[文献解读] 免疫球蛋白和补体水平与新冠患者的严重程度相关

文献信息：

A Marcos-Jimenez, S Sanchez-Alonso, A Alcaraz-Serna, et al. Deregulated cellular circuits driving immunoglobulins and complement consumption associate with the severity of COVID-19 patients. European Journal of Immunology,2020,06.

▼研究背景

体液免疫在病毒感染和细胞间传播的初始控制中起关键作用。它是由补体系统和免疫球蛋白(Ig)介导的。不同病原体的组分如新冠病毒的相关分子和N蛋白，联同血浆中的C反应蛋白(CRP)可能在感染早期激活补体级联反应的选择性或凝集素途径。

此外，早期IgM同型抗体有效触发经典补体级联反应。分泌的IgA抗体中和呼吸道和胃肠道粘膜内的病毒。

最后，在一个更高级的疾病阶段，病毒特异性IgG抗体调理病毒颗粒。这可能会形成参与活化经典补体途径的免疫复合物。此外，调理后的病毒颗粒可以粘附在吞噬细胞和NK细胞的Fc受体上。后者是抗病毒应答过程中主要的先天免疫介质，它们通过不同的机制杀死感染病毒的细胞。

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然而，过度的体液免疫反应可损害宿主组织。补体介导的组织损伤是由C3a-和C5a介导的中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和血小板的招募和激活引发的强烈炎症回路引起的。吞噬细胞反过来产生活性氧(ROS)和蛋白酶，并释放中性粒细胞胞外陷阱杀菌网络(NETs)，这会加剧组织损伤。

一些关于新冠病毒感染的研究试图阐明与疾病严重程度或预后预测相关的免疫细胞亚群的表型特征。然而，这些研究大多是在有限的患者数量和临床情况下进行的，所有病例的参数和疾病严重程度记录并不一致。尽管特异性抗体和补体激活被认为可以调节冠状病毒（包括新冠病毒）感染的一些最严重的并发症，但体液免疫效应机制在新冠病毒相关的ARDS发病机制中的作用显然还需要确凿的证据。

为了解释这个问题，我们对276名新冠患者的免疫细胞群和可溶性介质进行了分析。这些患者是在西班牙马德里大流行高峰期间在一个中心出现的从轻度到重症症状的患者。

▼新冠患者外周血B细胞和浆母细胞增多

276例新冠病毒感染者根据临床症状的严重程度分为轻、中、重度。入院前平均症状持续时间为(7.36±5.2)天，年龄中位数为63(53.25-75)，其中163(59.05%)为男性。

根据新冠患者入院方案进行了初步分析，其中包括用多参数流式细胞仪定量外周血主要淋巴细胞亚群，包括T、B、NK淋巴细胞和浆母细胞。

T淋巴细胞(CD4+或CD8+)和NK细胞的比例在所有患者和健康志愿者中相似，但CD8+ T细胞的比例在重症患者中下降。

而新冠患者中B细胞的百分比更高，且随疾病的严重程度增加而增加，从健康志愿者的平均9.15%提高到重症患者的平均20.49%。

同时，患者浆母细胞的相对值和绝对值均显著升高(平均1.51% vs 17.98%;2.83 /L vs 27.37 /L)，且与严重程度无关。

浆母细胞数量的增加表明B细胞系主要成熟阶段的重新分布，包括幼稚、过渡、未切换记忆、仅IgM记忆和类别切换记忆B细胞，这些在我们最初队列的84名患者亚组中被鉴定出来。

在新冠患者中，仅IgM记忆B细胞的比例增加，未切换记忆细胞的比例减少。这种再分布在轻症患者中更为明显，在中、重度患者中逐渐减少。不同严重程度患者之间的差异无统计学意义。

▼患者外周血滤泡辅助T细胞增多

鉴于Tfh在B细胞成熟和激活中的作用，我们评估了新冠患者外周血中循环的Tfh (cTfh) 是否随着浆母细胞数量的增加而增加。

结果观察到cTfh的比例随着新冠个体的严重程度显著增加，从健康志愿者的中位数0.51%增加到重症患者的1.7%。重要的是，尽管CD4+ T细胞总量大幅下降，但其绝对数量仍保持稳定。

为了进一步鉴定这一群体，我们评估了CCR7趋化因子受体的表面表达，这与Tfh降低B细胞激活能力有关。我们发现CCR7在中重度疾病患者cTfh细胞中的表达显著增加。

