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科研 | Water Research：过氧化氢对饮用水库中天然浮游植物和浮游细菌的影响：围隔尺度研究

2021

06/01

微生态

A-

A+

导读

在世界范围内对蓝藻水华的报道越来越多，这对水处理厂提出了挑战，并涉及到对人类健康和水生生态系统的风险。高级氧化处理包括高效和安全的水处理方法。过氧化氢（H₂O₂）具有更高的敏感性，在低浓度下对环境没有重大风险，因此H₂O₂被认为是缓解蓝藻水华形成的可持续解决方案。在此，我们评估了在一个半干旱地区的水库中，该水库呈现浮游生物为主的蓝藻水华，在其中单次添加了H₂O₂（10 mg/L），并分析添加后120 h的效果。研究了理化参数和浮游细菌组成的变化。过氧化氢在72 h内有效抑制了蓝藻、绿藻和硅藻的生长，导致透明度和溶解有机碳增加，溶解氧和pH降低，而营养物质浓度不受影响。120 h后，蓝藻丰度保持较低水平，绿藻占主导地位。16S rRNA测序显示，最初的蓝藻水华由浮丝藻（Planktothrix）、蓝菌属（Cyanobium）和微胞藻属（Microcystis）组成。只有蓝菌属在120 h相对丰度增加，表现出再生。异养细菌的组成发生了显著变化，在H₂O₂处理后，微小杆菌属（Exiguobacterium）、副球菌属（Paracoccus）和异常球菌属（Deinococcus）成为最丰富的属。本研究结果表明，这种方法在抑制蓝藻水华和改善热带环境的水质方面是有效的。测定非生物参数的变化和特定细菌类群的相对丰度可用于预测H₂O₂处理后蓝藻细菌的再生长，以指示应该在水库中的什么地方使用H₂O₂，以便在水处理厂的取水口仍能有效果。

论文ID

原名：Effect of hydrogen peroxide on natural phytoplankton and bacterioplankton in a drinking water reservoir： Mesocosm-scale study

译名：过氧化氢对饮用水库中天然浮游植物和浮游细菌的影响：围隔尺度研究

期刊：Water Research

IF：9.130

发表时间：2021.3

通讯作者：Allan A. Santos

通讯作者单位：巴西里约热内卢联邦大学生物物理研究所

实验设计

本文研究了H₂O₂对浮游植物群落的影响，模拟了自然环境，在巴西半干旱地区用于饮用水供应的水库（图1）中安装的围隔系统中，添加了10 mg/L的 H₂O₂ 。实验持续120 h（5天），在施用H₂O₂之前（T0）以及在时间24、72和120 h采集水样。对于每个采样时间，评估生物参数和非生物参数（表1），以及研究随着时间的增加H₂O₂对细菌-浮游生物群落组成的影响。

图1 巴西塞阿拉州加维奥水库位置。

表1 物理或化学参数，分析方法和位置

结果

1 非生物参数

在包含所有测试参数的多变量分析中， H₂O₂ 处理影响非生物参数和来自浮游植物的叶绿素，这些参数被用作水质指标，由PERMANOVA分析（p = 0.02；F = 25.20）支持，时间与条件交互作用大（p = 0.024；F = 4.0793）。72 h后，在围隔中不再检测到 H₂O₂ 。在所有取样时间（24、72和120 h），透明度（p < 0.0001，F = 69.67）和浊度（p < 0.0 0 01，F = 50.73）均受到H₂O₂处理的影响。初始透明度值为47 cm，对照组在24 h时增加到64 cm。在处理过的围隔中，透明度分别在24、72和120 h分别增加到82、15和105 cm（表2）。浊度最初为11 NTU，在对照组中保持11~14 NTU。在处理过的水中，在24、72和120 h分别下降到8.3、5.5和5.5 NTU。其他非生物参数在处理中与对照组在某些采样时间有显著差异（表2）。电导率在整个处理过程中表现出显著的变化（p = 0.005，F = 7.2），在120 h时电导率显著增加（p = 0.0007），平均达到585 μS/cm，而对照组为575 μS/cm。处理组和对照组有关盐的阴离子的电导率没有差异，如氯离子（p = 0.27）、硫酸盐（p = 0.57）和氟离子（p = 0.57）等。与对照组相比，H₂O₂处理组的pH值显著降低（p < 0.0001, F = 42.16），72 h时从9.2降至8.1，120 h时从9.0降至8.3（表2）。TOC无显著变化，而在72 h时，与对照相比，DOC从22mg/L降至18.5 mg/L（p = 0.003, F = 7.71）。72 h时DO也显著降低，对照组为11.4 mg/L，治疗组为6.4 mg/L（p < 0.0001, F = 21.26）。处理组和对照组的氨（p = 0.59）、亚硝酸盐（p = 0.73）、硝酸盐（p = 0.50）和正磷酸盐（p = 0.12）等营养成分没有显著差异。随着时间的增加，无论是在处理还是在对照条件下，围隔都会影响营养浓度。随着时间的增加，温度或真实颜色没有变化（p = 0.53）。

