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科研 | Nat. Commun.: 交叉反应性单克隆抗体描述了冠状病毒刺突蛋白中保守的免疫原性和易受攻击的位点

2021

05/26

微生态

A-

A+

交叉反应抗体定义了冠状病毒刺突蛋白保守的、免疫原性和脆弱的位点。

编译：微科盟光影，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载。

导读

冠状病毒刺突糖蛋白，位于病毒粒子表面，介导细胞入侵的主要蛋白因子，是发展保护性抗体和研究疫苗的关注焦点。结构学研究显示刺突蛋白三聚体构象表面暴露的位点可能由具有跨物种特异性的抗体识别。作者通过免疫人源化小鼠，分离得到2种人单克隆抗体，对不同的β冠状病毒，包括SARS-CoV, SARS-CoV-2, MERS-CoV 以及区域性人类冠状病毒HCoV-OC43等病毒刺突蛋白具有交叉反应性。2个单克隆抗体都靶定刺突蛋白三聚体融合前构象中S2融合亚基茎干螺旋，形成膜近端螺旋束暴露表面。2种抗体能够阻止MERS-CoV感染细胞，以及在预防性和治疗性模型中，保护小鼠免受再次感染MERS-CoV病毒后死亡的威胁。研究表明β冠状病毒刺突蛋白免疫原性和脆弱性位点诱导产生具有独特的抗原抗体结合范围的抗体。

论文ID

原名：A conserved immunogenic and vulnerable site on the coronavirus spike protein delineated by cross-reactive monoclonal antibodies

译名：交叉反应性单克隆抗体描述了冠状病毒刺突蛋白中保守的免疫原性和易受攻击的位点

期刊：Nature Communications

IF：12.121

发表时间：2021.3.17

通讯作者：Berend-Jan Bosch

通讯作者单位：乌得勒支大学兽医学院

实验设计

背景

2019年后半年，在中国严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的引发新冠疾病2019（COVID-2019）大流行。该病毒属于正冠状病毒亚科β冠状病毒属Sarbecovirus亚属。过去20年中出现其它2个人畜共患病病毒，与SARS-CoV-2病毒一样，造成人类严重急性呼吸系统疾病。SARS-CoV病毒，与SARS-CoV-2病毒具有亲密的亲缘关系，属于Sarbecovirus亚属，2002年该病毒在中国跨越物种屏障，从而在人群中传播，直至2003年传播被控制时，造成世界范围内8000多例感染病例，致死率达到10%。10年后即2012年，中东地区呼吸系统综合征（MERS）冠状病毒（β冠状病毒属Merbecovirus亚属）出现在沙特阿拉伯。这个病毒在人类群体中反复出现，从单峰骆驼跨物种传播到人类后，在人群中有限地传播，该病毒导致出现2500个感染病例，死亡病例高达35%。另外，4种区域性人类的新冠病毒在人类中反复出现，包括HCoV-229E 和HCoV-NL63 (α冠状病毒属)，HCoV-OC43和HCoV-HKU1（β冠状病毒Embecovirus亚属）。尽管这些病毒典型地与轻度呼吸系统疾病相关（常见感冒），但是它们也会造成显著的死亡率，尤其会导致免疫缺陷个体的全部死亡。上述所有的病毒利用自身具有的方式从动物传播到人类，造成新冠病毒的人畜共患病和人群大流行。新冠病毒大流行对社会经济造成的毁灭性的打击促使社会制定干预策略，减轻未来新型新冠病毒爆发造成的危害。

鉴定与人类新冠病毒存在广泛互作的抗体能够为应对新冠流行做准备。这种抗体可能在新冠大流行早期阶段的诊断中发挥重要作用。而且，病毒表位发现使得研发基于抗体的疗法和疫苗成为可能，不仅能够抵御目前出现的病原体，而且可能抵御未来出现的新型病原体。尽管其它病毒家族已经鉴定得到广泛应答抗体，但是新冠病毒的研究仍然处于初期阶段。一项研究报告了25%康复期SARS患者的血清能够以低滴度中和MERS-CoV病毒，显示人类多克隆血清可能存在交叉反应性抗体。此外，Barnes等人报道了从10名康复期COVID19患者中纯化的lgG抗体具有对MERS-CoV刺突蛋白的反应性，而且Wec等人报道了从SARS-CoV康复期病人体内分离得到的一系列具有SARS-CoV2交叉反应性的抗体，能够与一种或者多种地方性的HCoV刺突蛋白发生反应。但是目前对这种交叉反应性抗体的功能和抗原表位仍然知之甚少。

