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安徽大学 | Food Funct：Akk菌外膜蛋白Amuc_1100通过TLR2信号途径促进肠道5-HT生物合成和细胞外利用

2021

05/27

微生态

A-

A+

由于肠道菌群对5-HT生物合成有重要影响，而TLR2可以直接接受肠道菌群的刺激，因此肠道菌群、宿主TLR2和5-HT之间可能存在着密切的关系。

导读

嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila，Akk菌）是一种存在于宿主肠道粘液层的益生菌，对宿主肠炎及肥胖、糖尿病等代谢紊乱有明显的缓解或治疗作用。Akk菌外膜蛋白Amuc_1100与宿主的相互作用中可能起着重要作用。5-羟色胺（5-HT）是一种神经递质，是调节胃肠道等器官功能的关键信号分子，参与多种生理病理过程。本研究证明Amuc_1100可通过与TLR2直接作用，促进RIN-14B细胞5-HT合成限速酶Tph1的表达，降低Caco-2细胞5-HT再摄取转运体（SERT）的表达，从而提高5-HT的生物合成和细胞外利用率。以抗生素处理的小鼠为动物模型，本文发现用Akk菌或Amuc_1100灌胃后，结肠组织中Tph1表达增加，SERT表达减少。结肠组织和血液中5-HT浓度同时显著升高。本文还发现，Akk菌或Amuc_1100可改善抗生素治疗小鼠的胃肠运动功能，恢复肠道微生物群的丰度和物种多样性。这些结果表明，Akk菌可通过其外膜蛋白Amuc_1100和TLR2调节宿主肠道5-HT系统。这一机制是Akk菌与宿主相互作用，进而影响5-HT相关生理功能的重要途径。这些结果促进了对肠道微生物群与宿主相互作用机制的理解，为相关疾病的新干预策略奠定了基础。

论文ID

原名：The outer membrane protein Amuc_1100 of Akkermansia muciniphila promotes intestinal 5-HT biosynthesis and extracellular availability through TLR2 signalling

译名：Akk菌外膜蛋白Amuc_1100通过TLR2信号途径促进肠道5-HT生物合成和细胞外利用

期刊：Food & Function

IF：4.171

发表时间：2021.3.9

通讯作者：张敏

通讯作者单位：安徽大学生命科学学院

实验设计

结果

1、Amuc_1100通过与TLR2的直接相互作用激活RIN-14B细胞中的NF-κB通路

据报道，Akk菌或Amuc_1100能激活表达TLR2的人HEK-Blue细胞。本文先前的研究结果显示，大肠杆菌异源表达的 Amuc_1100 可以直接与TLR2相互作用。因此，本文推测Akk菌通过其外膜蛋白Amuc_1100与TLR2的直接相互作用激活相应的信号通路。RIN-14B细胞系是一种传统的肠细胞功能模型。用大肠杆菌表达的Amuc_1100处理RIN-14B细胞，加入或不加入1 μM TLR2抑制剂CU-CPT22预处理1 h。24 h后检测NF-κB亚单位1（Nfkb1）mRNA的表达。数据显示，Amuc_1100与Pam3CSK4（TLR2激动剂）一样，能促进Nfkb1mRNA的表达。同时，TLR2抑制剂CU-CPT22消除了这种影响（图1A），表明Akk菌外膜蛋白 Amuc_1100 通过直接与TLR2相互作用激活相关的信号通路。ELISA实验结果显示 Amuc_1100 增强TLR2的EC₅₀为0.3 μg/ml（图1B）。

图 1 Amuc_1100 通过与TLR2的直接相互作用激活RIN-14B细胞的NF-κB通路。RIN-14B细胞用TLR2抑制剂CU-CPT22（1 μM）预处理1 h或不处理1 h，然后用Pam3CSK4（5 μg/ml）和 Amuc_1100 （5 μg/ml）处理24小时。A）收集细胞颗粒，通过定量RT-PCR测定Nfkb1的表达与GAPDH管家基因的标准化。对照组，用HBSS处理RIN-14B细胞。（B）ELISA法检测Amuc_1100与TLR2的相互作用。数据是三个独立实验的代表，用平均值±SEM表示。^*p<0.05，^**p<0.01，^**p<0.001，采用 Tukey's检验后进行单因素方差分析。