表2 120 h内饮用原水中10 mg/L的H₂O₂对非生物参数的影响

2 H₂O₂对浮游植物的影响

随着时间的增加，所有三种浮游植物的生物量都受到 H₂O₂ 的影响：蓝藻（p < 0.0001，F = 21.45）、绿藻（ p < 0.0001，F = 58.38）和硅藻（p < 0.0001，F = 24.97）。蓝藻在T0显示出最高的叶绿素值，并且与对照条件相比，随着时间的增加持续降低。72 h时，检测不到蓝藻（图2 A）。绿藻叶绿素在72 h时也显著减少（两者p = 0.0003），减少了50%。然而，在120 h，通过叶绿素估算观察到绿藻生物量大幅增加（p = 0.03），达到约25 μg/L，而在对照组中，绿藻生物量保持在13 μg/L（图2 B）。硅藻的初始叶绿素浓度为1 μg/L，在处理24 h检测不到（p = 0.04），但随后在120 h，其达到比对照组高三倍的生物量（图2 C）。在处理过的水中，绿藻生物量在120 h时高于对照，蓝藻生物量则相反。

图 2 120 h内10 mg/L的H₂O₂对浮游植物生物量的影响是通过估计的叶绿素浓度。（A）蓝藻，（B）绿藻（C）硅藻。

3 H₂O₂对浮游细菌的影响

归一化后，在每个样本用32221个序列来描述细菌群落（补充表1）。样本T3M5（72 h无H₂O₂）在DNA处理过程中丢失，无法分析。稀疏曲线表明所有样品的细菌多样性覆盖率达到97-98%时达到饱和（补充表1和补充图2）。样本聚类显示，对照组和处理组之间的平均相似度为60%，差异为70-80%（补充图3）。根据Shannon多样性指数和丰富度估算，与对照组相比，H₂O₂在任何时候都不影响群落的丰富度（p = 0.07，F = 5.58）（补充图4A），但在24 h和72 h时群落多样性下降（p = 0.001，F = 63.51）。因此，加入H₂O₂后，细菌群落的组成发生了变化，但物种数量没有减少。采用非度量多维标度法（nMDS）对处理条件和对照条件下的样品进行排序。两种条件下对应的样本分布较远，不同采样时间下对应的处理样本也被分离，每个重复在各自的时间内分组（补充图5）。添加H₂O₂后24 h和72 h采集的样品比120 h采集的样品更相似。这些差异通过双向PERMANOVA处理与对照组（p < 0.001，F = 26.562）和24、72、120 h处理（p < 0.001，F = 4.516）之间的相互作用（p < 0.03）得到证实（补充表2）。

H₂O₂处理后，细菌群落的组成随时间增加而变化（图3）。原始群落主要由放线菌（21%）、蓝细菌（20%）、浮霉菌（15%）和变形菌（11%）组成，其次是疣粒菌（9%）、绿弯菌（8%）和拟杆菌（7%）。随着时间的增加，在对照中观察到的变化很少。蓝藻相对丰度在24 h（25%）和72 h（27%）增加，然后在120 h恢复到与初始丰度相似的值。放线菌的相对丰度在120 h内持续下降，最终达到11%，放线菌的相对丰度持续下降，而疣粒菌在最后时刻增加到21%。相反，处理中浮游细菌的组成被完全改变。与对照相比，在120 h，H₂O₂样品中的浮游细菌的优势菌门分布不同，包括拟杆菌门（19%）、疣粒菌门（24%）以及变形菌门（26%）（图3）。

