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科研 | mSphere：多菌种肠道微生物群落中病原菌与共生菌个体间相互作用的研究

2021

05/29

微生态

A-

A+

作者报告了一种非常有用的体外工具，可用于评估复杂微生物群落成员的行为。

导读

肠道微生物群内共生细菌的相互作用以及与入侵病原体的相互作用是决定感染结果的关键。虽然小鼠研究很有价值，但缺乏体外模型来监测单一物种水平上的病原体对群落的反应。作者建立了一个由9个代表性肠道物种组成的多物种群落，作为一个混合生物膜一起培养，并使用基于定量PCR（qPCR）的方法跟踪单个物种的数量。将主要的医院内肠道病原菌艰难梭菌引入该群落，可增加共生菌的粘附力，抑制艰难梭菌的增殖。有趣的是，作者观察到，随着艰难梭菌的抑制，个别类杆菌种类却逐渐增加。此外，类杆菌减少了艰难梭菌在生物膜内的生长，这表明类杆菌在预防艰难梭菌定植中的作用。本研究定义的体外群落可以根据不同物种进行不同定制，非常适合功能基因组，是理解细菌间相互作用的宝贵工具。

论文ID

原名：Dissecting Individual Interactions between Pathogenic and Commensal Bacteria within a Multispecies Gut Microbial Community

译名：多菌种肠道微生物群落中病原菌与共生菌个体间相互作用的研究

期刊：mSphere

IF：4.282

发表时间：2021.3.24

通讯作者：Meera Unnikrishnan

通讯作者单位：英国考文垂华威大学华威医学院

实验设计

所有菌株在37°C厌氧条件下培养。对于具有多种微生物的混合生物膜，单独的细菌培养物在SAB1中培养16至18小时（在37°C的厌氧柜中过夜）。然后用新鲜的SAB1稀释这些培养物，使混合培养物中每种物种在600 nm（OD600）处的最终浓度达到0.1光密度，测定微生物的生物膜。在DNA提取之前，将单氮化钠（PMA；生物氚）添加到40mM最终浓度的再悬浮样品中，在黑暗中孵化10分钟（在厌氧柜中培养37°C），随后基于苯酚氯仿的方法进行了DNA的萃取，采用实时定量的PCR(qPCR)测定差异基因，从而对艰难梭菌和多雷梭菌生物膜进行深入研究。

结果

1 开发混合生物膜群落，优化单氮化原(PMA)-QPCR跟踪方法

为了开发一个由具有代表性的肠道物种组成的复杂的混合生物膜群落，作者根据之前描述健康肠道微生物群物种的文献，总共选择了9种肠共生物种（表1）

。该物种的选择是基于高相对丰度、在多个地区（欧洲、美国和亚洲）存在，以及序列基因组的可用性。细菌和细菌被过度代表，这些属是肠道的优势门。如材料和方法所述，这九种物种作为混合生物膜一起培养。

为了追踪单个物种，引物被设计为针对每个菌株的拓扑异构酶I(顶部I)或DNA环转酶亚基A(gyrA)区域。选择这些基因是与传统的16S基因不同，它们基因组中只有一个拷贝数，这提高了将DNA质量转化为细菌数的假设的准确性。

为了准确地量化细菌，必须只量化活性细胞/活细胞。标准的qPCR量化了所有的细胞，“死亡的”和“活跃的”一样，这给出了一个种群中个体物种的不准确的丰富度。为了提高定量的准确性，作者使用单氮化原钠(PMA)来防止“死亡”细菌的计数，即那些细胞膜受损的细菌。PMA是一种光活化的DNA结合染料，只能针对细胞膜破裂的细胞或“死亡”细胞。当PMA被光激活时，它与双链DNA(dsDNA)共价结合，交联两条链，这种结合可以防止在PCR的过程中的DNA扩增。因此，生物膜样本首先用优化浓度的PMA进行处理，然后进行基因组DNA提取，然后用QPCR进行分析（图1)。