2、 Amuc_1100 通过TLR2信号通路增加RIN-14B细胞中Tph1的表达和5-HT的合成

由于Amuc_1100能直接与TLR2结合并激活其下游信号，本文进一步研究Amuc_1100是否能通过TLR2促进EC细胞肠道5-HT的生物合成。本文采用RIN-14B细胞系作为EC细胞功能的模型，用 Amuc_1100 处理RIN-14B细胞24 h，然后检测5-HT合成限速酶Tph1的表达。发现 Amuc_1100 促进了Tph1的mRNA和蛋白质水平（图2A和C）。为了验证Amuc_1100促进Tph1表达的作用是通过TLR2信号途径发挥的，将RIN-14B细胞与CU-CPT22共同孵育1 h，然后用 Amuc_1100 或Pam3CSK4处理细胞24 h。本文的数据显示，CU-CPT22可以在mRNA和蛋白质水平上显著减弱 Amuc_1100 或Pam3CSK4促进的增强的细胞内Tph1表达（图2B和C）。此外，细胞上清液中5-HT浓度的测试结果也表明，Amuc_1100增加了5-HT生物合成，并且Amuc_1100对5-HT产生的这种增强也同样受到CU-CPT22的抑制（图2B）。这些结果表明，Amuc_1100可以通过激活TLR2信号通路增加RIN-14B细胞中Tph1的转录和表达，从而促进5-HT的生物合成。

图2 Amuc_1100通过TLR2信号增加RIN-14B细胞中Tph1的表达和5-HT的合成。RIN-14B细胞用Amuc_1100或Pam3CSK4处理24 h。收集上清液和细胞颗粒以测定（A）经TLR2抑制剂（CU-CPT22:1μM）预处理1 h或不预处理以及随后用Pam3CSK4或Amuc_1100激活后，Tph1表达标准化为GAPDH管家基因的定量 RT-PCR测定24 h。（B）用TLR2抑制剂CU-CPT22预处理1 h或不处理1 h，然后用Pam3CSK4或Amuc_1100活化24 h后，细胞上清液中的5-HT水平。（C）Tph1的western印迹的代表性图像和通过RIN-14B细胞裂解物中密度测定定量的Tph1的特异性条带在用TLR2抑制剂（CU-CPT22:1μM）预处理1 h或不预处理1 h以及随后用Amuc_1100处理24 h后进行Amuc_1100处理（20 μg/ml）。对照组，用HBSS处理RIN-14B细胞。对照组，用HBSS处理RIN-14B细胞。（B）ELISA法检测Amuc_1100与TLR2的相互作用。数据是三个独立实验的代表，用平均值±SEM表示。^*p<0.05，^**p<0.01，^**p<0.001，采用Tukey's检验后进行单因素方差分析。

3、 Amuc_1100 通过TLR2信号转导降低Caco-2细胞SERT表达

5-HT的活性主要依赖于其细胞外的有效性。据报道，在Caco-2/TC7细胞中激活TLR2可抑制SERT的表达，从而增加细胞外5-HT的利用率。为了检测Amuc_1100激活TLR2后SERT表达是否发生改变，本文用Amuc_1100处理Caco-2细胞24 h后检测SERT表达。结果显示，与Pam3CSK4一样，Amuc_1100降低了Caco-2细胞中的SERT mRNA和蛋白质水平（图3A-C）。用CU-CPT22预处理Caco2细胞1 h，然后用Amuc_1100孵育细胞24 h，发现CU-CPT22可以消除Amuc_1100对细胞SERT表达的抑制作用（图3A-C）。这些结果表明Amuc_1100可以通过TLR2增加Tph1的表达，并通过TLR2抑制SERT的表达，从而提高细胞外5-HT的利用率。

图3 Amuc_1100通过TLR2信号降低Caco-2细胞SERT的表达。（A）在TLR2抑制剂（CU-CPT22:1μM）预处理1 h或不预处理1 h以及随后用Pam3CSK4或Amuc_1100激活24 h后，用Pam3CSK4或Amuc_1100处理24h的细胞中SERT mRNA表达水平的定量RT-PCR。使用比较Ct方法（2^−ΔΔCT）进行相对定量。结果以任意单位表示（对照=1），是三个独立实验的平均值±SEM。与对照组比较^**p<0.01，^*p<0.05。（B）用TLR2抑制剂（CU-CPT22:1μM）预处理1 h与否及 Amuc_1100 处理24 h后，Caco-2细胞裂解液中SERT蛋白的western印迹的代表性图像。（C）用密度法定量SERT特异性条带。β-肌动蛋白作为负荷对照。对照组，Caco-2细胞经HBSS处理。数据是三个独立实验的代表，用平均值±SEM表示。^*p<0.05，^**p<0.01，^**p<0.001，用Tukey's检验后进行单因素方差分析。

