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北京师范大学 | Environ. Pollut.：多种生物分析方法揭示了与膜受体整合素αvβ3相关的甲状腺破坏机制

2021

05/17

微生态

A-

A+

本研究对DEHP和其他甲状腺激素干扰物的甲状腺破坏作用及其机制提供了新的见解，将有助于构建DEHP和其他甲状腺激素干扰物的不良结果通路。

编译：微科盟蓝胖儿，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载。

导读

邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）是一种适合大规模生产的人造化学品，其用途广泛；虽然被限制使用，但DEHP仍然普遍存在于环境中，并显示出破坏甲状腺系统结构或功能的潜力。但其毒性机制复杂，目前尚不清楚。在这项研究中，采用了一系列方法来研究DEHP诱导的甲状腺破坏效应及其作用机制，重点研究了一种新发现的膜受体介导的机制。结果表明，DEHP在环境浓度（2和5 μmol/L）下促进大鼠垂体瘤（GH3）细胞增殖和c-fos基因表达，与天然甲状腺激素3，30，5-三碘-L-甲状腺原氨酸（T3）类似。大分子DEHP-BAS不能通过细胞膜与核受体相互作用，但当给药浓度与DEHP浓度相当时，可上调c-fos基因表达；分子对接表明DEHP对膜受体整合素α_vβ₃具有亲和力；2 μmol/L的DEHP可上调GH3细胞中β₃基因的表达；加入抑制整合素α_vβ₃的RGD肽后，DEHP诱导的c-fos基因上调减少。所有这些发现都支持DEHP诱导的甲状腺破坏效应可能是由膜受体整合素α_vβ₃介导的假设。此外，DEHP激活下游细胞外调节蛋白激酶（ERK1/2）通路，上调raf-1、MEK-1和MAPK1的基因表达，提高p-ERK的蛋白水平；由DEHP诱导的ERK1/2激活和c-fos上调被PD98059（ERK 1/2抑制剂）减弱。综上所述，这项研究表明膜受体整合素α_vβ₃和下游ERK1/2通路可能参与DEHP诱导的甲状腺破坏作用。本研究对DEHP和其他甲状腺激素干扰物的甲状腺破坏作用及其机制提供了新的见解，将有助于构建DEHP和其他甲状腺激素干扰物的不良结果通路。

论文ID

原名：Multiple bioanalytical methods reveal a thyroid-disrupting mechanism related to the membrane receptor integrin α_vβ₃

译名：多种生物分析方法揭示了与膜受体整合素α_vβ₃相关的甲状腺破坏机制

期刊：Environmental Pollution

IF：6.792

发表时间：2021.3

通讯作者：李剑

通讯作者单位：北京师范大学水科学研究院

实验设计

在本研究中，采用多种生物测定和计算机方法来研究DEHP诱导的甲状腺功能破坏的作用机制，重点研究了由膜受体介导的甲状腺功能破坏及其相关毒性通路。为此，使用了一种T-筛选实验测定DEHP的甲状腺破坏潜能；然后在DEHP暴露后测定核受体和膜受体（整合素 α_v β ₃）基因水平的转录；分子对接是新发展起来的一种测定小分子和蛋白质亲和力的方法，也被用于研究DEHP与膜受体的相互作用；通过添加抑制剂来验证靶信号通路在DEHP 诱导的甲状腺破坏作用中的作用。

结果与讨论

1 DEHP在GH3细胞中表现出破坏甲状腺的作用

100 μmol/L的DEHP对GH3细胞的毒性作用见图S1。以下数据在非细胞毒性浓度的DEHP处理中观察到的。

与DMSO（阴性对照，图1A）相比，2和5 μmol/L的DEHP显著诱导GH3细胞增殖，细胞增殖率分别为117.4%和118.8%。与DMSO相比，2和5 μmol/L的DEHP分别将c-fos基因表达上调1.2倍和1.7倍（图1B）。基因c-fos的上调与DEHP暴露后细胞增殖的促进作用一致。阳性对照组中，T3（20 nmol/L）促进GH3细胞增殖（151.2%；图1A），并将c-fos基因上调1.2倍（图1B）。DEHP在诱导GH3细胞增殖方面的表现与T3相似。