图3 0 h、对照和处理（H₂O₂添加）24、72和120 h后细菌OTUs在门水平上的相对丰度。

H₂O₂ 处理将蓝细菌的相对丰度从T0时的20%降低到24 h时的1%和120 h时的7%。蓝细菌群落内的OTU组成也受到H₂O₂处理的影响（图4）。蓝藻、蓝丝藻和微囊藻是原始蓝藻群落中的优势属，分别占30%、27%和16%（图4）。在对照组中以及到实验结束，它们仍然是主要的属。在蓝藻丰度急剧下降的处理水体中，24 h时微囊藻占主导地位，占所有蓝藻OTUs的60%，而蓝丝藻占20%。从72 h到120 h，微囊藻丰度分别降低，而蓝丝藻丰度分别增加。处理后浮游生物的丰度仍然很低。因此，在实验结束时，当蓝细菌群落丰度趋于增加时，群落组成与原来的不同（图4）。

图 4 以OTU为基础的蓝藻属（条形图）和蓝藻门（线）的平均相对丰度（n = 3），黑线表示控制条件，黄线表示处理条件。

为了突出相关的主要浮游细菌类群在对照和处理之间的差异，我们使用OTUs的相对丰度作为输入进行LDA和LEfSe分析。考虑到LDA评分（log10），临界值为3.0，选择了67个有助于区分治疗和控制的OUT（补充图6）。其中，在对照条件下最具代表性的类群是未分类的红杆菌科（4%）和陆生微生物属（3%）和蓝藻浮游体（6-10%）、微囊藻（3%）、蓝藻（3%）和拟杆菌（1%）（图5 A-F）。处理条件下的优势属为微小杆菌属、耐球菌属、副球菌属和根瘤菌属（图5 G-I）。在24和72 h时，微小杆菌的相对丰度达到40-50%。副球菌对应于4- 9%，而耐球菌的丰度为10%，而在对照条件下或在时间0 h（T0）时，它们的丰度接近于零（图5 G-I）。对照条件下占优势的类群包括分枝杆菌属和未分类的梭杆菌属、钙粘杆菌科、氯杆菌科和纤维素科（补充图6）。我们还选择了在H₂O₂处理120 h后的主要OTUs来表征H₂O₂降解后的浮游细菌菌落组成。根据LEfSe分析，五个最相关的是黄杆菌属（~15%），微小杆菌属（~5%），未分类的丛毛单胞菌科（~3%），螺状菌科（~3%）和突柄杆菌属（~3%）（补充图7）。

图5 根据LefSE分析，随着时间的增加，在对照制或处理条件下异养细菌和蓝细菌的主要属的相对丰度。在对照条件下，主要OTUs对应于未分类的异养细菌红杆菌科（A）和陆生微生物（B），蓝藻浮游体（C）、微囊藻（D）、蓝藻（E）和拟杆菌（ F）。在处理条件下，主要OTUs对应于微小杆菌（G）、副球菌（H）和耐球菌（I）。

