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中国农业大学 | SBB：微塑料圈：添加可生物降解的塑料改变了土壤微生物群落的结构和功能

2021

05/18

微生态

A-

A+

农业土壤中的微生物活动通常受到碳的限制，因此少量的碳输入也会在土壤微生物群落中引起新陈代谢的变化。

导读

环境中累积的微塑料（定义为小于5毫米的颗粒）会导致一系列问题并对生态系统造成危害。聚羟基链烷酸酯（PHA）是可生物降解的塑料，用于覆盖膜和包装材料中，从而最大程度地减少塑料浪费和土壤污染。然而，关于微生物塑料对土壤-植物相互作用，特别是对农业生态系统种土壤微生物群落结构和功能的影响知之甚少。本研究首次将酶谱法（定位酶活性热点）与底物诱导的生长呼吸相结合，以研究添加常见的新型生物高分子羟基丁酸酯和羟基戊酸酯的共聚物（PHBV）对微塑料际土（即土壤与微塑料颗粒之间的界面）以及植物根际和非根际土壤微生物群落结构，生长和胞外酶动力学的影响。研究发现，植物根际土壤微生物能够利用PHBV作为碳源，从而提高特定微生物的生长速率，使微生物生物量在微塑料圈土壤中比在非根际土壤中更为活跃。此外，土壤中PHA的存在也改变了不同分类水平上的土壤细菌群落的结构，提高了植物根际相关功能酶的活性。总体而言，PHBV的添加产生了土壤热点，通过加速驱动微生物生物量和活性，从而大大提高了碳和养分的转化率。总之，可生物降解的塑料具有改变土壤生态功能和生物地球化学循环（例如SOM分解）的潜力。

论文ID

原名：The microplastisphere: Biodegradable microplasticsaddition alters soil microbial community structure and function

译名：添加生物降解塑料改变了土壤微生物群落的结构和功能

期刊：Soil Biology and Biochemistry

IF：5.795

发表时间：2021.3

通讯作者：臧华栋

通讯作者单位：中国农业大学

实验设计

本研究是在德国哥廷根大学的Reinshof研究站的实验场（28^◦33′26′′N，113^◦20′8′ 'E）的Ap层（0-20 cm）采集的土壤样品。该场地从未使用过塑料覆盖物，也没有过塑料污染的记录。PHBV是一种100％生物基热塑性线性脂肪族（共）聚酯，由糖和脂质的细菌发酵生产的3-羟基丁酸和3-羟基戊酸共聚而成。基于实地调查和文献综述选择了PHBV来模拟生物塑料在农业土壤中的局部处理（例如，在耕地季节结束时翻耕覆盖膜残留物）。对于PHBV的添加处理，将400 g的土壤和PHBV均匀混合；对照处理包含的土壤（400 g）不含PHBV。两者土壤的干扰程度相当。将土壤在高湿（25％v / v）条件下于温室中预培养1周，以使土壤达到平衡。播种前，将小麦（Triticum aestivum L.）种子置于10％ H₂O₂中灭菌10分钟，然后用去离子水冲洗并在湿滤纸上发芽。发芽后五天，将幼苗移栽到所有的根际箱中（每个根际箱中一株幼苗），然后移至气候控制室（分别为14 h/24℃和10 h/14℃的昼/夜模式）。移植后第24天，使用酶谱法观察三种水解酶的空间分布，并从热点和非根系土壤中收集土壤，总共获得了16个样品（2个处理（无PHBV处理）×每个处理的2个微点（热点和非根际土壤）×4个重复样本）。移植后第25天，在茎的根部切下枝条，并分别收集对应的根。为了进行精确的局部采样，使用针头（尖端1.5 mm）仔细地从酶谱法确定的热点（根际和微塑料际）中仔细收集土壤颗粒（图1）。采集后，将土壤样品（热点和非根际土壤）分为两个子样品。一个子样品存储在-80℃下以分析细菌群落结构，而另一个子样品用于直接测量酶动力学和底物诱导的生长呼吸动力学。去除热点样品和非根系土壤后，将根际箱中的剩余土壤混合，然后在4℃下存储，以测量微生物生物量氮，溶解的有机碳和氮。

图1 添加了未经处理的土壤（对照）和生物塑料（PHBV）处理的土壤中β-葡萄糖苷酶（BG）、酸性磷酸酶（ACP）和亮氨酸氨基肽酶（LAP）的酶谱图和热点。颜色强度与相应的酶活性（nmol cm^-2h^-1）成正比。酶谱图代表4个独立的重复。右侧面板中显示了每种酶相对于根际箱总面积的相对应的热点面积。图中数值是四次重复的平均值（±SE）。不同的字母表示处理之间的显著差异（p <0.05）。这里的1、2、3分别表示根际，微塑料圈和非根际土壤。

