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科研 | Environ. Pollut.：水产养殖鱼类的微塑料摄食：金头鲷对控制低密度聚乙烯饮食的生物应答

2021

05/26

微生态

A-

A+

世界上对于微塑料对鱼类的影响的研究并不少见，但研究者多关注在微塑料对野生鱼类影响的生态评价，水产养殖鱼类与人类健康关系密切，研究却相对较少。

编译：微科盟小兵，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载。

导读

海洋垃圾主要来源于陆地（80%），但海洋水产养殖等也会向海洋中输入垃圾，尤其是塑料碎片垃圾。水产养殖是一个快速发展的行业，2016年全球商品鱼产量为8000万吨，而在水产养殖设施中，鱼类很容易受到从环境中摄入的微塑料的影响，因此对于诸如金头鲷（Sparus aurata）等具有商业价值品种的微塑料摄入量的评估，就显得越来越重要。为了研究鱼类对微塑料的摄入，分别用富含不同加工微塑料的饲料喂养金头鲷3个月（富集阶段），然后再用未添加微塑料的饲料喂养1个月（排毒阶段）。本文的结果表明，金头鲷的微塑料摄取量随着摄取时间的增加而增加，并且在不同处理之间存在差异，风化处理组喂养三个月后微塑料摄取量达到最大值。然而，排毒阶段后，并未在鱼的胃肠道中发现微塑料，说明微塑料没有长期滞留在金头鲷的消化系统中。根据这项研究的结果，我们发现在所有处理中，摄入富含微塑料的饲料不会影响鱼的大小和富尔顿状态指数（Fulton’s condition index），因为这两个参数都随着时间的增加而增加。所有处理的碳氮同位素特征均随鱼的大小而降低，这可能与金头鲷前几个月高蛋白同化的鱼肌肉中氮沉积效率的增加有关。

论文ID

原名：Microplastic ingestion in reared aquaculture fish：biological responsesto low-density polyethylene controlled diets in Sparus aurata

译名：水产养殖鱼类的微塑料摄食：金头鲷对控制低密度聚乙烯饮食的生物应答

期刊：Environmental Pollution

IF：6.792

发表时间：2021.03.17

通讯作者：Carme Alomar

通讯作者单位：西班牙海洋研究所，巴利阿里群岛海洋中心

实验设计

本文实验鱼的预处理、选样都按照普遍的流程，本文的亮点在于设置了三种类型的饲料：对照组（100%饲料+0%微塑料）、未加工组（90%饲料+10%未加工微塑料）和风化组（90%饲料+10%风化处理微塑料）。每个处理45尾，每个鱼缸15尾，分别用三种不同的饲料喂养三个月（富集阶段），然后用不含微塑料的饲料喂养一个月（排毒阶段），共历时4个月，每隔一个月取一次样，共5次，分别记为T0、T30、T60、T90、T120。取样时测量鱼的总长、总鲜重、肝重，随后根据测量参数计算富尔顿状态指数（K）、胃饱满指数（FI）和肝体指数（Hepatosomatic Index，HSI）。去除样品中的有机物质，然后在显微镜下观察，记录微塑料数量，并计算微塑料摄取指数。利用稳定同位素分析（SIA），测定氮同位素含量和碳同位素含量，并计算C：N值。最后，利用Kruskal-Wallistest、Shapiro-Wilk test 、 Levene’s test 、PERMANOVA等方法对结果进行统计分析。

图1 实验设计思路

结果

1 生物参数

在4个月的时间里，共采集了352个金头鲷个体，并对它们进行了微塑性和稳定同位素分析。鱼的大小和体重随时间增加，根据得出的平均值（±标准误差（SE））T0 12±0.12 cm和46.18±1.42 g到T120 16.93±0.12 cm和128.66±2.79 g（图2A）。对照处理T0值最低（11.33±0.17 cm和38.21±1.73 g），风化处理组T120值最高（17.30±0.16 cm和135.09±4.18 g ）（图 2A）。将所有采样时段一起考虑发现鱼的大小随时间显著增加（P< 0.001； Kruskal-Wallis ；图2A），未加工组和风化处理组的鱼的大小显著大于对照组（P <0.001; Kruskal-Wallis；图2B）。