根据SIMPER分析（补充表4），在每个采样时间，我们选择了导致对照和处理之间差异的主要OTUs，并测试了它们与受H₂O₂处理影响的湖沼学参数（叶绿素组和非生物因素）的相关性（表2）。CCA排序（图6）显示，控制条件分组的所有采样次数，包括T0，与该分组相关的主要湖沼参数为蓝藻的浑浊度和叶绿素。浑浊度与4种不同蓝藻OTUs呈正相关，蓝细菌（OTU16）（r = 0.84）、浮丝藻（OTU03）（r = 0.81）、微囊藻（OTU14）（r = 0.79）和尖头藻（拟柱胞藻）（OTU21）（r = 0.76）和一种异养未培养的红杆菌科（OTU02）（r = 0.75）。蓝藻的浊度和叶绿素与一些异养细菌如分枝杆菌（OTU06）、根瘤菌（OTU09）、土壤红杆菌（OTU10）和暖绳菌科（OTU28）呈正相关；与透明度呈负相关（补充表5）。作为H₂O₂在24 h的早期作用，透明度增加，蓝细菌叶绿素减少，透明度与微小杆菌属（OTU01）（r =0.77）、副球菌属（OTU05）（r =0.8）和异常球菌属（OTU08）（r =0.79）之间存在显著的正相关关系（图6）。估计这三个OTUs与蓝藻叶绿素呈显著负相关（r分别为-0.71、-0.74和-0.75）（图6和补充表5）。在72 h时，在不同实验条件下透明性和浊度仍有显著差异，与对照相比，H₂O₂样品中的酸碱度、DOC和溶解氧有所降低（表2）。在处理过程中，微小杆菌属（OTU01）、副球菌属（OTU05）和异常球菌属（OTU08）与透明度呈正相关（r分别为0.77、0.80和0.79），还有未分类的鞘脂杆菌科（OTU25）（r = 0.66）（图6）。根瘤菌（OTU39）和黄杆菌（OTU42）与透光率呈正相关（r分别为0.66、0.73和0.6），与浊度（r分别为-0.65和-0.74）和酸碱度（r分别为-0.62和-0.80）呈负相关。黄杆菌（OTU42）（p = 0.0001）也与溶解氧呈负相关（r = -0.75）。在OTU和DOC之间没有观察到显著的相关性（图6，补充表5）。在120 h，透明度，浊度，酸碱度，电导率和蓝藻叶绿素的分区控制和处理。在处理过程中，许多OTUs与较高的电导率和透明度之间建立了正相关关系。芽胞杆菌（OTU65）（电导率：r = 0.84；透明度：r = 0.68）、红杆菌（OTU81）（电导率：r = 0.75；透明度：r = 0.80）、乳杆菌（OTU160）（电导率：r = 0.80；透明度：r = 0.75）和一个未分类的螺旋体科（OTU37）（电导率：r = 0.82；透明度：r = 0.72）。未分类的鞘孢杆菌科（OTU25）的丰度仅与电导率有关（r = 0.77）。与酸碱度呈负相关并与处理相关分别为OTUs是螺旋体科（OTU37）（r = -0.74）、根瘤菌（OTU39）（r = -0.62）、黄杆菌（OTU42）（r = -0.80）、芽生单胞菌（OTU65）（r = -0.71）、红杆菌（OTU81）（r = -0.63）和冰杆菌（OTU160）（r = -0.71）（图6，补充表5）。虽然黄杆菌属（OTU17）（p = 0.2）、未分类的丛毛单胞菌科（OTU29）（p = 0.6）和突柄杆菌属（OTU88）（p = 0.2）与120 h的处理条件有关，但它们与非生物因素没有显著相关性（补充表5）。此外，绿藻叶绿素与蓝菌属（OTU16）呈正相关（r = 0.62），在对照条件下保持其存在，在处理样品中略有增加。突柄杆菌属（OTU88）与硅藻叶绿素正相关（r = 0.74），而未分类的丛毛单胞菌科（OTU29）与这两个因子均正相关（r = 0.6）（绿藻r = 0.6，硅藻组r = 0.73）。

图6 典型对应分析（CCA）在每个采样时间，有助于区分对照和处理的主要OTUs（通过SIMPER）和在每个时间物理化学参数的显著不同。

讨论

所研究的水库用于饮用水供应，近期有蓝藻增殖的历史，优势种群为阿氏浮丝藻和尖头藻属。在这项研究中，H ₂O ₂ 被应用于围隔尺度以抑制蓝藻水华和改善水质参数。研究了这种处理对浮游细菌群落组成的影响。加入单一浓度（10 mg/L）的H₂O₂，并在120 h（5天）内监测生物和非生物参数。有研究表明，在淡水环境中，5 mg/L的H ₂O ₂ 就足以控制蓝藻。本文采用的浓度（ 10mg/L）是考虑到水库富营养化状态和高有机碳含量。该浓度抑制蓝藻，但对真核浮游植物影响较小。尽管与其他浮游植物相比，蓝藻会选择性地受到H₂O₂的影响，而不伤害其他生物。Spoof等人揭示了芬兰Köyliönjärvi湖不同种类浮游动物在10和20 mg/L H₂O₂暴露后的脆弱性。浮游动物的敏感性可能因物种而异，在原位应用H₂O₂控制蓝细菌的情况下，应评估这一问题。