结果

1 PHBV对植物和土壤性质的影响

当不添加微塑料时，平均植物生物量为0.24 g pot^-1。而添加PHBV最终会在25天后导致植物死亡。PHBV的添加显著增加了土壤微生物的生物量和溶解的有机碳含量（DOC）（p <0.05）。PHBV处理组土壤的MBC和DOC分别比对照组高12倍和54倍。此外，PHBV处理组MBN与对照组相比提高了45％，而DON与对照土壤相比降低了66％。

2 PHBV对土壤酶活的影响

微塑料圈土壤中β-葡糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶的最大潜在酶活性（V_max）比根际土壤中的分别高60％和5倍（p < 0.05，图2a和b）。类似地，微塑料圈土壤中β-葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶的底物亲和力（K_m）比根际土壤的高1.5–2倍（p < 0.05，图2b和d）。微塑料圈土壤中β-葡糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶的V_max和K_m显著高于PHBV处理组（p < 0.05，图2）。然而，PHBV处理都不会显著影响非根际土壤中所测试的酶（p > 0.05，图2）。此外，β-葡萄糖苷酶的V_max与活性微生物生物量呈显著正相关（R² = 0.7，p <0.05）。在微塑料圈土壤中，亮氨酸氨基肽酶的催化效率（V_max/K_m）显著高于根际（p <0.05），其转换时间比在根际土壤中短约5倍。然而，PHBV处理组以及对照组的非根际土壤中，所有酶的催化效率和周转时间均未发生显著变化（p > 0.05）。此外，微生物圈土壤中的矢量角显著（p <0.05）低于其他土壤，表明微生物的新陈代谢可能受到氮的限制。

图2 在未经处理（对照）和生物塑料（PHBV）处理的非根际和热点土壤中，β-葡萄糖苷酶（BG）、亮氨酸氨基肽酶（LAP）和酸性磷酸酶（ACP）的潜在酶活性（V_max）和底物亲和力（K_m）。图中数值是四次重复的平均值（± SE）。不同的字母表示处理之间存在显著差异（p < 0.05）。

3 PHBV对土壤微生物生长率的影响

在未经处理（对照）和生物塑料（PHBV）处理的非根际和热点（微塑料圈和根际）土壤中，微生物生长对基质添加表现出不同的响应模式。微塑料圈的基础呼吸（BR，45 μg C g^-1 h^-1）和基质诱导的生长呼吸（SIGR，58 μg C g^-1 h^-1）比根际土壤分别高10倍和12倍（图3a和b）。然而，与对照组相比，非根际土壤中的BR和SIGR均不受PHBV添加的影响。

在热点地区和非根际土壤中，土壤呼吸均明显表现出对PHBV添加的响应。PHBV的添加使微塑料圈土壤微生物的最大比生长速率（μ）比非根际土壤显著降低22％（p <0.05；图3c），而微塑料圈和PHBV处理的非根际土壤微生物之间的μ值没有显著差异（p > 0.05）。尽管微塑料圈土壤微生物特定的生长速度较慢，但活性微生物生物量的比例比根际土壤微生物增加了6倍，滞后时间缩短了4倍（图3d，e，f）。

图3 在未经处理（对照）和生物塑料（PHBV）处理的非根际和热点土壤中基础呼吸（BR）、底物诱导的生长呼吸（SIGR）、特定生长速率（μ）、总微生物生物量（TMB）、生长的微生物生物量占总微生物生物量的比例（GMB / TMB）及其滞后时间。图中数值是四次重复的平均值（± SE）。不同的字母表示处理之间存在显著差异（p < 0.05）。

4 PHBV对土壤细菌群落组成和多样性的影响

所有处理组的土壤细菌优势菌门是放线菌门、变形菌门、酸杆菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、奇古菌门和芽单胞菌门（图 4A），共涵盖了约96–98％的细菌读数。尽管所有土壤中的细菌优势种均相同，但PHBV显著影响了优势类群的相对丰度。与对照相比，PHBV处理组土壤中变形菌门和酸杆菌门的丰度显著高于对照组，而厚壁菌门的丰度显著低于对照组（p < 0.05，图4A）。在科水平上，PHBV添加后降低了20个优势科的相对丰度（图4B）。具体而言，PHBV的添加降低了动球菌科、黄单孢菌科、芽孢杆菌科的相对丰度，同时提高了Chitinophagaceae、丛毛单胞菌科和草酸杆菌科的相对丰度（图4B）。在图5C中还给出了由PHBV添加引起的非根际和热点土壤细菌群落的详细的科水平变化。在所有样本中检测到的3800个OTUs中，由对照组非根际，PHBV非根际和PHBV热点土壤共享了主要的OTUs（n = 3622），PHBV热点土壤存在54个特有OTUs，而PHBV非根际存在16个特有OTUs（图5A）。