表1 用于构建肠道微生物群落的有代表性的物种一览表

图1 用于量化混合生物膜中单个物种管道的示意图。样本为PMA（单氮原）处理，以确保只有活细胞的基因组DNA定量。治疗后，将细胞裂解，提取DNA，然后对DNA进行QPCR定量，随后转化为细菌数。

2 跟踪微生物群群落内的单个物种

作者首先在一个包含9种生物的混合生物膜中跟踪单个物种的数量。在孵育至72小时的不同时间后检测到所有9个物种（图2）。青春期双歧杆菌和卵形双歧杆菌在早期（72小时前）均呈阳性趋势，而热带双歧杆菌保持不变，所有其他物种的数量均减少。72小时时，所有物种的数量都出现了衰退，这意味着培养基中有毒副产物的积累，或营养耗尽。接种物中某些物种（类杆菌和类杆菌）的较低细菌数量（尽管通过光密度使数量正常化）似乎影响其在混合生物膜中的数量。结果表明，生物膜内的物种，甚至同一属内的物种，表现出不同的行为，类杆菌在最初的48小时内有阳性、中性和阴性趋势。

值得注意的是，当混合生物膜与单一细菌物种生物膜进行比较时，某些群落成员的数量有显著变化。与单一生物膜培养物相比，混合生物膜中的卵双歧杆菌和汉森布氏杆菌的数量在24小时时有所增加，而其他成员，如海洋双歧杆菌、真杆菌和大肠杆菌的数量则分别减少了80倍、25倍和20倍，这些差异进一步表明，单个细菌的动态受细菌群落内相互作用的影响。

此外，作者还测试了选定的成对细菌物种，以比较它们在双物种生物膜和微生物群生物膜中的行为。作者研究了大肠杆菌培养与选定的物种是代表不同的门包括在群落。对于大肠杆菌而言，当与任何一种除颚形瘤胃球菌外的细菌一起孵育时，细菌数量没有变化，这与混合群落中24小时内未变化的大肠杆菌数量相比（图2）。然而，在与大肠杆菌共培养的生物膜中，多雷双歧杆菌和汉森双歧杆菌生长得更好，而青春期双歧杆菌和颚形瘤胃球菌生长得不太好，与各自的生物膜单一培养物相比，早熟粪杆菌保持不变。这些生长行为不同于微生物群落中观察到的（图2）。因此，双物种生物膜相互作用与微生物群落中观察到的相互作用有很大的不同。

图2 长期追踪的9种肠道微生物群，使用PMA-qPCR追踪混合生物膜内细菌数量的物种特异性变化。CT值使用我们的管道进行转换来表示细菌总数。图中显示了混合生物膜内6、24、48、和72小时的个别物种的细菌数。下表总结了通过anova和事后图的多次比较测试计算出的不同物种在时间上的显著差异。P值：ns，不显著；****, P < 0.0001; ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *, P <0.05。数据显示的是三个独立生物实验的平均值，一式三份。错误栏表示标准偏差。

3 微生物群的种类会干扰艰难梭菌的粘附性和生长

为了研究肠道病原菌对肠道微生物群落动态的影响，作者选择了艰难梭菌作为医院内病原菌。首先，为了研究微生物群对艰难梭菌粘附的影响，跟踪了在有和没有艰难梭菌的情况下6小时内粘附生物膜的形成。测量了能够粘附在24孔聚苯乙烯板上的初始接种物的百分比。当艰难梭菌与微生物群一起培养时，与艰难梭菌单一培养对照相比，在艰难梭菌中观察到初始粘附显著减少（图3A）。虽然显著，但这种减少很小，单独培养时，初始接种物的粘附率为5%，微生物群的粘附率为2%。关于微生物群，作者发现当与艰难梭菌一起培养时，粘附的细菌数量显著增加。大肠埃希菌、青春期双歧杆菌和瘤胃球菌在统计学上存在显著差异，但这种趋势在所有物种中普遍存在（图3A）。在这个早期阶段，大肠杆菌似乎占主导地位，其原始接种物的粘附量远远超过任何其他物种。大肠杆菌是目前唯一的兼性物种，因此任何残留在还原培养基中的氧气都可能为它提供了一个最初的开端。

