性，进一步研究了非根际土壤和根际细菌群落组成。选取相对丰度大于 1%的类群进行Spearman相关分析，共鉴定出3个非根际类群和6个根际类群。与尖孢镰刀菌丰度呈显著负相关的3个敏感细菌类群分别是：OTU_6643（Ohtaekwangia；r = -0.815，p < 0.001）、OTU_582（Ohtaekwangia；r = -0.820，p < 0.001）和OTU_3318（Chitinophaga；r = -0.700，p = 0.001）（表2）。与青枯菌呈显著负相关的6个根际敏感细菌分别为OTU_8463（Chitinophaga；r = -0.681，p = 0.001）、OTU_346（Chitinophaga；r = -0.592，p = 0.006）、OTU_1868（Olivibacter；r = -0.670，p = 0.001）、OTU_8641（Flavihumibacter；r = -0.641，p = 0.002），OTU_6257（Flavobacterium；r = -0.598，p = 0.005）和OTU_3519（Terrimonas；r = -0.668，p = 0.001）（表2）。此外，共现分析还表明，Ohtaekwangia与非根际土壤中的尖孢镰刀菌呈负相关，而Chitinophaga和Olivibacter与根际中的青枯菌呈负相关（补充图9）。在非根际土壤中，Ohtaekwangia与尖孢镰刀菌呈负相关，而Chitinophaga和Olivibacter与根际青枯菌呈负相关。

表2. 细菌OTUs与病原菌的Spearman相关性

讨论

为了减少农业的环境足迹，迫切需要开发提高土壤抗病性或抗病能力的方法，从而在保持农业高生产率的同时减少杀虫剂的使用。在这里，我们描述了两种策略-熏蒸和有机改良-可以潜在地导致土壤对多种病原菌系统的抑制。结果表明，在施用生物有机肥之前，通过熏蒸对土壤微生物群落进行初始扰动，可以有效地控制番茄枯萎病，并抑制青枯病和尖孢镰刀菌。下面，我们将根据微生物群组成的具体变化，通过破译多病原菌抑制的机制来讨论这些结果。

鉴于土壤微生物群落的高分类多样性和功能冗余，土壤微生物群落通常被期望对扰动具有抵抗性。然而，已知某些干扰，如熏蒸引起的干扰，会通过氨胁迫和土壤中的转移，对土壤微生物群落的分类和功能成分产生巨大影响。在我们的研究中，我们发现熏蒸确实诱导了细菌和真菌组成的高周转率，表明熏蒸调节了微生物组成的变化。相反，无论是施用有机肥还是生物有机肥，它们都是一种微弱的干扰，微生物群落对其有抵抗力（图6）。然而，从疾病控制的角度来看，后一种干扰是无效的，即使在存在生防剂的情况下，熏蒸也可能过于严重，扰乱微生物与病原菌的相互作用，产生不可预测的长期影响。

图6. 针对多病原菌抑制作用的土壤操纵的主要机制。橙色箭头表示弱干扰（生物有机改良剂）对初始微生物群落的影响，蓝色箭头表示强烈干扰（熏蒸）对初始微生物群落的影响。当施加微弱的干扰时，微生物群落要么对这些变化具有抵抗力，要么具有很强的弹性，随后返回到最初的患病状态。而熏蒸后，微生物群的初始状态受到极大的干扰，确保了另一种群落组成的发展，这种群落组成在有机改良剂的响应下发展成健康的土壤微生物群，从而在随后的植物生长中实现了较低的发病率。

生态学理论预测，最初的干扰会影响土壤微生物对后续干扰的稳定性，这表明复合干扰会强烈改变微生物的结构，特别是当群落经历不同的压力时。以前的研究已经观察到，熏蒸干扰本身可以保留一些潜在的有益微生物，而在这项研究中，我们使用了类似的原理，以熏蒸的形式施加强烈的干扰，为肥料中存在的有益微生物和有机改良剂铺平了道路，从而促使群落组成出现了另一种状态。重要的是，无论使用哪种有机肥，这些分类学上的变化都会对抑制疾病产生功能上的影响。

众所周知，有机改良剂能够缓解环境压力，促进土壤微生物种群的生长和活动，并在土壤微生物群落中诱导特定的类群，从而广泛影响土壤微生物。虽然这两种肥料都有抑制作用，但我们仍然观察到微生物组成的变化，特别是真菌，这表明抑制程度可能是一个冗余的功能。

尽管考虑到以前的化学熏蒸剂对环境和附近居民的高毒性而对高价值农业生产系统有害，这里提出的方法可能听起来很极端，但本研究中使用的新一代熏蒸剂被认为更环保。例如，一些报道表明，高氮改良剂可以促进对病原菌和根结线虫的抑制，这表明施用碳酸氢铵释放的氨有潜在的积极作用。此外，氧化钙是一种广泛使用的土壤修复剂，用于修复严重污染的土壤并恢复植被。最后，我们表明，有机改良剂的后续应用通过提高微生物活性和影响微生物群落的多样性和结构，抵消了与熏蒸相关的任何潜在的负面影响。因此，我们认为将危害较小的熏蒸剂与有机改良剂结合起来的这种新方法是环保的。