与对照组土壤相比，PHBV处理的非根际土壤中细菌ACE，Chao1，丰富度和Shannon指数的平均值分别增加了10％、11％、16％和18％，而PHBV处理的微塑料圈和非根际土壤之间细菌多样性没有显著差异（p > 0.05）。

图4 在未处理的土壤（对照-非根际），添加生物塑料（PHBV）的非根际（PHBV-非根际）和热点（PHBV-热点）土壤中具有最高平均相对丰度的前10个细菌门的堆积条形图（A）。在所有土壤样品中平均相对丰度最大的20个科的堆积条形图（B）。

图5 维恩图显示未处理的土壤（对照-非根际），添加生物塑料（PHBV）的非根际（PHBV-非根际）和热点（PHBV-热点）土壤的OTU共享数量（A）。每个节点的分类信息在单独的热图（B）中给出。基于科水平不同的处理下的热图。从中心（门）到外部（科）的每个节点代表不同的分类学等级（C）。根据读取的丰度对地图进行加权和颜色编码。

讨论

1 PHBV对植物生长的影响

完整的PHBV及其分解产物具有很低的细胞毒性。但是，在所有添加PHBV的根际箱中，所有植物最终在4周的实验中死亡。这与先前的报道一致，表明如果大量存在常规和生物基微塑料的降解，可能会对植物的生长产生负面影响。鉴于生物塑料聚合物仅由C、O和H组成，PHBV添加到土壤中可能会导致必需养分（例如N、P）的微生物固定化，从而导致植物胁迫增加。与对照组相比，添加PHBV的土壤中DON的减少但MBN的增加进一步证实了这种固氮作用。这与Sander（2019）的研究结果一致，即微塑料表面的微生物需要从周围土壤中获取N来促进生长。这也表明PHBV可能刺激了机会性植物病原体，但仍需要更多的研究来证实这一点。另一种可能的解释是由于PHBV降解过程中释放出大量的3-羟基丁酸，导致土壤酸化而引起植物毒性。然而，这通常会影响植物根的生长，而不是芽的生长。此外，基于其他生物聚合物（例如纤维素、蛋白质）的降解，由于微生物的快速消耗，不太可能发生单体的积累。这很可能是因为它是天然存在的作为微生物存储化合物的单体。然而，聚合物中未公开的添加剂或污染物也可能诱发了植物毒性。最后，我们不能忽视加入PHBV后土壤性质和微生物群落的其他一般变化，这些变化也可能抑制了植物的生长，导致植物死亡。我们发现与预期相反，商业来源的PHBV至少在短期内（PHBV含量较高的情况下）对植物生长有害，这通过7天发芽期间较低的种子发芽率来证实。因此，需要进一步的实验来确定该响应的机理基础。

2 PHBV对土壤微生物和酶功能性状的影响

土壤酶对能量和养分利用率都很敏感。这一观点在本研究中得到了证实，其中生物可利用C（即PHBV的降解产物）的输入使热点中的酶活性比非根际土壤增加了2倍。鉴于聚-3-羟基丁酸酯是由各种各样的分类学上不同的微生物群（特别是对氮和冷胁迫的响应）产生的常见存储化合物，所以这种微生物活性的提高不足为奇。因此，使用PHBV-C的能力有望成为微生物群落中的一项广泛特征。PHBV添加的热点土壤之间的C、N降解酶活性差异要大非根际土壤2-10倍（图2a，c），这表明生物塑料混入土壤后直接影响了C和N。骑自行车。与根际土壤相比，微塑料圈中β-葡萄糖苷酶的最高V_max可以归因于添加PHBV后快速增长的生物量（图3e）。结果也证实了活性微生物生物量与β-葡萄糖苷酶的V_max之间存在着显著的正相关（R² = 0.7）。β-葡萄糖苷酶的增加也表明PHBV刺激了其他常见土壤聚合物（即纤维素）的分解。此外，PHBV可以通过释放羟基丁酸单体的解聚酶来分解，从而促进能消耗SOM以获得N来生长（即正向引物）的能量消耗巨大的胞外酶（即亮氨酸氨基肽酶；图2c）。相对于非根际土壤，微塑料圈中的BR和SIGR较高（图3a和b），以及用PHBV处理过的土壤中DOC和DON的比例均比对照组土壤高。根据先前的研究，N限制还诱导亮氨酸氨肽酶的催化性质（Ka）的增加。与此相一致，微塑料圈中底物的周转时间比根际土壤更短，亮氨酸氨基肽酶的Ka值比根际土壤更高，这表明在微塑料圈中，群落受N的限制比受P的限制更大。与根际相比，微塑料圈土壤中C-与N-循环酶的比例活性较低，但C-与P-循环酶的比例活性较高。微塑料圈中较低的矢量角进一步证实了微生物的新陈代谢可能受到土壤氮的限制。因此，我们推测由于氮的限制，微生物群落可能（i）改变了其水解酶的内在特性，以适应富含C的生物塑料，和/或（ii）PHBV引起土壤微生物群落的转移，从而产生了这些类型的酶。总的来说，由于从PHBV供应C后刺激了微生物的生长，因此氮限制与微生物的氮固定化有关。由PHBV分解代谢产生的C输入将增加微生物生物量并增强N限制。 MBC和酶活性的增加（尤其是与N相关的），以及酶化学计量比和细菌群落的变化都支持了这一点，这与根际中的C热点相反，后者的C供给可能较少，并且根表皮细胞中的N也以氨基酸的形式从根表皮细胞中流失，从而为微生物群落提供了更均衡的营养供应。