根据处理，我们发现未加工组和风化处理组的富尔顿状态指数显著高于对照组（ P < 0.05；Kruskal-Wallis；图2D），而风化处理组的胃饱满指数显著低于对照组和未处理组（P < 0.01；Kruskal-Wallis；图2H），未加工组的肝体指数最高，而且与对照组差异显著（P < 0.01；Kruskal-Wallis；图2F）。

图2 在实验条件下根据采样时间（诸如T0、T30 T60、T90 T120）和不同处理（对照组-C（蓝色），未处理组-V（黄色）和风化组-W（灰色））用克鲁斯卡尔-沃利斯检验（Kruskal-Wallis test）（P = 0.01）评估的生物值差异：鱼大小总长度（A、B），富尔顿状态指数（K）（C, D），胃充塞指数（FI）（G, H）和肝重指数（Hepatosomatic Index，HSI）（E, F）。箱形图表示数据集的最小值、最大值、中值、第一四分位数和第三四分位数，点表示异常值。

2 微塑料摄入指数

对 217个金头鲷个体的胃肠道分析用于微塑料摄食分析。应用Shapiro-Wilk检验后，MP摄食指数呈非正态分布。

表1 金头鲷肌肉中每一个同位素标记（δ¹³C和δ¹⁵N）和C：N比的 PERMANOVA 分析结果，以检验取样时间和处理之间的差异。

Df自由度，MS平均平方和，置换检验的伪F值，星号表示有显著统计学意义P < 0.05（⁎）和P < 0.001（⁎⁎）；n.s =无显著差异。P值基于999次置换。

微塑料平均摄入指标值T0为0%，随着时间增加从7.00±1.85% （T30）增加到32.14±4.62% （T90），在经过一个月不摄食微塑料的排毒期后，微塑料平均摄入指标再次为0%。不同处理与采样时间的交互作用有显著的统计学意义，对处理和采样时间分别处理时也具有显著差异（P< 0.01；PERMANOVA，表1）。在处理和采样时间组内比较，微塑料摄取量均值最高的是T90的风化处理组（14.16±2.88%）（图3A）。由于塑料摄取量为0%，T0和T120处理之间没有显著差异（P > 0.05 PERMANOVA；图3A）。然而，对于T30、T60和T90，对照组与风化和未风化处理组之间存在显著差异（P < 0.001；PERMANOVA；图3A）。在所有采样时间中，风化和未风化处理组之间未发现显著差异（P > 0.05；PERMANOVA；图3A）。

在对照组和未加工组中，微塑料摄入指数与鱼的大小呈显著的正相关性（P < 0.001 Spearman’s rank correlation；图3B）。此外，在风化处理组（R = 0.29, P < 0.01,Spearman’s rank correlation；图3C）和未加工组（R = 0.25, P < 0.05,Spearman’s rank correlation；图3C）中，微塑料摄入指数与富尔顿状态指数也呈显著的正相关性.

图3 金头鲷样品的微塑料（MP）摄食指数根据：采样时间（诸如T0、T30 T60 T90 T120和处理（对照-C （蓝色），未加工-M，（黄色）和风化-W（灰色））（A），以及微塑料摄入指数与鱼大小（B）、富尔顿状态指数（k）（C）的斯皮尔曼秩相关系数。根据置换多元方差分析（PERMANOVA）评估显著差异水平P = 0.001；*** P < 0.001。箱形图表示数据集的最小值、最大值、中位数、第一四分位数和第三四分位数，点表示异常值。

3 稳定同位素

为了进行稳定同位素分析（SIA），我们采集了135只鲫的背肌标本。稳定同位素特征服从非正态分布，在四个月内表现出较低的可变性。

碳同位素分布范围为-20.11±0.10 ‰ （T0） ~ 20.99±0.09‰（T120），在处理与取样时间的交互作用下存在显著差异（P <0.01；PERMANOVA；表1），在处理与取样时间的单独作用差异下也存在显著差异（ P < 0.05；PERMANOVA；表1）。风化处理组的平均值最低（-20.64±0.19‰），该处理与对照组（-19.93±0.10 ‰）和未加工处理的值存在显著差异（ P <0001：PERMANOVA）。对于T30，T60和T90，三种处理间的碳同位素值没有显著差异（P > 0.05：PERMANOVA；图4A）。相比于其余的采样周期，T120采样周期的碳同位素值最低，相比于对照组（-20.36±0.13‰），未加工处理的平均值显著更高（-20.65±0.04‰）（P < 0.05；PERMANOVA；图4A）。