冠状病毒中和抗体靶定病毒表面三聚体刺突糖蛋白，介导病毒黏附和入侵宿主细胞。数个三聚体刺突蛋白冷冻电子显微镜结构显示该蛋白包括三个S1受体结合亚基，以及覆盖的S2融合亚基三聚体。大多数抗体通过结合S1受体结合亚结构域阻断病毒与受体的相互作用来中和冠状病毒感染。这些抗体是高度物种特异性的，通常也是毒株特异性的，因为冠状病毒受体结合位点具有高度序列特异性，即使是那些结合同一受体的病毒也是如此（例如SARS-CoV和SARS-CoV-2）。最近，靶向S1亚基的单克隆抗体结合受体结合位点的远端区域，能够交叉中和Sarbecovirus亚属冠状病毒，具有体内保护效果。为研发广泛-萨贝病毒疫苗提供潜在新方向。针对不同属冠状病毒的广泛中和抗体不太可能被发现，因为所有冠状病毒刺突蛋白的氨基酸序列相似性较低。相比于S1亚基，通过受体诱导的构象重排介导病毒和细胞膜的融合的膜锚定的S2亚基，在冠状病毒刺突蛋白中具有更高水平的氨基酸序列保守性。结构研究表明具有跨物种特异性的抗体可能靶向刺突蛋白三聚体的S2亚基暴露位点。在这里，作者提出的第一个证据表明一类S2亚基靶向抗体对不同亚属的人类β冠状病毒具有广泛反应，并描述抗体的抗病毒活性、抗原表位以及体内保护效果。

结果

人类单克隆抗体对β冠状病毒刺突蛋白的交叉反应性。目前已知引起人类疾病的七种冠状病毒中有五种属于β冠状病毒属，包括SARS-CoV和SARS-CoV-2（Sarbecovirus亚属）、MERS-CoV（Merbecovirus亚属）和区域性的HCoVs病毒HCoV-OC43和HCoV-HKU1（Embecovirus亚属）。为了诱导和分离具有跨物种特异性的β冠状病毒属靶向抗体，我们早期按照附录图1a中免疫方案，使用不同亚属的三中人类β冠状病毒(HCoV-OC43、SARS-CoV和MERS-CoV)三聚体刺突蛋白胞外结构域免疫小鼠。免疫编码人类免疫球蛋白库的转基因H2L2小鼠获得人类抗体。根据对3种刺突蛋白抗原中至少一种的发生反应筛选获得203种杂交瘤，并通过ELISA检测杂交瘤上清筛选了它们对5种不同β冠状病毒刺突蛋白的交叉反应性（附录图1b)。基于对多种β冠状病毒刺突蛋白的ELISA广泛反应的特征，筛选获得抗体28D9以及以前分离出的MERS-S人类单克隆抗体1.6C7。抗体1.6C7和28D9是人类重组表达的IgG1同型抗体，在随后实验中对两种抗体交叉反应性、交叉中和能力、作用机制、表位特性和体内保护效果进行了比较。

为了检测1.6C7和28D9单克隆抗体的交叉反应性，通过ELISA测定单克隆抗体与五种感染人类 β 冠状病毒和HKU1相关小鼠肝炎病毒(MHV)刺突蛋白的结合能力。通过在所有抗原C端标记strep标签，验证了不同抗原的等摩尔抗体包被。28D9-较少程度上1.6C7-具有交叉反应性，与不同病毒亚属β冠状病毒包括MERS-CoV（Merbecovirus亚属）、SARS-CoV和SARS-CoV-2（Sarbecovirus亚属））、HCoV-OC43和MHV（Embecovirus亚属）发生反应，而与HCoV-HKU1（Embecovirus亚属）刺突蛋白外部结构域（秒）无反应性。基于ELISA的半最大效应浓度(EC50)值显示两种单克隆抗体同等程度结合MERS-Secto和OC43-Secto。与1.6C7相比，28D9具有更为优越的交叉反应活性，与SARS-Secto, SARS2-Secto 和MHV-Secto具有更强的结合能力（图1a）。两种抗体与MERS和MHV病毒S2胞外结合域(S2ecto)发生反应，表明两种抗体的抗原表位位于CoV病毒刺突蛋白的S2融合亚基。

图1. 人类单克隆抗体28D9和1.6C7对β冠状病毒刺突蛋白交叉反应性 a.相同摩尔浓度的Strep标记S胞外结构域和S2胞外结构域（S2ecto）来自不同亚属的β冠状病毒，包括MERS-CoV（Merbecovirus亚属）、SARS-CoV和SARS-CoV-2（Sarbecovirus亚属）、HCoV-OC43和HCoV-HKU1（Embecovirus亚属）和MHV（Embecovirus亚属）包被固相结合物，测定单克隆抗体28D9和1.6C7 ELISA结合曲线（上列图片）和相应的基于ELISA的半最大效应浓度（EC50）滴度（下列图片）。靶定Strep-标记抗原的抗Strep单克隆抗体验证抗原摩尔量相同。n.b，不结合。柱形图表示平均值±方差（SD）。空心圆代表一个单独数据，n=2个生物复重复和2个技术重复。源数据将作为源数据文件提供。b. 免疫荧光法检测单克隆抗体1.6C7和28D9与HEK-293T细胞表达的GFP标记MERS-CoV、SARS-CoV、SARS-CoV-2、HCOV-OC43、HCOV-HKU1和MHV全长刺突蛋白结合能力。重叠图像中的细胞核是由DAPI染色。使用LeicaSpeII共聚焦显微镜记录荧光图像。代表性的图像来自n=2生物学重复。比例尺为100 μm。