4、 Akk 菌和Amuc_1100促进小鼠结肠中5-HT的生物合成

用广谱抗生素治疗的小鼠肠道微生物群大量减少，肠道中5-HT浓度降低。因此，本文使用抗生素治疗的小鼠作为动物模型，并探究了Akk菌和Amuc_1100对小鼠肠道5-HT系统的影响。C57BL/6小鼠用广谱抗生素治疗3周后，用Akk菌和Amuc_1100灌胃给药2周。然后进行ELISA，并在小鼠的结肠和血清中检测到显著的5-HT水平（图4A和B）。同时，本文还检测了结肠Tph1和SERT mRNA水平，发现Akk菌和Amuc_1100都增加了结肠中Tph1的表达（图4C），降低了SERT的表达（图4D）。免疫组化数据还显示，抗生素处理显著减少小鼠结肠5-HT染色，并且抗生素处理的小鼠在用 Akk 菌和Amuc_1100灌胃后结肠5-HT含量显著增加（图4E-H）。这些结果表明，Akk菌和Amuc_1100能促进宿主肠道5-HT的生物合成。

图4 Akk菌和 Amuc_1100 促进小鼠结肠中5-HT的生物合成。（A）结肠5-HT水平（n=3只小鼠/组）。（B）血清5-HT水平。（C）定量RT-PCR检测结肠Tph1表达与GAPDH管家基因的关系。（D）定量RT-PCR检测结肠SERT表达与GAPDH管家基因的关系。（E–H）使用Amuc_1100和Akk菌的广谱抗生素治疗小鼠中5-HT染色的结肠的代表性图像。对照组，正常小鼠每日灌胃PBS、抗生素，抗生素组小鼠每日灌胃PBS、Amuc_1100，抗生素组小鼠每日灌胃Amuc_1100、Akk菌，抗生素组小鼠每日灌胃Akk菌。数据是三个独立实验的代表，用平均值±SEM表示。^*p<0.05，^**p<0.01，^**p<0.001，用Tukey's检验后进行单因素方差分析。

5、Akk菌和Amuc_1100对抗生素治疗小鼠胃肠运动的改善作用

小肠中的5-HT水平与胃肠运动功能直接相关，定量改变可导致胃肠蠕动改变。由于本文的实验表明， Akk 菌和Amuc_1100可以增加结肠5-HT水平，本文下一个问题是，这是否会改善肠道运动。以抗生素处理的小鼠为动物模型，计数Akk菌和Amuc_1100灌胃后2 h内产生的粪球数，并测定相应的粪便含水量。本文的结果显示，小鼠在接受抗生素治疗2小时后，排便率显著降低（图5A），对照组每2小时10.5粒，抗生素治疗组每2小时8.5粒。灌胃Akk菌和Amuc_1100后，排便次数明显增加。本文测量了这些小鼠的粪便含水量，发现用抗生素治疗的小鼠粪便含水量降低，用 Akk 菌和Amuc_1100灌胃这些抗生素治疗的小鼠粪便丸的含水量可以得到改善（图5B）。这些结果表明， Akk 菌和Amuc_1100能增强小鼠胃肠动力，改善肠功能。

图5 Akk菌和 Amuc_1100 改善抗生素治疗小鼠的胃肠运动。（A）排便率通过2 h内产生的粪便颗粒数量相对于总转运时间（n=4）来测量。（B）粪便含水量通过2 h内产生的粪便颗粒的含水量来测量（n=4）。对照组：正常小鼠每日灌胃PBS、抗生素，抗生素组小鼠每日灌胃PBS、Amuc_1100，抗生素组小鼠每日灌胃Amuc_1100、Akk菌，抗生素组小鼠每日灌胃粘液假丝酵母菌。数据用平均值±SEM表示。^*p<0.05，^**p<0.01，^**p<0.001，用 Tukey's检验后进行单因素方差分析。

