导读
果皮中富含川陈皮素（Nobiletin），具有良好的抗肥胖活性。然而，其抗肥胖机制仍不清楚。本研究旨在探讨川陈皮素与高脂饮食小鼠肠道菌群的双向作用。在结肠生物转化方面，在48 h排泄研究和连续8周给药研究中，高脂饮食小鼠粪便中发现了比Nobiletin更多的生物活性，更高的去甲基化代谢物。此外，长期口服Nobiletin可改变肠道菌群，提高去甲基化能力，促进短链脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）的产生。小鼠肝脏和粪便中代谢产物的比较表明，肠道菌群可能比宿主对Nobiletin具有更高的生物转化活性。在属水平上的2种细菌Allobaculum和Roseburia在饲养4周和8周后仍被Nobiletin富集。它们可能与Nobiletin生物转化的增强有关，并积极促进其在体内的健康益处。本研究证明Nobiletin与肠道菌群的双向交互作用对其抗肥胖作用具有重要作用。
原名：Bidirectional interaction of nobiletin and gut microbiota in mice fed with a high-fat diet
译名：高脂饮食小鼠体内川陈皮素（Nobiletin）和肠道菌群的双向交互作用
期刊：Food & Function
IF：4.171
发表时间：2021.3.3
通讯作者：Chi-Tang Ho & Qingrong Huang
通讯作者单位：美国罗格斯大学食品科学系
川陈皮素（Nobiletin ）是一种最普遍的多甲氧基黄酮（polymethoxyflavones， PMFs），仅存在于柑橘类植物中，特别是在果皮中。黄酮骨架上有6个甲氧基，分别分布在A环的5,6,7,8-位和b环的3′, 4′-位（图1A）。已有研究表明 Nobiletin 对控制肥胖、预防炎症和癌症、改善大脑功能等有积极作用。在其抗肥胖活性方面，已通过细胞和动物实验来研究其潜在机制。在3T3-L1细胞中，Nobiletin可有效激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activatedprotein kinase, AMPK）通路，抑制脂肪/脂质生成，并在分子水平上诱导棕色脂肪样细胞表型。此外，还有研究报道Nobiletin可调节小鼠体内的脂肪因子和炎症因子，改善高血糖、血脂异常和胰岛素抵抗症状。 肥胖的发病机制是复杂的。最近的研究表明，肠道微生物群在宿主肥胖中起着关键作用。结肠微生物群是宿主体内的重要器官，具有众多的细胞和基因库，发挥着维持宿主健康的多种功能。据估计，大约90 %的口服植物化学物质会到达结肠并通过肠道微生物群进行生物转化。有些结肠代谢物甚至比它们的前体表现出更好的生物活性。另一方面，有报道称植物化学物质影响肠道微生物群的组成。而通过此前大量研究，可以发现，一些植物化学物质的抗肥胖作用与它们对肠道微生物群的调节有关。因此，植物化学物质与肠道微生物的双向相互作用对宿主的健康有着重要的意义。 Nobiletin已被报道在体内进行生物转化，但对其通过肠道微生物群进行生物转化的研究较少。PMFs最常见的代谢途径是甲氧基methoxy的去甲基化。在小鼠尿、结肠粘膜和肝微体中均发现了Nobiletin的典型代谢物，包括3′- 去甲基川陈皮素（3′-demethyl-nobiletin，3′-DMN）、4′-去甲基川陈皮素（4′-demethyl-nobiletin，4′-DMN）和3, 4 -二去甲基川陈皮素（3′,4′-didemethylnobiletin，3′,4′-DDMN ）。而根据我们最近对大鼠尿液和粪便中Nobiletin代谢产物的研究，肠道微生物群可能比宿主对Nobiletin具有更强的去甲基化活性。此外，对小鼠粪便代谢量的宏基因组分析表明，在11周高脂饲喂处理后采用PMF处理可增强肠道微生物群的异种生物降解和代谢途径。