利用生物层干涉测量法测定交叉反应抗体与固定在生物传感器表面的CoV Secto三聚体的结合动力学以及亲和力。1.6C7单克隆抗体与MERS-CoV Secto三聚体、HCOV-OC43 Secto三聚体结合的平衡解离常数(KD)分别为0.58和5.28 nm。与ELISA结果一致，1.6C7单克隆抗体与SARS-CoV和SARS-CoV2 Sectto三聚体呈现低亲和力结合，平衡解离常数(KD)分别为25.22和26.18μM。28D9单克隆抗体与MERS-、OC43、SARS和SARS2病毒刺突蛋白的平衡解离常数(KD)分别为0.72、7.45、3.17和5.96 nm（附录图3）。

为了评估1.6C7和28D9单克隆抗体是否能结合全长（膜锚定）刺突蛋白。我们使用免疫荧光显微镜和流式细胞术检测了抗体对瞬时表达不同(GFP标记)CoV刺突蛋白细胞的反应性。表达HCoV-OC43、MERS-CoV和MHV刺突蛋白的渗透性和非渗透性细胞中都发生1.6C7抗体结合，28D9抗体额外与表达SARS-CoV和SARS-Co-V-2的刺突蛋白的细胞结合（图1b，附录图4，附录表1）。而两种抗体均不结合表达HCOV-HKU1刺突蛋白的细胞。这些数据表明，两种抗体均可以与全长刺突蛋白反应，并与CoVSecto ELISA反应特异性一致。

图2. 单克隆抗体28D9和1.6C7的交叉中和能力及作用机制 a. MERS-CoV 、SARS-COV、SARS-SCOV-2和HCOV-OC43刺突蛋白形成的VSV假病毒编码荧光素酶蛋白，抗体介导感染假病毒中和作用。用指定浓度抗体与VSV假病毒颗粒预先孵育后，感染CCL81细胞（MERS-S VSV假病毒）、E6细胞（SARS-S和SARS2-S VSV假病毒）或HRT-18细胞（OC43-S VSV假病毒），结合非抗体处理对照组，测定转导20h后细胞裂解物中荧光素酶活性计算病毒感染率（%）。结果显示了至少两个独立实验获得平均值±方差(n≥6)。Iso-CTRL：采用人类抗Strep标签单克隆抗体作为抗体同型对照。结果显示了IC50和IC90值。源数据将作为源数据文件提供。b. 抗体介导MERS-CoV、SARS-COV、SARS-SCOV-2病毒感染中和作用。如上所述，通过对CCL81细胞（MERS-CoV）或VeroE6（SARS-CoV和SARS-CoV-2）进行菌块减少中和试验(PRNT)显示真实的病毒中和作用。实验使用三份样本进行，结果显示了平均值±方差。实验计算获得IC50和IC90值。源数据作为源数据文件提供。c.基于ELISA的受体结合抑制试验。用系列稀释的单克隆抗体预孵育的MERS-Secto，加入包被有人类可溶性DPP4蛋白ELISA板中，HRP偶联抗体识别MERS- Secto C端Strep标签，检测MERS-Secto片段与DPP4的结合。数据点代表了来源于两个独立实验重复（n=3）的平均值±方差。源数据将作为源数据文件提供。d细胞-细胞融合抑制试验。转染GFP-MERS-CoV S质粒的Huh-7细胞与1.6C7和28D9单克隆抗体预孵育，或与不相关的异型对照抗体进行预孵育，然后使用胰蛋白酶处理激活MERS-COVS蛋白的膜融合功能。用荧光显微镜观察MERS-S介导的合胞体的形成。图像显示了表达MERS-S-GFP的细胞（绿色）和DAPI染色的细胞核（蓝色）的重叠图像。实验进行了两次，结果显示一个代表性实验数据。源数据将作为源数据文件提供。

单克隆抗体28D9和1.6C7交叉中和能力及其作用机制。接下来，评估了两种单克隆抗体针对HCoVs的中和活性。1.6C7和28D9抗体中和了MERS-S假VSV（IC50分别为0.39和0.13μg/ml）病毒感染以及真实的MERS-CoV（IC50分别为0.083和0.93μg/ml）的感染。两种抗体对真实的SARSCoV和SARS-CoV-2没有中和作用，但使用中和敏感性VSV假病毒系统检测到28D9单克隆抗体具有低水平交叉中和活性。28D9单克隆抗体抑制SC43-S、SARS-S和SARS假病毒VSV感染，IC值分别为64.9、60.5和45.3μg/毫升。(图 2a). 为了理解病毒中和的机制，我们评估了单克隆抗体对刺突蛋白介导的受体结合和膜融合活性的干扰能力。与早期1.6C7单克隆抗体的观察结果一致，28D9单克隆抗体抑制MERS-S驱动的细胞-细胞融过程合，但未影响MERS-Secto/DPP4受体的相互作用（图2c，d)，表明这两种S2靶向抗体都抑制了感染所需的刺突蛋白S2亚基的膜融合功能。