以前的文献报道，使用碳酸氢铵和氧化钙熏蒸，显示出很强的抗真菌作用，其通过释放铵来破坏真菌病原菌的菌丝。种植前，土壤中尖孢镰刀菌的丰度随着熏蒸而降低，而且这种影响一直持续到收获期，甚至在根际土壤中也是如此，这一结果在黄瓜44号和香蕉10号病害土壤中也表现为对熏蒸的响应。因此，熏蒸降低了病原菌的负荷，从而导致直接的抑制。

在本研究中，虽然尖孢镰刀菌在番茄生长过程中保持了相对稳定的低丰度，但我们也希望微生物能够间接地抑制这种病原菌。在属水平上，两种熏蒸处理（补充图10）在非根际土壤中观察到较高的Ohtaekwangia和Chitinophaga丰度，在收获期间和播种前，熏蒸和未熏蒸处理之间存在显著差异。因此，尖孢镰刀菌与Ohtaekwangia或Chitinophaga之间的负相关表明，这些微生物可能是参与真菌病原抑制的关键类群。据报道，Ohtaekwangia对恶性疟原虫具有生物活性，而Chitinophaga可表现出杀真菌活性并在其他细菌类群中诱导拮抗性状。因此，我们推测，这些物种丰度的增加代表着两步走策略的后续影响。总体而言，我们推测熏蒸通过直接、通过菌丝破坏和间接通过熏蒸对细菌群落聚集的影响来抑制真菌病原菌。

与尖孢镰刀菌不同的是，在种植前，熏蒸不会减少青枯菌的数量。一篇报道表明，在pH值为9的条件下，铵只能抑制青枯菌的生长，本研究中土壤pH值小于7。虽然番茄种植增加了青枯菌的丰度，但在收获期间，非根际土壤和根际土壤中熏蒸处理的青枯菌数量明显低于未熏蒸的土壤，说明熏蒸土壤具有抑制病原菌的能力。本研究的土壤类型与病原菌没有明显的相关性（表1）。根据我们的研究结果，许多报道表明，土壤微生物群在土壤消毒的基础上起到了抑制病原菌的作用，这表明土壤性质不能直接抑制病原菌。因此，我们推测土壤微生物群对细菌病原菌的抑制起到了重要作用。

土壤细菌多样性和组成往往与病原菌抑制率呈正相关。在这项研究中，细菌组成与对细菌病原菌的抑制相关（图5a），证实了之前在生物有机肥和有机改良剂诱导的抑制性土壤系统中的发现。因此，我们推断熏蒸通过改变细菌群落组成间接抑制细菌病原菌。在属的水平上，在熏蒸处理的根际土壤样品中观察到较高丰度的Chitinophaga、Olivibacter、Flavihumibacter、Flavobacterium和Terrimonas（补充图11）。Chitinophaga可以产生潜在的抗药性物质，如elansolid，来抑制病原菌。Flavihumibacter属于Chitinophagaceae，也具有抑制病原菌的潜力。此外，还发现Flavobacterium能抑制盆栽试验中的青枯菌，而Terrimonas与苹果再植病害呈负相关，而在健康的三七根际表现出较高的丰度。然而，在文献中没有证据表明Olivibacter在抑制病原菌方面的潜在作用。总体而言，根际中Chitinophaga、Flavihumibacter、Flavobacterium和Terrimonas的负相关关系表明，这些微生物是抑制细菌病原菌的潜在关键分类群。虽然在收获期间，CKOF处理的非根际土壤中大部分物种的丰度较高，但在根际土壤中，所有物种在熏蒸处理和未熏蒸处理之间都始终表现出显著的差异。因此，我们推测这些物种主要代表了两步策略的效果。

我们的结果表明，青枯菌和尖孢镰刀菌在土壤中发生了几次相互作用（图5，补充图12）。青枯菌与其他细菌性植物病原菌相比，能在土壤中存在相当长的一段时间，被认为是由土壤真菌（镰刀菌、曲霉等）控制的。这凸显了在设计改善作物生长和健康的新策略时考虑复杂病原菌相互作用的重要性。重要的是，这里使用的熏蒸 + 有机修正策略不仅减少了每种细菌和真菌病原菌造成的损害，而且还通过消除这两种病原菌之间的任何潜在的协同作用，潜在地降低了疾病的结局。

这项研究中提出的两步策略为操纵微生物群以改善植物健康提供了一个可靠的概念。在文献和本研究的基础上，我们认为在农业生态系统管理中，当有机肥（弱干扰）直接作用于土壤微生物群落时，干扰的强度不足以引起土壤功能由有利向抑制土壤转变。然而，当受到熏蒸形式的强烈干扰时，土壤微生物群受到很大影响-真菌病原菌被直接抑制，而细菌和真菌的组装通过有机改良剂进一步转向抑制群落（图6）。

结论

综上所述，本研究结果证实了熏蒸结合有机改良剂是防治番茄多病原菌病害的有效策略。该策略通过熏蒸直接减少真菌病原菌，但通过改变细菌群落而不是真菌群落间接抑制真菌和细菌病原菌。具体地说，有益的微生物群是由熏蒸引起的剧烈干扰诱导的，间接地刺激了抑制作用。多病原菌抑制的机制仍是未来研究的主题，以阐明其在疾病结果中的作用，并允许设计更好的农业管理方法并将其用于植物健康的可持续策略中。