作者研究了生物膜形成过程中对艰难梭菌的影响（图3B）。在这里，微生物群影响艰难梭菌的生长，与艰难梭菌单一培养对照相比，在所有时间点都显著降低了艰难梭菌的生长。这一影响在24小时最高，微生物群导致难扩散菌数量比单培养对照下降20倍。由于粘附后抑制作用的增强，艰难梭菌数量的减少很可能是由于微生物群对艰难梭菌生长产生负面影响，而不是难粘附艰难梭菌。

在艰难梭菌存在下，作者跟踪了构成代表性微生物群的九种物种中的每一种（图4）。与微生物对照相比，作者发现艰难梭菌的存在具有从中性到阳性的效果，其中6种对B. dorei、B. Hanseni、B. ovatus、大肠杆菌、F. Prusniziii有小但显著的差异，而在6h和/或24 h和48 h时，苦参虽然能增加微生物群的初始结合，但其作用并不长期。在这两种情况下，无论是先前的轨迹，72 h的数量都有所减少，这可能是由于培养基中缺乏足够的营养物质或在这个后期，副产物的有毒水平积累所致。

图3 艰难梭菌与共生微生物群落的相互作用。（A）艰难梭菌的存在影响粘附微生物群落中几个物种的粘附。9种微生物群落、9种难扩散杆菌和单种艰难生物膜控制（仅扩散生物膜）中6 h后附着的接种菌百分比。（B）微生物群对艰难梭菌有抑制作用。采用PMA-qPCR法，对在单一培养生物膜或具有9种代表性微生物群中培养72小时的艰难梭菌数量进行跟踪。所示数据均为三次独立实验的平均值。双向方差分析表明两种情况之间存在显著差异（P值< 0.0001），使用事后Sidak检验确定具体差异。****, P < 0.0001; ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *, P <0.05。

图4 追踪艰难梭菌对肠道微生物群落中单个物种的影响。使用PMA-qPCR追踪的72小时内代表性微生物群和艰难梭菌生物膜内单个物种的细菌数量与没有艰难梭菌的对照微生物群生物膜相比显示。所示数据是三次独立实验的平均值。使用双向方差分析确定两种情况之间的显著差异，并使用事后Sidak检验确定特定差异。****, P < 0.0001; ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *, P <0.05。

4 艰难梭菌与已建立的微生物生物膜的相互作用

通常情况下，处于健康状态的微生物群在艰难梭菌感染之前就已经建立。为了更好地复制这一点，而不是同时引入艰难梭菌作为微生物群，作者在引入艰难梭菌之前预先建立了24小时的微生物群生物膜（图5A）。当将其与生长相同时间的艰难梭菌单一培养物进行比较时，观察到，在添加24小时和48小时后，已建立的微生物群对艰难梭菌具有显著的抑制作用。艰难梭菌数量的最大差异（138倍）出现在添加后24小时。预先建立的微生物群对艰难梭菌的影响明显大于两者同时播种时的影响（图5B）。虽然这很有趣，但艰难梭菌数量的减少可能不是病原体特异性的影响。为了验证这一点，作者还研究了脆弱类杆菌（Bacteroides fragilis），一种肠道共生菌和病原体，或者与微生物群共同培养，或者加入预先建立的群落。作者观察到，与单一培养的脆弱双歧杆菌生物膜相比，当与微生物群共培养或添加到预先建立的群落中时，脆弱双歧杆菌的数量较低。然而，与艰难梭菌不同，当添加到预先建立的群落中时，脆弱双歧杆菌的数量高于与微生物群一起播种时的数量。这些结果可能表明病原体与已建立的群落的相互作用具有一定的特异性。