图3. 单克隆抗体1.6C7和28D9靶定S2融合亚基的茎干区域的一个线性表位a. 用生物层干涉法分析抗体结合竞争能力。固定化MERS-Secto抗原在与给定的单克隆抗体完全饱和结合（步骤1），之后加入第二种单克隆抗体（步骤2）。第二种抗体结合表示存在未占用的抗原表位，而没有结合表示第一个单克隆抗体完全结合并阻断相同的抗原表位。此外，第一种单克隆抗体加入步骤二中，检测自我竞争。结果测定靶向S2亚基单克隆抗体1.6C7和28D9以及MERS-S1抗体对照(7.7G6)43的竞争结合能力。源数据将作为源数据文件提供。B.1.6C7和28D9单克隆抗体识别线性表位。1.6C7和28D9单克隆抗体与未经处理的MERS-Secto（非变性,“nd”）和SDS和DTT存在时热变性的MERS-Secto的ELISA结合曲线（变性，“d”）。靶向MERS-S1结构域（7.7G6）抗体和8个残基长度线性Strep标签表位（anti-Strep）抗体作为对照。源数据作为源数据文件提供。C.1.6C7/28D9抗体识别表位定位到MERS-S中HR2上游15个氨基酸中茎干螺旋区域。1.6C7和28D9单克隆抗体针对覆盖MERS-Secto保守C端区域（残基869-1288）30个氨基酸长肽(具有15个氨基酸残基重叠)肽库的ELISA反应。两种抗体与两个肽段（蓝色和橙色柱形图）结合，并与两个肽段中重叠的15个残基（绿色棒；MERS-S残基1229-1243）发生结合反应。该表位区域位置见MERS-S蛋白结构图，包括刺突蛋白亚基（S1和S2）、S1结构域（A至D）、融合肽(FP)、七重复结构域1（HR1）、七重复结构域2（HR2）和跨膜结构域(TM)。源数据作为源数据文件提供。ELISA结果显示到1.6C7/28D9单克隆抗体识别表位是8个氨基酸长肽“DELDEFFK”。1.6C7和28D9单克隆抗体与MERS-S的15个氨基酸残基肽片段N段和C段截短突变体的ELISA结合曲线。数据点代表了来自n=2技术重复的平均值。源数据作为源数据文件提供。

单克隆抗体1.6C7和28D9靶定S2融合亚基的茎干区域的线性表位。使用生物层干涉测量法测定这两种抗体与MERS-Secto竞争结合能力。MERS-Secto结合1.6C7抗体后，完全抑制28D9结合，反之亦然，表明两种单克隆抗体靶向相同的重叠表位(图3a)。为了评估表位的构象特异性，检测1.6C7和28D9单克隆抗体与未处理的MERS-CoV Secto抗原和在SDS和DTT存在时热变性的抗原的ELISA反应性，两种抗体与非变性和变性蛋白的反应性相同，而MERS-S1靶向抗体7.7G643只与非变性抗原发生反应。这些数据表明，1.6C7和28D9单克隆抗体可能在MERS-S中结合一个线性的、连续的氨基酸序列（图3b）。

由于这两种抗体可能结合线性表位，利用一组氨基酸重叠的合成肽（30个氨基酸肽段中重叠15个残基），覆盖MERS-S2ecto保守的C端部分（869-1288残基），通过ELISA方法定位抗原表位。两种抗体结合相同位置，位于MERS-S2融合亚基中七次重复2(HR2)区域上游的15个残基的区域(MERS-S残基1229-1243)(图3c)。1.6C7/28D9抗体结合15个残基N端和C端截短肽段，揭示MERS-S蛋白D¹²³³ELDEFFK¹²⁴⁰肽段作为最小表位区段提供两种抗体的结合能力。

图4. 一种基于ELISA表位丙氨酸突变技术包含1.6C7和28D9单克隆抗体线性表位的15个氨基酸残基刺突蛋白肽段丙氨酸突变ELISA结果使用最大半数有效浓度（EC50）滴度（μg/ml）显示。结果来自两个独立实验的平均值。源数据作为源数据文件提供。B.MERS-CoV、HCOV-OC43、SARS-CoV、SARS-CoV-2、MHV和HCOV-HKU1的1.6C7/28D9单克隆抗体表位区域的序列比对。C. 刺突蛋白胞外结构域单位点突变定位1.6C7和28D9抗体结合位点。左侧结果显示基于ELISA测定1.6C7/28D9抗体与核心表位区域单一氨基酸取代突变体结合EC50滴度(μg/ml)。采用抗MERS-S1对照抗体7.7G6来控制所有突变体的表达水平。n.b，没有结合。平均值来自n个=2的生物学重复。源数据将作为源数据文件提供。D. 流式细胞术检测28D9和1.6C7抗体与细胞表面表达(GFP标记)核心表位区域中单一位点突变MERS-S突变体结合能力。AF594偶联二抗检测抗体结合。通过计算GFP+/AF594+细胞相对于GFP+细胞的百分比确定相对表面结合。MERS-S1抗体7.7G6控制所有单位点突变体的细胞表面表达水平。星号表示L1235A突变体的细胞表面表达减少。n.b，没有结合。平均值来自n=2的生物学重复。源数据将作为源数据文件提供。

通过突变精确绘制刺突蛋白单克隆抗体的结合位点为了定位1.6C7/28D9抗体结合的关键残基，我们对包含线性表位的15个氨基酸残基肽段进行了基于ELISA的表位丙氨酸扫描突变。对肽段的丙氨酸扫描分析确定了3个残基（D¹²³⁶、F¹²³⁸和F¹²³⁹）是结合两种抗体的关键氨基酸残基（图4a和附录图5），此外，另外四个残基(D¹²³³、E¹²³⁴、L¹²³⁵和E¹²³⁷)结合28D9抗体，并在一定程度上与1.6C7抗体结合。为了确认表位丙氨酸扫描数据，检测1.6C7/28D9单克隆抗体对核心表位区域中含有丙氨酸取代的单位点MERS-Secto突变体的ELISA反应性。与肽段丙氨酸扫描结果一致，三个残基D¹²³⁶、F¹²³⁸和F¹²³⁹丙氨酸取代阻止两种抗体的MERS-Secto结合，抗MERS-S1对照抗体7.7G6未受影响。