H₂O₂对蓝藻的原位抑制效率取决于其降解时间，而降解时间受有机碳浓度和浮游细菌密度和组成的影响。Fan等人使用太湖水样发现，10 mg/L的H₂O₂有效抑制蓝藻生长超过15天，导致真核绿藻占优势，但没有关于H₂O₂降解时间的信息。太湖水中DOC浓度随地点或季节的不同而变化，为2-8 mg/L，比Gavião水库的DOC浓度低2-3倍。即使如此，在Gavião水库，10 mg/L的H₂O₂抑制蓝藻超过120 h，这与那些在低有机碳浓度环境中应用10 mg/L的研究相比，时间缩短了。在本实验中，从72 h开始没有检测到H ₂O ₂ 。叶绿素和16S rRNA测序表明，处理后蓝藻数量仍低于对照，但在120 h时略有增加。与对照相比，在处理条件下72 h内DOC浓度降低，这可能与光降解或微生物活性有关。

除蓝藻外，真核生物的浮游植物最初也被H₂O₂处理抑制，但降解后以绿藻为主，表明蓝藻对处理的敏感性更高，或绿藻的恢复/适应性更高。Sinhá等人观察到，蓝藻生物量减少，其后真核硅藻Synedra sp.和绿藻Cladophora sp.的丰度增加，表明这些物种得益于蓝细菌的崩溃并利用了可用的养分。在另一项研究中，通过施加H ₂O ₂ 抑制了铜绿微囊藻的开花，绿藻（衣藻属）的生长得到了促进。本实验虽未对浮游生物的组成进行评估，但对其组成进行了分析。浮生直链藻属和脆杆藻属被确定为原水中的主要硅藻物种，而浮丝藻属和尖头藻属在研究时存在。

与其他研究不同的是，随着浮游植物的抑制，H ₂O ₂ 处理后的透明度增加，且随着时间的推移与蓝藻叶绿素有关。因此，在本研究中，使用高浓度的H₂O₂改善了水质参数。在72 h时，DO浓度下降，这可能与蓝藻的崩溃和减少光合活性导致产氧降低有关。在淡水环境中的其他研究表明，酸碱度和溶解氧的增加可归因于蓝藻在大量水华和高营养水平下的生长。

基于H ₂O ₂ 处理被描述为触发再营养化，导致环境中的另一种平衡，但是在本实验中，没有观察到由于添加H₂O₂而引起的营养物浓度的变化。随着时间的推移，营养物质的维持或增加将有利于蓝藻的再生。此外，营养浓度的变化可能与蓝藻水华的物种组成、水体的氧化还原电位以及相关微生物群落的生长有关。H₂O₂降解后，在120 h观察到蓝藻生物量和序列相对丰度的增加，表明再生具有不同于最初的群落组成。蓝藻属在处理后的群落中占主导地位，但也检测到了浮游丝体和微囊藻的序列。微浮游海藻（0.2-2 μm）数量丰富，但忽略了淡水系统中低营养或富营养条件。在缺乏营养的海洋环境中，微浮游蓝藻的代表性种类可以达到0.5 d^-1的生长速率。在本实验中，由于H₂O₂抑制了蓝藻水华，所以相对较快的生长速率可能得益于竞争的缓解和营养物质的可用性。因此，长期显微镜分析、叶绿素测量和分子工具对于监测剩余蓝细菌群落的发展和优化缓解策略非常重要。