最后，我们发现cTfh比例与B细胞总数 (r 0.33;p= 0.0090)、分类转换B细胞(r 0.26, p= 0.0433)和血浆母细胞(r 0.33, p= 0.0091) 直接相关。

▼新冠患者的严重程度与血清免疫球蛋白和补体水平相关

高数量的浆母细胞促使我们研究免疫球蛋白浓度的可能变化。入院时，新冠患者的血清IgG、IgA或IgM浓度与健康志愿者相当。另一方面，当对不同严重程度的患者进行分析时，我们观察到，与健康志愿者相比，重症患者的IgA和IgM水平相似，但IgG浓度降低（见图3）。

（图3.新冠患者的免疫球蛋白和补体水平）

注：IgG、IgA、IgM、C3、C4用散射比浊法检测，C5a用Elisa法检测

此外，IgG (0.37;p=0.0007)和IgA (0.23;(p=0.0444)，新冠患者的血清浓度和外周血浆母细胞的绝对数量，以及IgM水平和外周血仅IgM记忆B细胞总数 (0.36;p=0.0040) 之间存在直接相关性。相反，IgG (-0.31;p=0.0147)和IgA (-0.38;p=0.0021)与未切换记忆B细胞比例呈负相关。

新冠患者的特征是血浆IL-6和急性期反应物浓度升高，这表明补体C3和C4 (被认为是急性期反应物)的浓度也可能升高。因此，我们检测了这些患者血清中的C3和C4水平，可以检测到这两种补体蛋白水平的升高(图3A)。

因此，为了研究COVID-19患者中是否存在补体激活，我们量化了补体成分C5的激活肽C5a，该肽在大多数患者中显示血浆水平升高。

然而，当考虑到不同的严重程度时，我们发现轻至中度疾病患者的C3和C4水平升高，而严重疾病患者的C3和C4水平恢复到与健康志愿者相似的水平。因此，与其他炎症参数如LDH、铁蛋白或CRP相比，C3和C4值随着病情加重而降低。值得注意的是，与C3和C4不同的是，无论严重程度如何，血浆中C5a水平仍然升高。

接下来，我们测试了这些体液免疫成分的减少是否与危重病人的疾病严重程度有关，或者更确切地说反映了长期消耗的增加。然后，我们考虑将住院时间超过15天作为疾病严重程度的读数，并收集了37名入院10天后仍在住院的新冠患者的血液，并将其与最初的血液测试进行比较。

通过这种方法，我们观察到所有患者入院时的IgG、IgA和IgM抗体，IgG亚类IgG1、IgG3和IgG4以及补体蛋白C3、C4和C5a的浓度相似。然而，住院时间超过15天的患者，10天后血清中IgG的浓度明显降低，而IgA和IgM的水平在这段时间内没有变化。

有趣的是，虽然长期住院患者的IgG1和IgG3水平在入院10天后比短期住院患者显著下降了一倍，但两组患者的IgG4浓度下降情况相似。为了确定这些变化是否与特定的抗SARS-CoV-2反应有关，我们定量了抗SARS-CoV-2 RBD和N蛋白的IgG，这些蛋白在所有病例中都能在第10天检测到高滴度的抗体。相反，两组患者在住院10天后抗CMV IgG水平均有所下降。

关于补体，随着时间的推移，两组患者的C3水平是稳定的。而在严重程度最终需要更长时间住院的患者中，C4浓度在10天后显著下降(图4A)。然而这些病人此时C5a水平持续(图4A)。相反，在住院少于15天的患者中，激活产物C5a增加，而C4的没有平行的减少(图4A)。

（图4.体液免疫反应与新冠患者严重程度的关系图）

我们推测，重症新冠患者血清C4和IgG浓度下降，抗原-抗体复合物大量形成激活经典抗体补体系统途径。

虽然免疫系统对新冠病毒感染的保护是必需的，但其反应如果过度或持续一段时间，如发生在新冠患者上，可能有持续的炎症和高凝状态。

因此，有必要就个体特征和宿主对SARS-CoV-2反应的特殊动力学提供更多的见解，以进一步了解COVID-19的发病机制，并决定适当的治疗和治疗时机。这一知识具有特殊的治疗意义，因为它是目前可用的不同免疫调节剂(包括静脉注射免疫球蛋白、超免疫血浆或补体抑制剂等)临床试验的基础。重症感染患者的免疫指标动态监测，能够为调整患者治疗方案提供参考。国赛生物免疫散射比浊法检测免疫5项（IgG、IgA、IgM、C3、C4），为体液免疫反应监测提供实验解决方案。

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