作者追踪微生物群中的每一种，以检查对艰难菌反应的任何变化（图6）。作者期望，随着微生物群的建立，与艰难菌接种时相比，难扩散菌对微生物群的影响都会降低。然而，令人惊讶的是，发现了相反的事实。与仅微生物对照相比，只有两种品种，即B.Hanseni和R.gnavus，与同时添加难溶性艰难菌相比，数量没有变化。另外7种在引进艰难菌时，均表现出显著差异（图6）。在接种艰难菌后24 h（微生物接种48h），发现对B. Thetaiomation和大肠杆菌有积极的作用。F. prausnitzii有小幅下降。在感染艰难菌后48h，仍然可以看到对大肠杆菌的阳性作用，但在较小程度上。值得注意的是，在48小时时，与微生物群对照相比，该药物的数量有所减少，低于作者的检测限。因此，尽管同时培养和预稳定微生物群之间受艰难菌影响的物种是不同的，但在这两种情况下，有几个物种受到影响，其中就包括类杆菌。

图5 预先建立的微生物群对艰难梭菌的生长有抑制作用。（A）将在引入艰难梭菌前24小时建立的微生物群生物膜（9种微生物群1艰难梭菌24小时延迟）与在相同时间内仅生长艰难梭菌的生物膜进行比较。艰难梭菌数量用PMA-qPCR定量。（B）将预先建立的微生物群（9种微生物群1艰难梭菌：延迟24小时）对艰难梭菌的抑制作用与从一开始就与微生物群共培养的艰难梭菌的抑制作用（9种微生物群1艰难梭菌：无延迟）进行比较。所示数据是三次独立实验的平均值。非配对t检验用于检验显著性差异。****, P < 0.0001; ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *, P <0.05。

图6 艰难梭菌对预先建立的微生物群落的影响。PMA-qPCR用于跟踪添加艰难梭菌前24小时建立的9种代表性微生物生物膜中单个物种的细菌总数。所示数据是三次独立实验的平均值。未配对学生t检验用于确定显著性差异。****, P < 0.0001; ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *, P <0.05。

5 拟杆菌与艰难梭菌个体相互作用的研究

作者想进一步研究随着艰难梭菌抑制而增加的物种是否能够影响艰难梭菌的生长。以前曾报道，类杆菌作为混合生物膜培养时，在艰难梭菌存在下繁殖更多。作者最近在体外系统中研究了多雷双歧杆菌（一种丰富的共生体）和艰难梭菌在上皮细胞层存在下的共培养，并证明多雷双歧杆菌在艰难梭菌存在下繁殖更好，同时减少艰难梭菌的生长。因此，作者在双重培养生物膜中研究了多雷双歧杆菌与艰难梭菌共培养时的抑制作用。在测定生物膜的CFU计数后，将两个物种的单一培养物和共培养物培养24小时。在共培养中，作者发现与单一培养对照相比，多雷双歧杆菌的存在显著减少了艰难梭菌的数量（超过10倍）（图7）。相比之下，当与难辨梭状芽胞杆菌一起培养时，多雷芽胞杆菌的生长远远好于单独培养时。艰难梭菌数量的减少表明多雷杆菌介导的抑制作用。为了确保初始生物膜接种没有偏差，作者测量了每个物种的CFU值；艰难梭菌和多雷梭菌之间没有观察到显著差异。有趣的是，在这两个物种的浮游培养中没有观察到类似的细菌数量减少，这表明观察到的抑制作用需要两个生物体之间的接触或物理接近。数据表明，多雷双歧杆菌，一种共生类杆菌，在复杂的群落中随着艰难梭菌的增加而增加，会对艰难梭菌的生长产生负面影响。

图7 生物膜内多雷菌与艰难梭菌的相互作用。显示了生长24小时的多雷双歧杆菌和艰难梭菌的单一或混合生物膜培养物的CFU计数。所示数据为三次独立实验的平均值，误差线表示标准偏差。显著性差异采用非配对t检验。***, P < 0.001。

讨论

研究肠道微生物群成员之间的分子相互作用对于了解肠道内稳态和定植抗性等重要现象非常重要。作者首次建立了一个复杂的混合生物膜群落，由九个具有代表性的肠道共生物种组成。在这里报告了一个基于PCR的方法来调查这个复杂群体中的个体相互作用。定量测定了不同时期细菌数量的变化，并研究了肠道病原体艰难梭菌对该群落的影响。结果证明了几种艰难梭菌在数量上的变化，包括类杆菌属。进一步证明了类杆菌属中的一种，B.dorei，可以减少艰难梭菌在双种生物膜中的生长。