图1 DEHP诱导GH3细胞增殖。（A）MTT法测定DEHP对细胞增殖的影响。2、5 μmol/L DEHP处理细胞48 h，MTT法测定光密度（OD）。（B）2、5 μmol/ LDEHP处理后c-fos mRNA表达的RT-PCR分析。以DMSO为空白对照，T3（20 nmol/L）为阳性对照。

GH3细胞增殖具有依赖于甲状腺激素的特征，因此被广泛用于测定化学物质的甲状腺功能破坏潜能。在GH3模型细胞的基础上，开发了一种T-筛选试验。我们的T-筛选试验结果显示，DEHP诱导GH3细胞增殖，表明其功能类似于T3。这些结果表明DEHP可以破坏甲状腺的活性。Ghisari和Bonefeld-Jorgensen也报道了类似的结果，他们发现DEHP在相同浓度下促进GH3细胞增殖（之前的研究为10 μmol/L，本研究为5 μmol/L）。最近的一项研究表明，DEHP在小鼠体内显示出甲状腺激素阻断活性，为我们的研究结果提供了体内证据。

基因c-fos在细胞增殖的调节中起着非常重要的作用。蛋白fos是c-fos基因表达的产物，是激活蛋白1（AP-1）的关键成分，参与细胞增殖的调节。在本研究中，在DEHP暴露后观察到c-fos基因表达和GH3细胞增殖增加的趋势。Barrios-Estrada等人报道，在PC-3和22RV细胞中，邻苯二甲酸酯可以上调c-fos表达，激活AP-1，诱导细胞增殖。这些结果支持了DEHP可能调节c-fos基因表达以促进细胞增殖的观点，DEHP在调节基因c-fos表达方面的作用类似于T3。我们的结果还表明，DEHP在调节基因c-fos表达方面的作用类似于T3。据报道，T4（主要的天然THs之一）增加了该基因在HeLa人上皮细胞中的表达。总之，DEHP在促进GH3细胞增殖和相关基因表达方面表现出甲状腺破坏效应。

由于环境暴露水平高，DEHP诱导甲状腺功能破坏的能力是环境安全的一个重要问题。在本研究中，DEHP诱导的甲状腺破坏作用的最小作用浓度为2 μmol/L。先前的研究表明，中国水生环境DEHP的测量范围为< 0.01~2634.41 μg/L（<25.6 pmol/L~6.75 μmol/L）），较高的值超过了最低效应浓度。因此，在水生环境中，可以预测DEHP诱导的甲状腺破坏作用，并对可能的毒性风险进行评估，以确保环境安全和人类健康。

2 DEHP 诱导的甲状腺破坏是由TRβ介导的

为了探讨DEHP诱发的甲状腺破坏效应的机制，测定DEHP暴露后细胞中核TR基因（ TRα 和TRβ）的表达。结果表明，与DMSO相比，2和5 μmol/L的DEHP分别使TRβ基因表达上调1.3倍和1.5倍，而TRα基因无明显差异（p > 0.05；图2A）。此外，在TRβ基因沉默后，观察到DEHP（ 5μmol/L ）诱导的细胞增殖（图2B）和DEHP（5 μmol/L）上调的c-fos基因表达（图2C）明显减少。

TRβ由TRβ基因编码，是介导TH功能的关键核受体。结果表明，DEHP可以上调 TR β基因的表达。一些已知的THDCs同样可以调节TRβ基因的表达，例如，100 mg/L磷酸三苯可将GH3细胞中TRβ基因的表达上调1.5倍；50 μg/L乙草胺（一种手性氯乙酰胺农药）能使斑马鱼胚胎中的TRβ基因表达增加2.5倍。这些结果表明，DEHP导致GH3细胞的甲状腺活性中断，部分原因可能与TRβ基因表达的调控有关。我们之前的研究表明，DEHP具有与TRβ结合的能力，通过重组TRβ基因酵母生物测定表明，DEHP的浓度为2.2 μmol/L时产生的最大效果的20%。Shi等人在绿猴肾成纤维细胞（CV-1）中证实了这种结合亲和力。这些结果表明， TR β是DEHP诱导的甲状腺破坏的重要靶向核受体，因为它调节 TR β基因的表达并与TRβ蛋白发生相互作用。