6、Akk菌和Amuc_1100恢复抗生素治疗小鼠的肠道微生物群

肠道微生物群与5-HT水平之间的关系是双向的，肠道5-HT的增加也会影响肠道微生物群的组成。例如，Clostridia和Turicibacteraceae的丰度增加，尤其是5-HT水平升高。因此，本文进一步探讨了Akk菌和Amuc_1100对抗生素治疗小鼠肠道菌群组成的影响。本文对使用或不使用Akk菌和Amuc_1100灌胃抗生素治疗的小鼠进行了16S rRNA微生物组测序，并分析了粪便微生物群落。本文在细菌V3-V4区域获得了1224291个高质量的Illumina读数。所有读取长度为401–440 bp；平均读取长度为421bp。根据测序结果得出的每个小鼠组的平均操作分类单元（OTU）数量和多个α-多样性指标，抗生素治疗小鼠肠道内的整体群落组成和多样性显著降低，这与先前的报告结果一致。用 Akk 菌和Amuc_1100灌胃后，这些抗生素处理的小鼠的肠道微生物群丰度和多样性显著增加。本文用维恩图和PCoA β-多样性分析比较了不同小鼠组的微生物组成和结构。本文证明，抗生素治疗组小鼠的肠道微生物群组成与常规饲养组小鼠有显著差异，只有2个OTU与常规未治疗组小鼠的OTU重叠（图6A和B）。用Akk菌和Amuc_1100灌胃给予抗生素治疗的小鼠的肠道微生物群与常规饲养的小鼠相似，分别有72%或71%的微生物重叠（图6A和B）。在分类水平上分析，抗生素治疗小鼠的肠道仅含有γ-蛋白杆菌成员，这与先前的结果一致；用 Akk 菌和Amuc_1100灌胃后，抗生素治疗小鼠肠道中的微生物种类增加，其中梭状芽胞杆菌的丰度显著增加（图6C），与文献报道的5-HT水平升高增加小鼠肠道Clostridia丰度一致。尽管用Akk菌和Amuc_1100灌胃的小鼠的肠道微生物群与传统饲养的小鼠有很高的相似性，但它们在某些微生物丰度方面存在差异（图6C和D）。为了在属水平上进行分析，抗生素处理的小鼠在用 Akk 菌或 Amuc_1100 灌胃后肠道中的Lactobacillus增加（图6E）；只有在用Amuc_1100灌胃后，Lachnospiraceae的肠道丰度才增加，然而，给药的小鼠与常规饲养的小鼠之间没有明显差异（图6G）。此外，抗生素处理的小鼠中Dubosiella的肠道丰度在用Amuc_1100灌胃后增加，但在用Akk菌灌胃后下降（图6F）。在抗生素处理的小鼠中，用Akk菌灌胃后，Akk菌显著增加（图6H）。这些结果表明，Akk菌和Amuc_1100可以恢复抗生素治疗小鼠肠道微生物群的多样性。

图6 Akk菌和Amuc_1100恢复了抗生素治疗小鼠的肠道微生物群。（A）维恩图显示四组肠道微生物群中OTU的重叠。（B）基于加权UniFrac距离的四组PCoA分析。每个图代表一个样本。（C）分类水平上的微生物分布。（D）属水平微生物分布。（E）Lactobacillus, (F) Dubosiella, (G) Lachnospiraceae 和 (H) Akk菌的相对丰度。对照组：正常小鼠每日灌胃PBS、抗生素，抗生素组小鼠每日灌胃PBS、Amuc_1100，抗生素组小鼠每日灌胃Amuc_1100、Akk，抗生素组小鼠每日灌胃粘液假丝酵母菌。。数据是三个独立实验的代表，用平均值±SEM表示。^*p<0.05，^**p<0.01，^**p<0.001，用Tukey's检验后进行单因素方差分析。

结论

5-HT系统是影响肠道微生物与宿主相互作用的重要机制。5-HT是一种多功能的生物胺，在一系列生理过程中发挥着重要的信号传递功能。大多数内部5-HT是由肠粘膜中的EC细胞合成的。肠道5-HT除了调节胃肠运动功能外，还与血小板聚集、骨密度控制、葡萄糖稳态和脂肪代谢等代谢活动有关。5-HT是连接肠道微生物群和宿主的信号中枢；5-HT水平的改变与T2D和肥胖有关。这些5-HT水平的变化可能是肠道微生物群影响宿主代谢调节的一种途径。研究结果表明，Akk菌外膜蛋白Amuc_1100与TLR2在肠道细胞上的相互作用增加了宿主肠道5-HT的含量。此外，由于5-HT系统与包括胃肠功能、炎症反应和代谢紊乱在内的生理过程有关，可以推断，Akk菌通过其外膜蛋白Amuc_1100调节其体内5-HT浓度是其改善或影响胃肠道疾病和代谢紊乱的重要途径之一。这就解释了Akk菌缓解和治疗IBD、肥胖、糖尿病和结直肠癌的内在机制。