目前，用于追踪肠道内物种间相互作用的主要技术是基因组学和宏基因组学。基因组测序提供了很好的洞察什么是目前，但没有提供短期动态和潜在的细菌相互作用的信息。作者选择使用还原论的方法，将少量具有代表性的肠道物种进行共培养，以便更容易获得输出数据，提高可以测量单个物种变化的分辨率。事实上，作者还没有涵盖所有的关键物种，但鉴于作者选择的量化技术，现在有可能扩大这一种群，以包括更多的物种。测序的主要缺点是它的费用，因此，它通常用于分析包含数百个物种的复杂样品。与标准qPCR一样，基因组测序并不能消除“死亡”DNA的定量，而“死亡”DNA是准确定量活细菌数量的关键。另一种替代PMA-qPCR的方法是荧光原位杂交（FISH）。FISH的几种变体已被用于定量群落内的细菌；然而，基于qPCR的定量通常被认为比FISH方法更敏感、更快速、更省力。事实上，FISH作为一种补充分析，将增加群落的关键空间细节。因此，PMA-qPCR方法是一种简单可靠的方法来量化复杂群落中个体成员的变化。

作者能够在72小时内成功地追踪九种混合生物膜中的所有物种。有趣的是，在实验过程中，没有一种物种占优势；这表明物种之间更可能发生交叉取食，而不是直接竞争。作者认为，到72小时，这种生物膜作为一个整体并不稳定，所有物种的细菌数量都有所下降。即使是在最初48小时内表现出积极生长迹象的物种（如卵形双歧杆菌和青春期双歧杆菌[图2]）也是如此，这种下降可能是由于废培养基变得有毒和/或生长受限。实际上，静态生物膜培养模式的一个缺点是缺乏持续的营养供应和有毒副产物的去除。然而，这样的生物膜模型更容易建立，并在较短的时间内提供有用的信息。在流动细胞内发展这种多细菌生物膜，使营养物质在厌氧条件下持续流动，将使监测反应的时间更长。

在一个共生群落中加入一种病原体，可望引起对它的反应。为了调查这一点，研究反应肠道病原体艰难梭菌介绍。艰难梭菌是一种机会性肠道病原体，引起艰难梭菌感染（CDI），是美国医院相关性腹泻的主要原因，每年新增50万例，重复感染率为1/5。对艰难梭菌定植的最好防御是健康的肠道微生物群，它提供对疾病的自然免疫。抗生素与它们所针对的病原体一起对肠道微生物群产生负面影响，导致肠道微生物群的改变和CDI的可能性增加。肠道微生物群的明显变化与CDI有关；然而，由于大多数数据来自粪便样本的测序，因此缺乏关于粘膜相关种群和定植早期变化的信息。有趣的是，艰难梭菌的存在导致了共生群落中许多微生物物种的粘附增加（图3A）。作者预测艰难梭菌可能产生一种代谢副产物，改善微生物群中物种的初始生长和结合，或者艰难梭菌产生的信号分子被微生物群检测到并诱导这些物种内的代谢变化。有必要使用艰难梭菌进行进一步研究，以确定可溶性因子是否参与观察到的粘附增加，或者这是否是一种代谢效应。

当艰难梭菌与微生物群（图3B）一起培养时观察到的初始粘附的减少是预期的，因为有大量关于微生物群对艰难梭菌定植的破坏作用的数据。粘附性的小幅度降低（约50%）可能是因为微生物群落没有预先建立，这通常是感染艰难梭菌的情况。胆汁酸和胆汁盐对艰难梭菌在肠道的定植能力有相当大的影响，微生物群会转化艰难梭菌萌发所需的主要胆汁酸，如牛磺胆酸。它们转化成的次级胆汁酸也能抑制艰难梭菌的生长。作者使用的培养基中没有胆汁酸，这表明观察到的艰难梭菌抑制不是通过初级胆汁酸转化为次级胆汁酸。因此，通过次级胆汁酸的产生来阻止细菌萌发似乎只是定植抗性机制的一部分。事实上，当在引入艰难梭菌前24小时预先建立微生物生物膜时，作者发现艰难梭菌的生长受到很大影响（图5A和B）。预先建立微生物群可导致共生细菌的丰度增加，并导致任何分泌的抑制分子水平升高。此外，艰难梭菌粘附所需的物理空间将少得多，艰难梭菌所需的任何营养物质都可以在这一阶段从培养基中取出。