基因沉默是研究基因功能的有力工具，已广泛应用于化学分子机制研究领域。沉默TRβ基因可以特异性地使核 TR β蛋白失活。Selmi- Ruby等人报道了TRβ基因靶向失活的TRβ突变小鼠甲状腺大小和功能活性严重缺陷，揭示了TRβ调控TH产生的分子机制。在本研究中，TRβ基因沉默后，通过降低细胞增殖率和降低基因c-fos表达来衡量DEHP诱导的甲状腺破坏作用减弱。这些发现证实了TRβ参与了DEHP诱导的GH3细胞的甲状腺干扰效应。

与TRβ相比，DEHP暴露后TRα的表达基因在没有明显的变化。说明TR亚型 TRα 和TRβ在DEHP反应中表现出不同的变化。据报道， TRα 和TRβ在TH生理功能中发挥不同的作用，其分布也表现出不同的器官特异性模式。TRβ通过作用于下丘脑、垂体和甲状腺水平参与TH的产生，而TRα在TH调节中的作用非常有限。Kowalik等人也支持这样的假设，即TRβ，而不是TRα，是调节T3促进的细胞增殖的关键TR亚型。这些报告在一定程度上解释了TRα和TRβ基因在DEHP诱导的甲状腺破坏中的不同表现。

图 2（A）DEHP诱导GH3细胞中甲状腺激素核受体基因的表达。2和5 μmol/L的DEHP处理GH3细胞后TRα和TRβ基因表达的RT-PCR分析。（B）DEHP诱导GH3 （ TRβ-）细胞增殖。用2和5 μmol/L的DEHP处理细胞48 h，MTT法检测细胞增殖。（C）2和5 μmol/L的DEHP处理GH3（TRβ-）细胞后c-fos mRNA表达的RT-PCR分析。以DMSO为空白对照，T3（20 nmol/L）为阳性对照。

3 DEHP通过整合素α_vβ₃诱导甲状腺破坏

为了进一步探讨DEHP诱导甲状腺功能破坏的可能机制，利用 DEHP-BSA 这一无法通过细胞膜的大分子复合物，研究其对GH3细胞增殖的影响。结果显示，在相同的浓度下， DEHP-BSA 没有表现出与 DEHP （5μmol/L）相似的对GH3细胞增殖的促进作用（图3）。然而，DEHP-BSA在GH3细胞中将c-fos基因上调了4.4倍（图3）。

图3（A）DEHP-BSA对GH3细胞增殖及c-fos mRNA表达的影响。DMSO为空白对照。

DEHP-BSA由于其大分子特性不能通过细胞膜。结果表明，DEHP-BSA可促进基因c-fos的表达，但不影响细胞增殖，这可能与基因水平和细胞水平的敏感性差异有关。DEHP-BSA可能作用于细胞膜，从而调控基因c-fos。大分子复合物已被广泛应用于研究类固醇激素与膜受体功能的相互作用。牛血清白蛋白（BSA）缀合的大分子化合物虽然在评价THDCs方面用途有限，但已被应用于雌激素和雌激素干扰物的研究。例如，雌二醇（E2）-牛血清白蛋白用于验证膜雌激素受体（如GPR30）参与E2生物学功能。Clark等人报道，E2-BSA通过GPR30将信号从细胞膜转移到细胞核。同样，本研究的DEHP-BSA实验结果表明，膜受体可能参与了DEHP诱导的GH3细胞的甲状腺破坏作用。