图4 金头鲷软组织样品的碳同位素（δ¹³C）根据:采样周期（T0、T30、T60、T90和T120）和不同处理（对照组-C，（蓝色），未加工组-V，（黄色）和风化组-W，（灰色））间的关系（A），碳同位素和鱼的大小（总长度）（B）之间的斯皮尔曼秩相关系数（P = 0.01），碳同位素和富尔顿状态指数（K）（C）之间的斯皮尔曼秩相关系数。显著差异评估根据置换多元方差分析（PERMANOVA），显著性P = 0.001；* P < 0.05；** P < 0.01；*** P < 0.001。箱形图表示数据集的最小值、最大值、中值、第一个四分位数和第三个四分位数，点表示异常值。

在所有处理中，碳同位素值随鱼身长度的增加而减少，但仅在对照组显著（R = -0.78，斯皮尔曼秩相关性P < 0.001）和未加工组（R = -0.58，斯皮尔曼秩相关性P < 0.001）。在风化处理中，碳同位素特征与富尔顿状态指数呈显著正相关（R = 0.34，斯皮尔曼秩相关性P < 0.05）。而在对照和原始处理中，碳同位素特征随富尔顿状态指数（R = -0.31）的增加而显著减少（R = -0.31，斯皮尔曼秩相关性P < 0.05；R = -0.43, 斯皮尔曼秩相关性P < 0.01）。

氮同位素值和碳同位素值，在处理与取样时间的交互作用下存在显著差异，在处理与取样时间的单独作用差异下也存在显著差异（P < 0.01；PERMANOVA；表1）。氮值从10.12 ± 0.04 ‰ （T0）到 9.84±0.03‰和9.84±0.02‰（T60和T90）。T0时段的值相比其他取样时间要更高，风化处理组的值显著低于未加工组和对照组（9.92 ± 0.06‰）（P < 0.01；PERMANOVA）。经过排毒期后，风化处理组相比于未加工处理组和对照组，氮值再一次显著下降。

氮同位素特征随尺寸（R = -0.76（对照）；R = -0.5（风化）；R= -0.49 （未加工），P < 0.001 Spearman’s rank；图5B）和富尔顿状态指数显著减小，但这种下降仅在未加工组中显著（R = -0.41，P< 0.01 Spearman；图5C）。

图 5 金头鲷的软组织氮同位素特征（ δ ¹⁵N）根据：采样时间（诸如T0、T30、T60、T90和T120）和处理（对照-C（蓝色），未加工-V （黄色），和风化-w（灰色））以及氮同位素值与鱼的大小（B）、富尔顿状态指数（k）（C）的斯皮尔曼秩相关性（P= 0.01）。根据置换多元方差分析（PERMANOVA）评估显著差异水平P = 0.001；* P < 0.05；** P < 0.01。

C：N值从2.09±0.05‰（T0）到2.02±0.02‰（T30）和2.02±0.03‰（T60）范围内保持稳定，在处理与取样时间的交互作用下存在显著差异（P < 0.01；PERMANOVA；表1），在不同处理的单独作用差异下也存在显著差异（P < 0.05；PERMANOVA；表1），但单独看采样时间组内没有显著差异（P > 0.05；PERMANOVA；表1）。根据采样时间，在整个实验过程中无显著差异（P > 0.05；PERMANOVA）。然而，处理和取样时间的交互作用下存在显著差异（P < 0.001；PERMANOVA）。从取样时间来看，风化处理组在T0 C：N值显著高于未加工组和对照（P <0.05；PERMANOVA，图6A）。风化组和对照组在T30的C：N值有显著差异（P < 0.05；PERMANOVA，图6A）。但T60和T90在处理组间无显著差异（P > 0.05； PERMANOVA，图6A）。在经过排毒期后，未加工组（1.93±0.02‰）与对照组（2.25±0.06‰）的平均值有显著差异（P < 0.001；PERMANOVA，图6A），这种差异在T120未加工处理组中是由于富集的碳同位素特征。风化处理组（R = -0.40，P < 0.01Spearman’s rank；图6B）的C：N比随鱼的大小显著降低。相反，未加工处理组和对照组的C：N随鱼的大小而升高，但仅仅对照组增加显著（R = 0.31； P < 0.05 Spearman’s rank；图6B）。风化处理组C：N比随富尔顿状态指数降低，但降低不显著（R = -0.27；P > 0.05Spearman’s rank；图6C）。另一方面，在未加工组和对照组C：N比率随富尔顿状态指数而增加，但仅在未加工组中显著（R = 0.35，P < 0.05 Spearman's rank；图6C）。