在这里我们推测，PHBV分解最初受多羟基丁酸酯（PHB）解聚酶的可用性限制。该酶在土壤中的丰度和表达水平仍然未知，但是NCBI搜索显示其存在于多种微生物分类中。尽管PHB解聚酶可能破坏内部储存库C，但也有证据表明它可以是一种胞外酶，可能会降解微生物微生物。我们的数据支持以下观点：外源供应时，PHBV可以被细菌群落用作唯一的C底物。但是，我们也观察到，与根际相比，微塑料圈中微生物特异性生长率μ显著下降（22％），这表明了K方法微生物的潜在优势。K方法微生物通常将更多的C存储在其细胞中，且消耗得更慢，从而降低了呼吸频率。我们假设PHBV降解剂将PHBV外源分解为单体单元，然后可将其随后转移到细胞中，再发生PHB的重聚合反应。因此，微生物圈土壤中的微生物群落结构向具有较低亲和力的寡糖和肽转移，伴随着较高K_m值的β-葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶。

3 PHBV对土壤细菌群落结构的影响

PHBV的添加与酸杆菌门、变形菌门和绿弯菌门的相对丰度增加，以及厚壁菌门的相对丰度降低有关。后者先前被认为是可以在高C利用率的环境中快速生长的富营养生物。相反，在N利用率低的贫营养环境中，酸杆菌门和绿弯菌门趋于占主导地位。如上所述，PHBV降解过程中释放的大量3-羟基丁酸也可能降低了pH值，因此有利于酸杆菌门的生长。硝化螺旋菌门是亚硝酸盐氧化细菌，普遍存在于陆地环境中，并且在农业土壤的生物氮循环和硝化作用中发挥了重要作用。添加PHBV后硝化螺旋菌门丰度增加表明N循环发生了变化，这归因于微塑料圈中的养分限制大于非根际土壤中的养分限制（如C-N循环酶的V_max比值所示；5.1 vs. 8.6）。在PHBV处理组中，拟杆菌门的相对丰度显着增加。这类富营养生物广泛分布在土壤中，专门用于降解复杂的有机物。因此，由于从PHBV降解中释放出单体化合物，PHBV处理过的土壤中的DOM库显著高于非根际土壤。尽管在这项研究中仅调查了细菌群落，但真菌和中小型土壤动物种群很可能也受到PHBV的极大影响，并参与了其降解。需要进行进一步的研究以更好地了解这些群体之间的复杂相互作用。总体而言，我们的结果强调了PHBV具有引起土壤微生物代谢变化的潜力，从而潜在地影响了其在土壤中的功能。除微塑料圈外，PHBV的添加还改变了非根际土壤中的微生物群落，这表明这些变化不仅限于土壤中的热点。

结论

农业土壤中的微生物活动通常受到碳的限制，因此少量的碳输入也会在土壤微生物群落中引起新陈代谢的变化。在这里，我们发现添加PHBV可以增加微生物活性、生长和胞外酶活性。这最有可能导致微生物通过使用可降解的聚合物作为能源来降解SOM。PHBV处理过的土壤可能具有独特的微生物生存能力，通过改变土壤的生态功能和生物地球化学过程，从而刺激土壤碳和养分循环。尽管已经将生物塑料作为石油基塑料的替代方案，但本研究强调了考虑生物塑料的潜在缺点（例如对于植物生长和健康）的重要性。本研究旨在了解局部PHBV热点在土壤中的短期影响。未来的方向需要考虑长期的现场研究以及需要在不同情况下（例如土壤类型、农业实践、气候变化）对PHBV进行生物降解的现场测试，并需要在更长的时间内使用实际的聚合物混合物，尤其要考虑植物-土壤-微生物之间的相互作用。