脱甲基代谢物（demethylated metabolites）的产生被认为是Nobiletin在体内整体生物活性的一个重要因素，因为代谢产物比Nobiletin具有更强的抗炎和抗动脉粥样硬化活性。Wu等人发现，在接受Nobiletin补充饮食20周的小鼠结肠黏膜中，去甲基化代谢物的浓度大约是Nobiletin的20倍。这提示了Nobiletin对结肠癌的保护作用可能与其代谢产物密切相关。综上所述，鉴于其广泛的生物转化和较高的生物活性，更好地了解Nobiletin代谢有助于揭示其体内抗肥胖活性。 据本研究所知，最近没有研究揭示Nobiletin和肠道菌群的双向交互作用及其在肥胖控制中的作用。本研究旨在探讨高脂饮食（high-fat diet，HFD）小鼠结肠微生物群对Nobiletin的代谢，以及其在小鼠肝脏和大脑中的代谢。此外，通过分析肠道微生物组成和粪便短链脂肪酸（SCFAs）的变化，探讨Nobiletin对肠道菌群的调节作用。本研究将进一步深化对Nobiletin抗肥胖作用机制的认识，为开发Nobiletin类功能性食品提供科学依据。
1 Nobiletin对小鼠体重、食物摄取量、脂肪组织质量及肝脏脂质积累的影响如图1B所示，口服Nobiletin基因显著降低了小鼠体重的增加。两组小鼠体重在第3周开始有统计学差异（显著水平，P <0.05）。虽然NOB组的平均摄食量比HFD 组少约14%（图1C），但摄取量的减少不能解释体重的减少（≈19%）。此外，喂食Nobiletin的小鼠的平均脂肪组织质量约为高脂饮食小鼠的53%（图1D）。此外，图1E和F所示，Nobiletin显著抑制了肝脏的脂质积累。与之前的报道类似，本研究表明Nobiletin在HFD组小鼠中具有良好的抗肥胖效果。
图1 川陈皮素对HFD组小鼠的影响：（A）川陈皮素的化学结构，（B）身体体重增加的老鼠，（C）食物摄入量，（D）脂肪组织肿块，肝脏脂质积聚的代表性图像（400×显微镜下观察），（E）对照组和（F）实验组。不同字母表示组间差异有统计学意义（P<0.05）。
Nobiletin及其代谢产物从粪便中排泄的量见图2。Nobiletin去甲基化代谢物（包括3′-DMN，3′-DMN和3′,4′-DDMN）的含量显著高于前12 h Nobiletin给药。消化12 h后，粪便中去甲基化代谢物的数量低于或与Nobiletin相当。虽然Nobiletin及其代谢产物大部分在口服后24 h内排出，但在24-48 h内的粪便中仍能检测到少量Nobiletin。这说明口服Nobiletin在结肠中排泄需要超过24 h。
图2 48 h粪便中Nobiletin及其代谢产物的含量。
如图3A所示，随着饲喂时间的延长，粪便中Nobiletin的浓度逐渐升高。这说明Nobiletin在饲喂8周的粪便中具有积累作用。这一结果与我们之前的48 h排泄研究一致，这表明每日给药Nobiletin在结肠中的消化时间超过了24 h。Nobiletin的大部分生物转化发生在黄酮骨架（flavoneskeleton）的B环上。通过比较8周的浓度变化，粪便中的B环代谢物比Nobiletin的增加幅度要大得多（图3B&C）。随着时间的推移，代谢产物与Nobiletin的比值越来越大，这表明肠道菌群的生物转化能力逐渐增强。8周后，粪便中3′,4′-DDMN的浓度（≈300 μg g−1）明显高于3′-DMN和4′-DMN的浓度（≈50 μg g−1）和Nobiletin的浓度（≈0.45 μg g−1）。这表明肠道微生物群可以广泛地将Nobiletin转化为单离子去甲基化代谢物（mono-demethylatedmetabolites，以下简称代谢物）。肠道菌群生物转化活性提高的进一步证据是产生了更多样化的代谢物。图3D显示了使用选择性离子模型（the selective ionmodel）在粪便中识别出的代谢物，前2个峰均与A环位置去甲基化的代谢物保持对应。如图3E所示，小鼠粪便中A环单链DMNs的浓度随着饲喂时间的增加而增加。可以推测的是，检测到的A环单链DMNs的去甲基化发生在6-或7-位。粪便中A环单链DMNs浓度的增加（图3E）会导致代谢物更加多样化，Nobiletin 的去甲基化程度也更大。