为了评估在全长膜锚定刺突蛋白背景下抗体结合关键残基单独的贡献，采用基于流式细胞术的方法，测定细胞表面表达的MERS-S突变体与抗体结合能力 (图4d)。采用抗MERS-S1 7.7G6抗体控制MERS-S单个位点突变体的细胞表面表达水平。除了L¹²³⁵A突变体外，所有刺突蛋白突变体都表现出与野生型相似的表面表达水平。MERS-S核心表位区(D¹²³³ELDEFFK¹²⁴⁰)残基取代在不同程度上下调两种抗体结合能力，尽管分析L¹²³⁵A突变体结合数据受到胞表面表达水平降低的干扰。与基于ELISA的分析相一致（图4a、c）。D¹²³⁶、F¹²³⁸和F¹²³⁹的突变对两种抗体结合影响最大。这两种抗体在三种抗原结合试验中都表现出相似的结合模式。（图4a、c、d和附录图5），结果显示的反应中细微差异，可能代表这两种抗体之间及其交叉刺突蛋白结合特性的差异。

刺突蛋白表位区域(MERS-S中D¹²³³ELDEFFK¹²⁴⁰)结合1.6C7/28D9抗体的关键氨基酸残基在靶定的β冠状病毒中不完全保守，交叉反应抗体结合的三个残基(MERS-S中D1233、D1233、D1236和F1238)存在变化（图4b）。为了评估这些氨基酸突变对抗体结合的贡献，MERS-S进行了单一位点取代突变。可溶性和全长D¹²³³S、D¹²³³E、D¹²³⁶S、F¹²³⁸W和F¹²³⁸Y MERS-S突变体分别通过ELISA（图4c）和流式细胞术（图4d）测定抗体结合能力。将MERS-S中的D¹²³³替换成丝氨酸（S在HKU1-S中发现）或谷氨酸（E在SARS-、SARS2-、OC43-和MHV-S中发现）仍然与两种抗体有效结合。此外，与MERS-SF¹²³⁸A突变体相反，F1238被色氨酸(W，在HKU1-、OC43-和MHV-S发现)或酪氨酸(Y，在SARS和SARSY发现)取代的MERS-S突变体维持抗体结合反应性。然而，SARS-S中氨基酸单一位点取代突变体(SARS-S中的Y1137F)导致1.6C7抗体与SARS-S突变体的结合显著增加。相反，这种替代并没有改变28D9抗体ELISA的结合活性（附录图6）。这些数据表明抗原表位区域允许有一定程度的序列变异性，不会影响抗体结合能力，尽管28D9和1.6C7抗体之间略有差异。特别是显示最广泛反应性的28D9抗体，MERS-S残基位置1238处似乎允许使用不同的芳香族残基（Phe,Trp and Tyr）而不会影响抗体结合。相反，MERS-S的D1236S替代(HKU1-S中发现)导致两种抗体结合抗原能力完全丧失。HKU1-S中的氨基酸残基氨基酸替换（HKU1-S中的S¹²³⁹D）足以恢复28D9抗体以及一定程度恢复1.6C7抗体结合能力（附录图7）这些数据合理化显示MERS-COV、SARS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-OC43和MHV刺突蛋白与两种抗体结合活性，以及HCOV-HKU1刺突蛋白不能结合两种抗体。显然，在两种不同的动物免疫实验中获得两种抗体通过抗原表位定位揭示两种抗体靶定相同的表位。从独立的小鼠免疫实验（DNA+蛋白免疫）鉴定得到第三个交叉反应性单克隆抗体，靶定β冠状病毒刺突蛋白的相同位点（单克隆抗体18H2，附录图8），表明这个表位具有免疫原性，能够有效诱导交叉反应抗体产生。

1.6C7、28D9和18H2单克隆抗体的可变区序列经分析表明它们的重链和轻链分别来自相同的IGHV6-1和IGKV4-1胚系前体基因（附录图9）。由于这些抗体是从三个不同的免疫实验中获得的，因此没有克隆相关性，与之前报道的其他病毒表位相似，揭示表位依赖的优先胚系基因使用和VH/VL配对以及对同源抗原的亲和力。抗体重链和轻链序列发生体细胞突变，在CDR3区域发生改变。28D9抗体VH区域发现了7个体细胞超突变导致氨基酸序列发生变化，而在1.6C7发现了6个超突变。在28D9抗体VL区域发现了7个体细胞超突变，而在1.6C7抗体发现了2个超突变。