图6 金头鲷软组织样品的C:N比根据:采样周期（T0、T30、T60、T90和T120）和不同处理（对照组-C，（蓝色），未加工组-V，（黄色)和风化组-W，（灰色））间的关系（A），CN比和鱼的大小（总长度）（B）之间的斯皮尔曼秩相关系数（ P = 0.01 ），CN比和富尔顿状态指数（K）（C）之间的斯皮尔曼秩相关系数。显著差异评估根据置换多元方差分析（PERMANOVA），显著性P = 0.001；* P < 0.05；** P < 0.01；*** P < 0.001。箱形图表示数据集的最小值、最大值、中值、第一个四分位数和第三个四分位数，点表示异常值。

讨论

在这项研究中，所有被分析的鱼停止进食24小时后，38.71%的鱼样胃肠道中都存在微塑料。此前的实验室研究报告了微塑料在24至48小时内会快速完全排出体外。由于较短的排泄周期，微塑料及其相关污染物无法在肠道内停留足够长的时间，使污染物转移到肠道壁和内部组织和器官。然而直接、持续、长时间地接触微塑料会导致时间的累积效应，在喂养富含微塑料鱼食的金头鲷体内抗氧化酶活性和谷胱甘肽硫转移酶逐渐增加，还原型谷胱甘肽水平也提高。此外，在喂养微塑料90天后，也检测到促发酶（pro-inflammatory enzyme）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase）活性和氧化应激标志物-丙二醛和蛋白羰基化水平达到最大值，这与我们研究中最高的微塑料摄入指标值一致。

排毒期间，所有水箱的富尔顿状态指数均轻微下降，这可能是最后几个月（12月-1月）水温较低，影响了鱼的状态指数。这些结果证实，鱼类没有将能量用于净化微塑料，而是对水箱水温的改变做出反应。

与我们的发现相反，韩国岩鱼暴露于10⁶颗粒/L的聚酯微塑料环境中，生长率降低了65.9%。鱼对接触微塑料的生理反应的差异可能与研究物种的进食行为有关，也与微塑料接触途径有关，直接接触水中微塑料的鱼比通过饮食受到的影响更大。物种接触的微塑料浓度也会决定摄入微塑料对物种的影响。在目前的实验中，鱼暴露在的微塑料的浓度是0.1 g ㎏^-1 weight^-1，最近的一项研究表明成年金头鲷在食用相同浓度的未加工微塑料鱼食45天后，没有急性伤害。在这个研究中值得注意的是，鱼类在整个研究期间都在摄取供应的饲料，模拟了鱼类在海洋中直接接触塑料颗粒的自然条件，表明在三个月的实验时间间隔，没有因为微塑料的摄食导致鱼类死亡。然而，在微塑料的相应环境浓度也不总是造成不利影响：微塑料被摄入，通过肠道运输、排出，没有造成不利影响。此外，在我们研究的实验阶段只有一条鱼死亡，而且取样过程没有观察到外伤。先前的实验研究也表明，在接触PS、PET和PE的微塑料颗粒时，褐鳟（Salmo trutta）的孵化、生长和生长发育第一阶段的存活率没有受到影响。由于幼鱼更容易受到影响，是生存率下降，所以这些在鱼类幼体（比如金头鲷）的发现很重要。

关于金头鲷的机体回应在肝体比重的量化，这些结果显示出一个下降的模式。从这个意义上讲，鱼肝体指数在暴露在微塑料期间随时间呈下降趋势，在排毒期后，各指标下降，未恢复到初始水平。一项最近的研究在金头鲷的肝脏中检测出颗粒，因此考虑到该组织中已经观察到糖原消耗、质滴空泡和单细胞坏死，可以认为该器官的功能受到MP摄入的影响。此外，这会导致鱼肝脏的细胞损伤或氧化应激，这些现象已经在金头鲷的实验研究以及摄取微塑料的野生鱼类研究中观察到。