为了探讨DEHP与膜受体的可能相互作用，我们通过分子对接的方法模拟了DEHP与整合素 α_vβ₃ （已知的TH膜受体）的结合。结果表明，DEHP与整合素α_vβ₃的RGD结构域结合；在赖氨酸（LYS B：253）上形成了一个键，对接能为-37.13 kcal/mol（图4A）。

近年来，分子对接作为研究化学物质与大分子蛋白质相互作用的有效工具，在环境毒理学领域得到了广泛的应用。在计算机上，THs对接在整合素 α_vβ₃ 胞外结构域的RGD结合位点，但不占据α_v和β₃结构域之间的完整构象空间，并且在α和β亚基的两侧有足够的空间让TH相互作用。本研究结果表明DEHP与整合素α_vβ₃的结合能与T3和T4与整合素 α_vβ₃ 的结合能相当（-42.32和-42.58），正如在以前的工作中所报道的。因此，可以推断DEHP可能与整合素α_vβ₃以类似于THs的方式相互作用，从而破坏TH的功能。我们的实验室开发了一种放射性配体竞争性结合试验来评估THDCs对整合素 α_vβ₃ 的结合亲和力，结果表明DEHP可以与整合素α_vβ₃结合，在10 μM时具有明显的结合效力，该浓度与本研究中测试的浓度相当。这些发现进一步证实整合素α_vβ₃参与了DEHP诱发的甲状腺功能紊乱

测定DEHP暴露后 α_v 和β₃基因的表达。结果显示，与DMSO相比，2和5 μmol/L的DEHP分别上调了β₃基因的表达2.4倍和2.3倍，而α_v基因的表达仅在5 μmol/L时上调（图4B）。T3作为阳性对照，也将 α_v 和β₃基因表达上调了1.1倍和1.7倍（图4B）。

整合素α_vβ₃可以介导TH作为膜受体的功能。先前的一项研究表明，在α_vβ₃高表达的细胞（OVCAR3细胞）和α_vβ₃低表达的细胞（A2780细胞）中，1 nmol/L的T3均能增强α_v和β₃的转录和增加基础整合素水平。本研究结果表明，DEHP与T3在调控整合素 α_vβ₃ 基因方面表现出相似的行为。这一发现提示DEHP可能通过整合素α_vβ₃诱导甲状腺破坏作用。关于膜受体整合素 α_vβ₃ 的研究报道有限。我们之前的报道显示DnBP通过整合素α_vβ₃上调β₃基因表达，导致甲状腺功能紊乱。Ho等人报道，白藜芦醇抑制整合素α_vβ₃的表达和蛋白积累，从而抑制原代人子宫肌瘤细胞的增殖。本研究为膜受体整合素α_vβ₃参与DEHP诱导的甲状腺破坏作用提供了新的证据。

图4（A）DEHP（固体）与整合素α_vβ₃分子对接。α_v和β₃分别用黄色和紫色表示。（B）DEHP诱导GH3细胞中膜受体整合素α_vβ₃基因的表达。2和5μmol/L的DEHP处理GH3细胞后α_v和β₃基因表达的RT-PCR分析。DMSO为空白对照，T3（20 nmol/L）为阳性对照。（C）经鉴定的GH3细胞中差异表达基因间的相互作用网络。节点的大小表示基因的程度；高度值的基因用大圆圈表示。

图5A显示RGD肽（整合素α_vβ₃的拮抗剂，500 μmol/L）阻断了由DEHP（ 5μmol/L ）诱导的α_v基因表达的显著上调。如前所述，将GH3细胞暴露于5 μmol/L的DEHP后，β₃基因的表达增强了2.3倍。在加入500 μmol/L RGD肽后，β₃基因表达在DEHP暴露时降低至1.8倍（图5B）。此外，DEHP（5 μmol/L）诱导的c-fos上调从1.7倍降至1.4倍（图5C）。