图3 连续8周饲喂试验中粪中Nobiletin及其代谢产物的浓度变化：（A）Nobiletin，（B） B环DMN，（C）3′,4′-DDMN，（E）A环DMN。（D）喂养8周后收集的粪便中DMN的LC-MS谱。
选取肝脏和大脑为代表组织，研究8周后Nobiletin在宿主体内的代谢情况。如表1所示，Nobiletin在肝脏和大脑中的浓度（分别为14.67 ± 6.25 ng g−1和16.26 ± 4.95 ng g−1）具有可比性。与以前的研究相似，这一发现表明Nobiletin具有良好的血脑屏障（blood-brainBarrier，BBB）通透性。然而，这2个器官对于去甲基化代谢物有相当不同的特征：肝脏的代谢物比Nobiletin多得多，而大脑的代谢物比Nobiletin少得多。肝脏中3′- 和4′-DMN的浓度均高于3′,4′-DDMN。这表明肝脏的去甲基化活性可能比肠道微生物群更弱，因为3′,4′-DDMN在粪便代谢物中占主导地位（图3B和C）。
表1 Nobiletin及其代谢产物在小鼠肝脏和大脑中的浓度
图4 Nobiletin影响高脂饮食（HFD）小鼠粪便短链脂肪酸（SCFA）谱。HFD组与NOB组的统计学差异*P < 0.05。5 Nobiletin对粪便短链脂肪酸SCFAs的影响在第1、4、8周时测定2组小鼠粪便中短链脂肪酸（NOB vs. HFD）（图4）。总短链脂肪酸表示乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸的总和。综上所述，各组粪便中SCFAs浓度随时间流逝呈下降趋势，这可能与2组均补充了HFD有关。前4周，两组粪便短链脂肪酸浓度无显著差异。8周后，NOB组小鼠粪便中总SCFAs和乙酸浓度显著高于HFD组。这2个基团的丙酸无显著性差异。NOB组的丁酸产量低于HFD组。比较大的个体方差和较低的粪便丁酸浓度可以解释这一现象。而另一项研究发现，PMF处理并没有显著改变小鼠粪便中的丁酸水平。然而，本研究中丁酸的减少从总SCFAs的变化来看可以忽略不计。与之前的报道作对比，发现Nobiletin和PMF处理均对粪便总SCFA产生类似的影响。采集第4周和第8周NOB组和HFD组小鼠粪便，检测肠道菌群组成变化。4组肠道菌群的alpha多样性见表S1。第4周时，NOB组的Shannon、Simpson和Chao1指数较高，说明NOB组结肠微生物群落比HFD组更多样化。但在第8周，NOB组和HFD组这3项指标并无显著差异。这说明Nobiletin的摄食8周对微生物多样性没有显著影响。在相同的显著性水平（LDA = 3.5）下，采用LEfSe分析NOB组和HFD组在第4周（图5A）和第8周（图5B）时肠道微生物组的结构变化。不同时间间隔的富集菌表现出不同的表型。例如，在第4周，Nobiletin在门水平上富集厚壁菌门Firmicutes和拟杆菌门Bacteroidetes，抑制放线菌门Actinobacteria和变形菌门Proteobacteria（图5A），而在第8周，Nobiletin富集厚壁菌门Firmicutes和放线菌门Actinobacteria，抑制拟杆菌门Bacteroidetes（图5B）。同样，在肠道微生物的目、科、属水平也观察到类似的现象。在这2个时间点上，Nobiletin均富集到Erysipelotrichale的目水平和Erysipelotrichaceae的科水平上。
图5C为4组在属水平上的平均细菌分布图。在2个时间点，Allobaculum和Roseburia都被Nobiletin持续富集。第4周时，NOB组和HFD组Allobaculum的相对丰度分别为14.11±0.60%和5.98±0.23%，而第8周时NOB组和HFD组Allobaculum的相对丰度分别为14.67±8.78%和1.24±0.81%。HFD组Allobaculum的增长率随着时间的推移而下降，说明HFD会抑制结肠微生物中Allobaculum的相对丰度。而在第4周和第8周，NOB组的Allobaculum数量相当，说明Nobiletin明显促进了Allobaculum的生长，甚至弥补了HFD的抑制作用。