在一次成功的感染中，艰难梭菌已经被报道通过调节细菌代谢，包括吲哚的产生来控制微生物群。它通过影响色氨酸酶（tnaA）在其他物种中的表达来实现这一点；艰难梭菌被认为通过吲哚介导的抑制肠道保护细菌的生长来限制微生物群的恢复。当艰难梭菌与共生群落共培养时，观察到多雷双歧杆菌、卵形双歧杆菌、大肠杆菌、普氏镰刀菌的数量有小而显著的增加。虽然这9个物种中，卵形芽胞杆菌、θ型芽胞杆菌、青春期芽胞杆菌、大肠杆菌和普氏芽胞杆菌是吲哚产生菌，但没有发现抑制作用。鉴于艰难梭菌反而受到抑制，有可能细菌无法达到足够的数量来影响吲哚的产生。此外，在预先建立的群落中加入艰难梭菌后，发现与对照组相比，大肠杆菌数量增加（图6）。同样，在CDI患者中经常发现过多的变形杆菌，这是艰难梭菌成功感染的一个特征。然而，平行观察到的多种拟杆菌数量的增加可能解释了在这个系统中观察到的艰难梭菌的抑制作用。艰难梭菌感染与类杆菌的显著减少有关，这可能提示肠道内这些细菌具有保护作用。

有趣的是，艰难梭菌与多雷类杆菌（一种丰富的肠道共生物种）共培养时，其生长受到负面影响（图7）。在脆弱类杆菌存在的情况下，艰难梭菌的生长量减少。值得注意的是，脆弱双歧杆菌与多雷双歧杆菌非常相似，与艰难梭菌混合培养的数量比单独培养的数量多，并且生长抑制作用对生物膜生长具有特异性，这表明细胞间的相互作用/物理接近可能起到了一定的作用。作者最近也报道了在体外肠道模型中艰难梭菌在上皮细胞上的生长在多雷双歧杆菌的存在下减少。最近有报道称，脆弱双歧杆菌通过潜在影响上皮屏障的完整性，在小鼠感染模型中预防艰难梭菌感染。虽然这些数据支持类杆菌在预防艰难梭菌感染方面的作用，但感染艰难梭菌的患者通常会减少类杆菌的丰度和多样性。作者的数据可能表明，如果没有先前的微生物群干扰，例如使用抗生素治疗，艰难梭菌不能减少拟杆菌的数量，而是通过改善生长来加强拟杆菌的优势。

结论

总之，作者报告了一种非常有用的体外工具，可用于评估复杂微生物群落成员的行为。利用这个微生物群模型来显示对艰难梭菌的抑制作用以及它在特定微生物群中引发的变化。该模型可以很容易地跟踪艰难梭菌和其他病原体对微生物群的动态变化。利用转录组学等“组学”技术对这一微生物群落的分子变化进行进一步研究，将揭示艰难梭菌抗药性的新机制。事实上，这一群体可以扩大或改变，以包括其他代表性物种和宿主细胞成分（例如，肠上皮细胞），并用于跟踪转录组和代谢变化调制的应激因素，包括药物和病原体。

1 作者报告了一种非常有用的体外工具，可用于评估复杂微生物群落成员的行为。

2 该模型可以很容易地跟踪艰难梭菌和其他病原体对微生物群的动态变化。

3 定义的体外群落可以根据不同物种进行不同定制，非常适合功能基因组，是理解细菌间相互作用的宝贵工具。