RGD肽作为整合素α_vβ₃的特异性抑制剂，可以特异性识别和结合整合素α_vβ₃，从而抑制与其他化学物质的结合或减轻细胞增殖。本研究结果表明，RGD肽抑制由DEHP引起的α_v，β₃和基因c-fos表达上调。这一发现可能表明整合素α_vβ₃在DEHP诱导的甲状腺破坏效应中的作用。Bergh等人报道，100 μmol/L RGD肽抑制T4和整合素α_vβ₃的结合从100%到< 25%。尽管拮抗剂（例如RGD肽）的应用证据有限，本研究的生物测定结果支持这一观点，膜受体整合素α_vβ₃可能通过调节整合素α_vβ₃基因的表达并与整合素α_vβ₃膜受体相互作用而在DEHP诱导的甲状腺破坏中发挥重要作用。这些发现为研究DEHP致甲状腺破坏的分子生物学事件指明了一个新的方向，并有助于探讨其毒性机制。

图5 RGD肽（整合素α_vβ₃抑制剂）存在和不存在时DEHP对GH3细胞作用的比较。（A）、（B）、（C）在GH3细胞中DEHP（5μmol/L）暴露与RGD肽（500 μmol/L）共同处理后α_v、β₃、c-fos基因表达的RT-PCR分析，DMSO为空白对照。

4 DEHP通过ERK1/2途径诱导甲状腺破坏

为了进一步探讨去甲肾上腺素通过α_vβ₃引起甲状腺破坏效应的分子机制，在DEHP暴露后测定了ERK1/2途径的基因和蛋白质水平。结果表明，在 5 μmol/L 的DEHP暴露后，raf-1、MEK-1和MAPK1基因分别上调1.2倍、1.4倍和1.2倍；在2 μmol/L的DEHP暴露后，MAPK3被上调1.4倍，并且k-ras基因的表达没有明显改变（图6A）。对p-ERK表达显著促进，而DEHP（5 μmol/L）暴露对总ERK蛋白表达没有明显影响（图6B）。此外，DEHP在调节GH3细胞的ERK1/2途径方面的表现与T3相似（图6）。

我们的结果表明DEHP可以激活GH3细胞的ERK1/2通路，从而促进细胞增殖。ERK1/2参与一系列重要的生物学过程，如细胞增殖、分化、发育和凋亡。ERK1/2通路由k-ras、raf-1、MEK-1、MAPK1和MAPK3以及下游基因如c-fos组成。ERK1/2可通过磷酸化被一些生长因子或化学物质激活，p-ERK可进入细胞核激活转移因子，如c-fos，最终诱导生物功能。Ataei等人报道，在OVCAR3细胞中，1 nmol/L CdCl₂使p-ERK蛋白水平提高2.6倍，使基因c-fos上调4.5倍，诱导其增殖133%。

DEHP在不同浓度下上调MAPK1和MAPK3的基因表达，这可能与MAPK 亚型的敏感性不同有关。MAPK1和MAPK3是MAPK的亚型，在组织中以不同的水平表达。大量证据支持MAPK1和MAPK3具有功能上不同的属性和敏感性差异。因此，选择不同浓度的DEHP进行ERK抑制试验。

图6 DEHP诱导ERK1/2信号通路的激活。（A）2和5 μmol/L的DEHP处理GH3细胞后，RT-PCR分析k-ras、raf-1、MEK-1、MAPK1和MAPK3基因表达。（B）Western blot分析GH3细胞中5 μmol/L的DEHP处理后ERK和p-ERK蛋白水平。以DMSO为空白对照，T3（20 nmol/L）为阳性对照。

加入50 μmol/L的PD98059（ERK1/2的拮抗剂）后，分别在浓度为2和5μmol/L的DEHP暴露下，MAPK1和MAPK3基因表达均未见明显影响（图7A和B）。DEHP（ 5 μmol/L ）引起的c-fos上调从1.7倍下降到1.1倍（图7C）。PD98059也能抑制5 μmol/L DEHP诱导的细胞增殖（图S3）。