另一种富集菌Roseburia表现出与Allobaculum不同的动态模式。具体来说，
在第4周，NOB组的相对丰度为1.98±0.59%，HFD组的相对丰度0.38±0.06%；在第8周NOB组为2.43±0.4%，HFD组为1.26±0.18%。NOB组的Roseburia在2个时间点之间的扩增倍数似乎低于HFD组，而在种水平上，Nobiletin对Roseburia的影响更加显著，特别是对R. hominis和R. intestinalis来说（图5D）。
NOB组在第8周的相对丰度比第4周高17.69倍；而HFD组的
R. hominis
在2个时间点都处于非常低的水平。
R.intestinalis
的动态变化与
Allobaculum
相似。与HFD对照组相比，
Nobiletin
在第4周和第8周的R. intestinalis增长幅度分别为4.35倍和15.51倍。综上所述，这些结果表明随着时间的推移，Nobiletin持续促进了R. hominis和R. intestinalis的流行。
图5 Nobiletin对第4周和第8周肠道菌群组成变化的影响。
根据以往的报道，Nobiletin在HFD诱导的肥胖小鼠中有很好的抗肥胖作用。考虑到Nobiletin有限的生物利用度，大多数口服Nobiletin会绕过小肠的吸收，并与结肠中的肠道微生物相互作用。最近的一些研究表明，PMFs对肠道微生物群的调节是其体内抗肥胖活动的重要途径。然而，Nobiletin的结肠代谢及其对肠道微生物群的调节仍不清楚。在本研究中，我们用高脂饮食喂养小鼠，研究了Nobiletin和肠道菌群的双向交互作用。
采用单次给药和连续给药8周的方法研究了Nobiletin在肠道微生物群中的生物转化。在48 h粪便排泄研究中，Nobiletin的大部分在摄入后24 h内排泄。48 h内粪便中代谢产物的总回收率高于Nobiletin。其中，前12 h排出的粪便中3′,4′-DDMN 的浓度最高，其次是3′-DMN, 4′-DMN和Nobiletin。然而，另一项排泄研究发现，在前12 h排出的小鼠尿液中，DMN的浓度大约是3′,4′- DDMN的6倍。小鼠粪便和尿液中不同的代谢产物说明Nobiletin的生物转化活性在宿主和肠道菌群之间存在差异。肠道微生物可能具有比宿主更复杂的去甲基化酶系统和更高的去甲基化（demethylation）活性。通过连续8周剂量研究和微生物脱甲基活动程度，表明粪中3′-和4′-DMN/NOB和3′,4′-DDMN/NOB的浓度比与时间成正比（图3）。这表明长期摄入Nobiletin 会改变小鼠的肠道微生物群，且改变后的微生物对诺Nobiletin有更强的代谢能力。前人研究中也发现了类似的现象，例如，与西方人相比，经常食用大豆的亚洲人更有可能产生雌马酚equol，一种有益的大豆异黄酮（soy isoflavones）的结肠代谢物（如大豆苷daidzin和大豆苷元daidzein）。这些发现表明，肠道微生物群可能是一个选择性功能的库，某些代谢输入可以选择特定的路径或隐藏相应路径的微生物。在本研究中，因为考虑到大脑和肝脏在维持整个机体代谢稳态中的重要作用，我们选择了小鼠的大脑和肝脏来研究Nobiletin 在宿主体内的代谢谱。而脑和肝中Nobiletin的浓度相当可推测出Nobiletin 在血脑屏障（BBB）中有很好的通透性。近年来的研究表明Nobiletin具有神经保护作用，包括改善神经炎症、记忆障碍和痴呆，而这些有益作用可能部分来自其快速渗透BBB。肝脏被认为是宿主体内通过I期和II期酶（phase I and phase II enzymes）代谢黄酮类化合物的重要器官。根据我们之前的药代动力学研究，本研究中
Nobiletin