抗原糖基化修饰通常是抗体结合的决定因素。WesternBlot实验显示抗原去糖基化导致28D9抗体与OC43-Secto、MHV-Secto和SARS-Secto的结合能力下降（附录图10a）。而1.6C7抗体则是相反的情况。测定在MERS-S中位于核心表位区下游(D1233ELDEFFK1240)的N段连接聚糖的氨基酸。N-糖基化序列子(NxS/T)在β冠状病毒的刺突蛋白中保守（图5a)，删除MERS-Secto 蛋白N¹²⁴¹糖基化位点并不影响两种抗体的结合（附录图10b）。相反，OC43-Secto同源糖基化位点(OC43-S编号为N¹²⁴³)的缺失完全丧失28D9抗体ELISA反应，而1.6C7抗体的ELISA反应几乎没有改变。这些数据表明28D9抗体参与结合抗原N段糖基化，然而由于糖基化消失造成的表位构象完整性的缺失也可以作为一种替代解释。

1.6C7和28D9抗体靶向冠状病毒刺突蛋白的茎干螺旋。虽然28D9/1.6C7抗体结合表位区域存在于5个β冠状病毒刺突蛋白胞外结构域，冷冻电子显微镜阐明其融合前结构，但表位区域C端在冷冻电子显微镜中图中分辨不佳，揭示表位区域的构象灵活性。最近，纯化全长刺突蛋白冷冻电子显微镜分析结果揭示三聚体SARS-CoV-2融合前后表位信息。融合前SARS-CoV-2刺突蛋白冷冻电子显微镜结果显示表位(SARS2-S中E¹¹⁵⁰ELDELDKYFK¹¹⁵⁷)是分子膜近端基处20残基构成α螺旋的一部分（图5b）。HCOV-NL63刺突蛋白的相应区域同样被命名为“茎干”螺旋。三个刺突蛋白前体茎干螺旋沿着三倍对称轴排列，形成一个结合抗体的螺旋束，β冠状病毒刺突蛋白上表明暴露残基具有相对高水平的保守性(附录图11)。值得注意的是，这两种抗体也可以结合融合后的刺突蛋白结构，例如它们结合融合后MHVS2ecto暴露残基(图。1a)。在S2融合后结构域中，茎干螺旋的N端和C端残基解螺旋，而中部(SARS2-S中的F¹¹⁴⁸KEELD¹¹⁵³)仍然折叠为短的、表面暴露的螺旋，垂直于中心螺旋。

自然感染过程中，抗体靶向茎干螺旋表位。接下来分析了人类和单峰骆驼的自然感染MERS-CoV，是否产生针对刺突蛋白茎干螺旋表位或其他线性表位的抗体。用5个人类和4个单峰骆驼MERS-CoV阳性血清对全长刺突蛋白（MERS-S 蛋白1–1296残基）905个重叠肽进行刺突蛋白肽微阵列分析确定了16个线性核心表位（图6和附录图12）。5个线性表位集中在包含HR2区域的刺突跨膜结构域上游的±80残基区域，在融合过程中经历了广泛的结构重排。五个肽中一个肽(D¹²³⁰FQDELDEFFKNVS¹²⁴³)与1.6C7/28D9抗体的表位核心区域DELDEFFK相同（图6c）。与其他鉴定的线性肽表位相比，人类（3/5）和和单峰骆驼（2/4）MERS阳性血清（图6c和附录图12）更容易识别这个肽表位。这些数据表明这个表位的抗体不仅在刺突蛋白免疫小鼠过程中能有效地诱导产生，而且在人类和单峰骆驼的自然感染MERS-CoV中也能被有效诱导产生。

图5. 1.6C7和28D9单克隆抗体结合冠状病毒刺突蛋白的膜-近端茎干螺旋结构域 使用EMBL-EBI Clustal Omega programme(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/ clustalo/)进行包含1.6C7和28D9单克隆抗体结合表位的α、β冠状病毒刺突蛋白序列比对。28D9和1.6C7抗体的核心表位区域由一个矩形框圈出，对抗体结合至关重要的残基由星号标记。在β冠状病毒刺突蛋白中发现的保守糖基化序列子（NxS/T）（核心表位下游的一个氨基酸）进行下划线注释标注。注释茎干螺旋、七个重复区域2（HR2）和跨膜域(TM)的开始。使用ESPP3.0（http://espript.ibcp.）可视化分析SARS-Co-V-2融合前刺突蛋白（PDB：6XR8）和融合后刺突蛋白（PDB：6XRA）结构的二级结构元件。b. 融合前和融合后SARS-CoV-2刺突蛋白（PBD：6XR8）和S2（PDB：6XRA）的结构构象。结构为表面透明的灰色螺旋条带，对应茎螺旋表位的部分为橙色。镶嵌：放大两个结构中的两个不同方向的外延区域部分，保守的N端糖基化以红色突出显示。

图6. 自然感染过程中产生靶向茎干螺旋表位的抗体 a.MERS-CoV突刺蛋白的结构示意图。刺突蛋白亚基（S1和S2）、S1结构域（A到D）、融合肽(FP)、七重复结构域1（HR1）、七重复结构域2（HR2）和跨膜域(TM)。b. 使用MERS阳性的人和单峰骆驼血清进行刺突蛋白肽微阵列分析。合成了覆盖整个MERS-CoVs刺突蛋白胞外结构域（残基1-1296）的905个重叠肽，有一个或两个残基的偏移。基于PEPSCAN的ELISA评估了5个恢复期的MERS阳性患者（H1-H5）和4只单峰骆驼（D1-D4）血清以及人类（H-CTRL）或骆驼(DCTRL)的MERS阴性血清与肽库的结合。结果显示单个肽的信号强度的累积热图。信号强度从浅红色增加到红色，而白色对应于背景信号。源数据作为源数据文件提供。