如上所述，当暴露于DEHP时，c-fos、α_v、β₃、TRβ、TRα、raf-1、MEK-1、MAPK1和MAPK3在GH3细胞中的基因或蛋白质水平上表达不同。这些蛋白质的相互作用网络如图4C所示。该图显示，这些蛋白质可能相互作用，ERK1/2通路在建立核受体和膜受体之间的联系中起着重要作用。

图7 比较有和没有PD98059（ERK 1/2抑制剂）时DEHP对GH3细胞的影响。（A）RT-PCR分析PD98059（50 μmol/L）共处理DEHP（5 μmol/L）和DEHP（5 μmol/L）处理前后GH3细胞中MAPK1基因表达情况。（B）RT-PCR分析PD98059（50μmol/L）共处理DEHP （2 μmol/L）和DEHP（50 μmol/L）共处理前后GH3细胞中MAPK3基因表达情况。（C）RT-PCR分析PD98059（50 μmol/L）共处理DEHP（5 μmol/L）和DEHP（5 μmol/L）后GH3细胞c-fos基因表达。以DMSO为空白对照。

PD98059已被广泛用作ERK1/2研究的特异性抑制剂。Cotrim等人报道，PD98059抑制了MEK-1的激活，从而抑制了HC1细胞中的ERK1/2通路。结果表明，PD98059抑制ERK1/2通路，抑制DEHP诱导的c-fos上调和细胞增殖。这一发现可能支持ERK1/2通路参与DEHP诱导的GH3细胞增殖。据报道，MAPK/ERK级联在细胞增殖、分化和凋亡中起重要作用。磷酸化的ERK1/2进入细胞核并作用于转录因子，与细胞增殖密切相关。其他化学物质对细胞增殖的类似调节作用也有报道。例如，Ventura等人报道，50 μmol/L毒死蜱农药（一种杀虫剂）通过ERK1/2途径抑制MCF-7细胞增殖，添加5 μmol/L PD98059后毒死蜱诱导的细胞增殖率显著降低，揭示了ERK1/2参与毒死蜱诱导的MCF-7细胞增殖。总之，我们的结果表明 DEHP 可能通过ERK1/2途径诱导甲状腺功能破坏。

与TR结合的化学或其他应激诱导分子会导致异常基因转录和不利结果。我们的研究结果表明，除了核受体外，膜受体整合素α_vβ₃也参与调节DEHP诱发的甲状腺破坏。尽管关于DEHP与整合素 α_vβ₃ 亲和力的不良结果的信息是有限的，但本研究基于体外细胞实验确定了ERK1/2激活和基因转录调控。重要的是，指示核外整合素 α_vβ₃ 活性的作用往往会导致核转录事件的变化，这意味着可能存在甲状腺激素的膜和核受体重叠。因此，迫切需要研究DEHP与整合素α_vβ₃的相互作用，并将分子引发的事件与不良结果联系起来。将进行以下研究，以获得体内数据，提供关于假设机制中关键事件和不良结果的组织病理学和/或生物化学信息。可选择斑马鱼、小鼠、肥头鲦鱼等动物模型进行体内毒性评价；可以采用免疫细胞化学、蛋白质敲除、选择性阻断和转录组技术来鉴定毒性途径的潜在成分。

结论

本研究结果表明，DEHP在2 μmol/L的浓度水平上表现出甲状腺破坏作用，这本研究报道的环境浓度范围内。因此，DEHP暴露的生态风险值得关注，因为它具有破坏甲状腺的毒性。DEHP具有复杂的作用机制。核和膜受体参与DEHP诱导的甲状腺激素破坏。DEHP可调节TRβ和整合素α_vβ₃的基因表达，并与核受体和膜受体结合。与整合素α_vβ₃结合后，DEHP可能激活ERK1/2通路，驱动下游信号转导，表明核受体不足以描述DEHP作用的分子起始事件，需要考虑DEHP与膜受体的结合。这些发现有助于丰富THDC筛选的毒理学指标，阐明THDC的生物学机制。