肠道微生物群影响宿主肠道5-HT水平。目前已经证实，由孢子形成菌产生的代谢产物如SCFAs可以促进Tph1的转录并调节5-HT的生物合成。本研究的实验结果证明了特定肠道微生物Akk菌的这种特殊蛋白质Amuc_1100通过TLR2信号途径促进肠道5-HT利用的具体机制，证实了肠道微生物群和宿主之间通过5-HT系统的相互作用。在这项研究中，抗生素治疗的小鼠灌胃Akk菌或Amuc_1100后，结肠组织和血液中的5-HT浓度升高。最近报道，Akk菌及其胞外囊泡可增加实验小鼠结肠和海马的5-HT水平，但降低血清中的5-HT水平。这种差异可能是由几个原因造成的。其中一个可能是他们用常规小鼠，在小鼠被处死后从尾静脉采集血样，而本文用抗生素处理过的小鼠作为动物模型，采集血样后采集眼球杀死小鼠。另一个原因可能是5-HT系统受到复杂因素的影响，如免疫系统和代谢，甚至肠道微生物群。

肠道5-HT浓度的改变直接影响宿主的生理，影响肠道微生物的组成和丰富度，进而影响多种宿主生理功能。5-HT可直接或间接作用于免疫系统，进而影响微生物群落结构和定殖；调节宿主免疫反应影响宿主如何处理病原菌或共生菌。T. sanguinis具有与哺乳动物SERT同源的蛋白质。肠道5-HT促进了这种细菌的生长，随后影响了多种宿主遗传途径的肠道表达，包括参与脂质和类固醇代谢的途径，从而降低了宿主的甘油三酯水平。本研究表明，Akk菌及其外膜蛋白Amuc_1100能恢复抗生素治疗小鼠肠道菌群的组成，并证实了肠道5-HT与肠道菌群之间的双向关系。

Amuc_1100或Akk菌能促进小鼠结肠5-HT的生物合成，提高其水平，从而改善肠道功能和营养。这种营养物质，即使是5-HT本身，也能促进某些肠道细菌的生长。5-HT可通过宿主免疫系统影响肠道菌群，从而影响肠道菌群的定殖和相互作用。

研究表明，肠道生理功能障碍与心理健康障碍之间存在相关性。例如，患有自闭症谱系障碍（ASD）的儿童经常表现出胃肠道紊乱，如胃痛、腹泻或便秘，有时伴有炎症性肠病。此外，慢性便秘患者抑郁的患病率高达33%。此外，宿主的代谢功能障碍通常与精神疾病有关。例如，抑郁症状更常见于代谢功能障碍患者，包括肥胖症、1型糖尿病和T2D。作为ENS和CNS发育和功能的关键调节因子，5-HT可能能够连接肠道和微生态系统。分泌的5-HT在失活前必须转运回细胞，而Tph1和SERT表达的改变可导致用于神经传递的5-HT浓度的改变。5-HT的神经传递行为也受到肠道微生物群的影响。肠道菌群对色氨酸代谢和5-HT系统的影响可能是这一调控的重要因素。这种关系背后的机制需要进一步阐明。

由于肠道菌群对5-HT生物合成有重要影响，而TLR2可以直接接受肠道菌群的刺激，因此肠道菌群、宿主TLR2和5-HT之间可能存在着密切的关系。位于肠道粘液层的Akk菌能显著改善宿主肠道炎症和代谢紊乱，如肥胖症和糖尿病；其外膜蛋白Amuc_1100 可能通过TLR2发挥作用。本文的研究表明，Amuc_1100通过与TLR2分子的直接相互作用，可以促进5-HT合成限速酶Tph1的表达，反过来抑制5-HT转运蛋白SERT的表达，从而调节宿主肠道5-HT水平的改变。同时，总结了Amuc_1100对Akk菌的作用，Amuc_1100可以改善抗生素治疗小鼠的肠道运动，恢复肠道微生物的数量和种类。这阐明了Akk菌与宿主相互作用的具体机制，并解释了Akk菌和Amuc_1100改善宿主肠道功能、炎症和代谢紊乱的作用途径。本研究揭示了Akk菌与宿主相互作用的分子机制和途径，为肠道靶向治疗和相关药物治疗药物的开发提供了基础。