抗体介导保护MERSCoV或SARS-CoV感染小鼠。为了评估靶定茎干螺旋表位抗体的体内保护能力，使用表达人类DPP4转基因小鼠模型检测1.6C7单克隆抗体对感染致死性剂量MERS-CoV产生的预防和治疗能力。20-30周大小鼠用使用致死剂量MERS-CoV病毒感染（前）或（后）感染24小时腹腔注射50μg抗体（相当于每kg体重1.8mg单克隆抗体）。采用高效MERS-CoV中和抗体7.7G6和无关免疫球蛋白IgG1同型控制抗体作为对照（图7a），监测10天内小鼠生存率和体重百分比变化。治疗前和治疗后注射同型对照组小鼠中，MERS-CoV在8-10天之间造成小鼠100%死亡，体重显著减轻。相比之下，治疗前和治疗后注射1.6C7抗体可以保护小鼠免于死亡威胁，7.7G6抗体治疗后可以保护80-100%的小鼠免于死亡。相对于同型对照处理的小鼠，用7.7G6或1.6C7抗体处理的小鼠体重下降幅度明细降低（图7a）。

为了研究病理学和病毒载量的下降情况，在感染后第3天（3只）和8-10天（5只）收集小鼠肺组织。在同型对照治疗的小鼠中，病毒RNA与非抗体治疗（模拟处理）的小鼠相比没有明显差异。然而，在病毒感染前或后接受1.6C7抗体治疗的小鼠感染后第三天病毒RNA滴度降低1-2个对数级，而在8-10天时出现2-3个对数级下降（附录图13a）。感染前/后注射抗体，小鼠感染病毒第3天肺部分离得到的感染性病毒类似的减少，而在感染第8-10天，不能从小鼠的肺部中分离出感染性病毒（附录图13a）。小鼠感染前和感染后注射1.6C7抗体在MERS-CoV感染第3和8-10天后肺病理和炎症显著降低，与小鼠测定病毒RNA水平和病毒滴度结果一致（附录图13b）。

图7. 抗体介导保护小死的MERS-Co病毒/SARS-CoV病毒感染的小鼠 a. 使用表达人类DPP4蛋白K18转基因小鼠模型检测1.6C7单克隆抗体对致死剂量MERS-CoV感染小鼠后的预防和治疗作用。同时使用一种有效的中和性MERS-S1抗体（7.7G6）或一种无关的免疫球蛋白G1作为对照抗体。8只20-30周大的小鼠注射50μg抗体（相当于1.8mg单克隆抗体/kg体重），使用致死剂量MERS-CoV2进行滴鼻感染。接种后10天内每天监测生存率（左）和体重减轻（右，占初始体重右）。数据点表示相对于=8的±小鼠的平均体重。源数据作为源数据文件提供。b. 28D9抗体对MERS-CoV感染的预防效果。5只20周k18小鼠模拟感染，或者在感染前腹腔内注射50或200μg28D9抗体（1.8或7.2mg抗体/kg体重）或同型控制抗体。数据点表示平均体重相对于初始体重±方差，n=5只小鼠。源数据将作为源数据文件提供c. 28D9对SARS肺炎感染的预防效果。5只16周Balb-c鼠在鼻内感染的致命剂量的SARS病毒前24h，通过腹腔内注射50或200μg28D9抗体或同型对照抗体。每天监测生存率（左）和减肥（右，占初始体重的百分比），直到接种后13天。数据点表示相对于初始体重±和=5小鼠的平均体重。源数据将作为源数据文件提供。

接下来，检测28D9单克隆抗体对MERS-COV和SARS-COV再次感染后的体内保护能力。在鼻内感染致死剂量MERS-CoV或SARS-COV前24h腹腔注射两种剂量（50或200μg）28D9或同型对照抗体（图7b、c）。13天内每天监测小鼠生存率和体重变化的百分比。虽然对sars冠状病毒的感染没有任何保护作用，但是注射200 µg 28D9抗体的动物中有4只存活，且无显著性差异体重丧失。

讨论

两种人类单克隆抗体结合不同亚属的β冠状病毒刺突蛋白。两种抗体结合S2融合亚基的膜近端茎干螺旋区域的保守性和免疫原性抗原表位，自然感染期间免疫系统识别也可以识别该表位。结合该抗原位点的抗体阻止MERS-CoV感染后小鼠的死亡率和疾病发生，证明了该抗原表位与提供抗体保护之间的相关性。