H₂O₂处理后，除蓝藻外，其他门的丰度均下降。放线菌门、疣状芽胞菌没门、浮霉菌门和绿弯菌门的情况就是这样，这表明这些门的成员对氧化过程也很敏感。相反，一些细菌类群对H ₂O ₂ 处理具有抗性，包括厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门。副球菌和耐辐射球菌对处理样品的细菌群落的贡献比例相似（24 h和72 h）。已知这两个属的成员都产生参与细菌防御氧化应激有害效应的酶。异常球菌属以其在电离、紫外线辐射和脱水等各种极端环境条件下生存的能力而闻名。电离和紫外线辐射可以介导和增强活性氧的产生。耐辐射球菌细胞具有较高的过氧化氢酶活性，当暴露于H₂O₂中时，过氧化氢酶活性增加。当用亚致死剂量的H₂O₂预处理时，细胞变得对更高浓度的H ₂O ₂ 有抵抗力，并且对紫外线和γ射线也有更强的抵抗力，显示出对各种应激因子的存活率提高的潜力。

处理条件下的主要菌属是微小杆菌属，其世界性分布可能与对包括高紫外线强度在内的极端环境条件的适应性有关。这个属的一个固有特征是过氧化氢酶的强烈活性。来自该属的菌株呈现类胡萝卜素C30合成的完整途径，这可能有助于ROS淬灭以及保护免受光损伤。微小杆菌与透明度呈正相关，这是蓝藻崩溃的结果。Tian等人表明，微小杆菌属的提取物对蓝藻有较强的杀藻活性，2天内抑制浮丝藻、聚球藻和微小色球藻的生长，对绿藻无抑制作用。H ₂O ₂ 降解后，微小杆菌丰度降低，蓝藻占优势。后来的一个主要贡献者是与对照条件相比丰度增加的黄杆菌属。此前已有报道称，在聚球藻属为主的蓝藻爆发期间，该属与微型蓝藻之间存在相关性。此外，Cardman等人提出疣微菌门的成员，包括黄体杆菌可能参与了海洋环境中藻多糖的降解。这些结果表明，使用宏基因组学方法的进一步研究可以证实特定细菌分类群在氧化过程和随后蓝藻再生长之前的组成变化之后的流行。在这种情况下，了解水处理氧化处理后浮游细菌中占主导地位的抗性细菌非常重要，因为它们可能意味着耗水风险。此外，了解H ₂O ₂ 处理后微生物群落的动态可以揭示细菌类群在蓝藻水华恢复前的生物监测条件中可能有用。

本研究没有评估H₂O₂对蓝藻毒素的潜在影响，因为在整个实验过程中没有检测到常规监测的蓝藻毒素（微囊藻毒素、石房蛤毒素和柱胞藻毒素）。尽管在原位和蓝藻培养中都观察到了H ₂O ₂ 对微囊藻毒素的去除效率，也有其他研究报告了毒素残留。如果通过H₂O₂过程释放的毒素仍存在，且未经过化学或生物降解，则可采用活性炭吸附或化学氧化等步骤在WTP中完全去除。H₂O₂处理的优点是它不需要在WTP中增加新的基础设施，只有当原水水质恶化到某一阈值时，才能应用于水库的一小部分（靠近取水口）。

在半干旱地区的一个富营养化水库中，在高辐照度、高温和高碳含量的条件下，利用围隔系统评估了H₂O₂对浮游植物、细菌和非生物参数的影响。在改善水质的同时，单次添加10 mg/L H₂O₂对浮游植物群落的抑制作用，超过72 h，在H₂O₂降解后绿藻开始占优势。最初以浮游生物为主的蓝藻水华被抑制，蓝藻数量增加。表明蓝藻的再生与营养物质的可获得性有关。异养细菌群落组成随时间而变化，以对H₂O₂具有抗性的类群为主，尤其是微小杆菌。因此，H₂O₂对浮游细菌构成了一种胁迫条件，其组成在不同门的相对丰度上发生了强烈的变化，需要较长的观察时间来确定在H₂O₂降解后蓝藻水华的恢复时间。本研究的结果表明监测非生物参数和特定类群的相对丰度可以用来预测蓝藻的再生。观察这一过程成功的一个重要方面是在哪里应用H₂O₂，以便在WTP摄入量中仍能感受到它的影响。为此，除了了解水质改善的持续时间外，还需要对水库水动力学（停留时间、优先路径）进行研究。