鉴于物种肌肉中的δ ¹³C和δ¹⁵N稳定同位素特征可以提供物种食物来源的信息和营养评估，可以认为富含塑料的饲料可能会对消费者组织的同位素特征产生影响。对石油和从植物中提取的聚合物中的碳和氮稳定同位素进行了分析，表明δ¹³C可能是识别海洋环境中塑料聚合物的一种合适工具，但这项研究中鱼肌肉中的同位素特征并不能反映微塑料摄食值。在实验的富集阶段（T30、T60和T90），没有观察到碳同位素值在三种处理间的显著差异，这说明由于在富集阶段被研究物种摄入的微塑料没有改变脂肪含量，导致肌肉组织中的特征没有表现出差异。根据这些结果，可以认为其他组织可能是微塑料摄入的短期饮食指标，如具有较高代谢活性的肝脏。根据氮同位素特征，风化组中鱼的值比未加工组和对照组明显更低，这可能与食物来源的损耗有关，因为众所周知，消费者同位素特征强烈地依赖于食物质量。此外，在所有处理中，碳和氮同位素特征都随鱼的大小而减少，尽管这种减少仅在未加工处理中显著，但考虑到氮和碳同位素值随鱼的大小而增加，这也相当令人惊讶。然而，这一降低可能与金头鲷前几个月高蛋白同化的鱼肌肉中氮沉积效率的增加有关。对于C：N值，随着暴露时间的增加，鱼肌肉中C：N的比值值趋于相似（T60和T90），这可能反映了相似的营养状况。事实上，只有在风化处理组中C：N比率随着鱼的大小和富尔顿状态指数显著降低，这表明摄入的饮食质量的变化可能与在港口风化时，吸附在颗粒表面的生物体污染有关，比如凤尾鱼，桡足类，珊瑚和海胆等之前记录的某些物种。

微塑料在机体组织内的转移取决于颗粒大小，大于100 μm的颗粒似乎不太可能发生。在本实验中，MP颗粒的大小在500 – 200 μm之间，很难从胃肠道转移到其他内部组织。然而，考虑到微塑料可以吸附海洋环境中的污染物，在风化处理中使用的微塑料暴露于港口区域的人为污染物中，预计风化处理组生物个体的靶器官（如肝脏）中吸附的污染物将产生生化效应。最近在相同的实验条件下进行的一项研究确实证明了暴露于风化处理微塑料的金头鲷肝脏中生物标志物（CAT、GRs和GST）的抗氧化反应比未风化微塑料更显著。

一项关于微塑料摄入后蛋白质的调整的研究表示，主要受影响的通路与能量代谢、免疫应激和细胞骨架动态有关，但在我们的研究中没有观察到微塑料的接触和摄入对鱼的大小和同位素特征产生的影响。然而，为了对微塑料对鱼类生理的影响有一个完整的范围，许多作者认为实验研究在实验室条件下也应该考虑不同类型的聚合物和形状的颗粒（包括纤维），以模拟在海上发现的类似条件以及评估不同的靶器官。

结论

世界上对于微塑料对鱼类的影响的研究并不少见，但研究者多关注在微塑料对野生鱼类影响的生态评价，水产养殖鱼类与人类健康关系密切，研究却相对较少。本文抓住这一研究缺口，首次在4个月（设置1个月排毒期）的时间尺度上对金头鲷的LPDE微塑料摄取量进行了评估。结果表明，微塑料摄取量随着暴露时间的增加而增加，在暴露3个月后达到最大值。但是MP摄取量的增加并没有引起鱼类的生物学效应，因为鱼类的大小、富尔顿状况指数和肌肉组织中的稳定同位素组成都不能反映微塑料的摄取量。经过一个月不添加微塑料的饮食后，没有发现微塑料在金头鲷胃容物中长期滞留。未来调查摄入微塑料对具有重要商业和生态价值的物种的研究，应该尝试针对不同的器官，在月时间尺度上展开，塑料聚合物种类、形状和浓度要更广泛，最大程度模拟复杂的海洋环境。

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