28D9抗体与5个β冠状病毒(MHV、HCoV-OC43、MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2)的交叉结合活性十分显著，尽管结合的刺突白序列高度变化，全序列水平进行比对只有15%一致性，相反在更保守的S2融合亚基中有26%的一致性。茎干螺旋表位区域三个氨基酸残基对抗体结合至关重要。其中两个残基在β冠状病毒刺突蛋白序列(D¹²³⁶和F¹²³⁹)中完全保守，而第三位芳香氨基酸残基(MERS-S中的F¹²³⁸)功能保守。在MERS-S相同位置D¹²³⁶处进行丝氨酸取代，HCOV-HKU1刺突蛋白的功能获得的结合实验证实抗原表位位置。两种抗体靶向少量（功能上）保守的关键氨基酸残基和保守的N端糖基化可能是它们与这些高度变化抗原的结合的结构基础。虽然我们大量生化和突变研究揭示抗原表位位置和关键表位残基，但仍然需要对刺突-抗体复合物进行结构分析，便于充分理解广谱中和活性的详细分子机制。

靶向茎干螺旋区域抗体有效地阻止培养细胞感染MERS-CoV病毒，并能够有效预防和治疗小鼠致死剂量MERS-CoV感染。迄今为止这个表位仍然没有被命名为中和抗体靶点，尽管发现具有中和活性单克隆抗体结合茎干螺旋表位两侧的序列，包括下游的HR2区域。值得注意的是，VIPR数据库中存在的160株人类MERS-CoV刺突蛋白序列中茎干螺旋表位没有氨基酸多态性 (https://www.viprbrc.org/)，揭示两种抗MERS-CoV分离株抗体的广泛中和能力的生化基础。S2亚基表位包含区域参与广泛的构象重组，从而驱动了膜融合过程。刺突蛋白融合前、后结构的研究表明融合前刺突蛋白三聚体中包含表位的个茎干螺旋分离对于形成高度稳定的融合后结构是必需的。虽然两种抗体精确的中和机制有待研究，但至少有两种中和机制已被接受：抗体结合可能会破坏融合前刺突蛋白中茎干螺旋束稳定性，引起刺突蛋白成熟前激活。或者，抗体结合可能会阻碍融合过程中刺突蛋白六螺旋束形成。有趣的是，尽管融合过程中结构重排产生不同的蛋白空间构象，但融合前和融合后刺突蛋白构象中表位仍然可以被两种抗体结合，表明要么两个刺突蛋白构象中部分表位结构保守性识别抗原，要么通过互作界面的“诱导拟合”机制进行识别。

除了MERS-CoV病毒，两种抗体不能中和真正感染人的冠状病毒，尽管28D9抗体对假病毒具有较弱的交叉中和能力。单克隆抗体对HCOV-OC43、SARS-CoV、SARS-CoV-2刺突蛋白具有较高的ELISA反应活性。28D9抗体缺乏稳健的交叉中和能力，可能是由于与这些病毒刺突蛋白平衡解离常数比MERS-CoV高出~5到10倍，由表位组成的细微差异推断出。为了提高交叉反应抗体中和能力的广度和效力，使用抗体突变直接进化方法来探索抗体的亲和力成熟。此外，对28D9抗体与CoV刺突蛋白茎干螺旋表位结合模式的结构研究，可以指导通过基于结构的设计提高抗体亲和性，提高抗体中和的宽度和效力。

保守的茎螺旋表位似乎具有高度的免疫原性。三个独立的小鼠免疫实验中分离获得三种交叉反应抗体(28D9、1.6C7和18H2)全部靶定刺突蛋白茎干螺旋表位。此外，病毒自然感染期间也会产生靶定这种表位的抗体，正如使用人和单峰骆驼MERS-CoV阳性血清刺突蛋白肽微阵列分析得到的结果。其他研究同样强调了该表位区域在自然感染期间的免疫原性。最近的一项预印本研究报告从COVID-19患者中分离出交叉反应性和中和性单克隆抗体CC40.8，靶定刺突蛋白的S2亚基。使用负染色电子显微镜技术，该抗体结合膜融合亚基S2的膜近端位置，类似于28D9单克隆抗体。此外，Li等人最近进行刺突蛋白肽微阵列分析揭示包含28D9/1.6C7茎干螺旋表位EELDKYFK的SARS-CoV2肽F¹¹⁴⁸KEELDKYFKNH¹¹⁵⁹能够被~90%患者的血清抗体识别，而Ladner等人发现茎干螺旋表位—F¹¹⁴⁸KEELDKYF11⁵⁶作为最小反应性SARS2-S肽序列—是恢复期患者体内最被广泛识别的SARS-CoV-2线性表位靶点。不难推测，新冠患者茎干螺旋表位结合抗体显示异常高的血清学患病率是由于激发早期存在的针对冠状病毒（HCoV-OC43和HCoV-HKU1）保守抗原肽段免疫应答。在何种程度上人类产生针对刺突蛋白茎干螺旋表位或其他保守抗原表位的交叉反应抗体，并在交叉保护或增强疾病方面发挥作用，需要进一步研究。

结论

交叉反应抗体定义了冠状病毒刺突蛋白保守的、免疫原性和脆弱的位点。交叉反应中和抗体靶向病毒糖蛋白抗原肽段的发现，促进了为其他RNA病毒设计广谱的治疗方案和疫苗，如HIV-1和流感病毒，并在识别冠状病毒抗原性质高度变化刺突蛋白的保守位点领域迈出了第一步。另外的冠状病毒刺突蛋白保守位点可能生产得到新一代的广谱保护（基于表位）疫苗和治疗方案，减轻人群中循环出冠状病毒潜在的抗原漂移的风险以及新的新冠状病毒出现的带来的威胁。