在小鼠肝脏中的代谢谱与大鼠血浆中的代谢谱相似。单去甲基化Nobiletin，特别是4′-DMN，在口服或静脉注射单剂量
Nobiletin
后，鼠血浆中的去甲基化代谢物中占主导。如表1所示，肝脏中Nobiletin的生物转化非常活跃，但在大脑中检测到的去甲基代谢物很少。有2个原因可以解释这一现象：（1）大脑的代谢活动缺乏；（2）由于极性的改变，循环系统中的去甲基代谢物比Nobiletin穿越BBB的能力更弱。据报道，与Nobiletin相比，Nobiletin的去甲基化代谢物具有潜在的更高的生物活性会让抗炎症和动脉粥样硬化能力。肝脏和大脑代谢物的比较表明Nobiletin对肝脏的有益作用可能与去甲基化代谢物有关，而对大脑的有益作用则取决于Nobiletin本身。此外，为了揭示Nobiletin及其代谢产物在体内的器官间通讯，特别是肠脑和肠肝轴，还需要深入的研究。至于Nobiletin对肠道菌群的调节作用，本文从粪便SCFAs 和微生物组成变化2个方面进行评价。肥胖以慢性全身性炎症为特征，HFD改变的肠道菌群是导致宿主代谢性内毒素血症和低级别炎症的原因。SCFAs被认为是肠道健康的生物标记物，因为它们具有抗炎活性。在本研究中，Nobiletin施用8周后乙酸明显升高，为总SCFAs升高的主要驱动因素（图4）。SCFAs 可以在结肠局部发挥作用，如喂养结肠细胞，通过刺激粘蛋白的产生来保护肠道屏障，通过降低pH值来抑制病原微生物的增殖。此外，SCFAs，特别是乙酸，可以进入门静脉循环，积极参与宿主能量稳态调节。例如，有研究报道SCFAs可以抑制宿主脂肪组织中的脂肪储存，并激活肝脏中的AMPK通路。因此，SCFAs可能是肠道与宿主器官沟通的途径之一，从而促进Nobiletin在体内的抗肥胖生物活性。Nobiletin能动态改变肠道微生物群的组成，改变的微生物进一步影响宿主的能量稳态。不同时间间隔富集的结肠细菌（colonicbacteria）不一定与通过LEfSe分析证实的相同。本研究中，在属水平上，2种细菌Allobaculum和Roseburia的相对丰度在这2个时间间隔内均被促进（图6）。粪便中去甲基化代谢物浓度的增加（图3）以及这2种细菌的富集可推测Allobaculum和Roseburia负责肠道菌群对Nobiletin的去甲基化活性。
图6 （A）高脂对照组（HFD）和Nobiletin治疗组（NOB）在第4、8周结肠细菌的平均属水平。（B） Roseburia hominis和Roseburia intestinalis在2组时间间隔的相对丰度。
之前已有研究调查了这2种细菌对健康的影响。通过基于RNA的稳定同位素探测分析，Allobaculum被鉴定为一种活跃的葡萄糖同化物。此外，通过Allobaculum对13C标记葡萄糖进行发酵，发现其主要代谢产物为乙酸盐、丙酸盐和乳酸盐。与正常饲喂的小鼠相比，高脂喂养的小鼠的Allobaculum丰度相对较低。相关分析表明，Allobaculum丰度与高血浆HDL浓度、低循环瘦素浓度和高能量稳态基因表达有关。与我们的发现相似的是，Allobaculum也富含一些具有抗肥胖作用的植物化学物质，如来自柑橘皮的PMFs和小檗碱。另一种富含Nobiletin的细菌，Roseburia，因其在代谢紊乱（如动脉粥样硬化、肥胖和2型糖尿病）中的保护作用而受到越来越多的关注。此外，Roseburia被发现参与了SCFA的生产。本研究中，有2种植物R. hominis和R. testinalis对Nobiletin的作用有反应。通过定殖研究这2种植物对寄主具有多种有益影响。例如，R. hominis对小鼠的治疗可以可以保护小鼠免受DSS诱导的结肠炎，增强肠道屏障功能，促进宿主Treg细胞扩张。另一项研究报道，在小鼠模型中，R. intestinalis的定殖可以降低炎症生物标志物并抑制动脉粥样硬化的发展。总之，提高这些功能细菌的丰度可能有助于Nobiletin的抗肥胖作用。综上所述，本研究通过分析Nobiletin的结肠代谢物和微生物组成变化，探讨Nobiletin与肠道菌群的双向作用。结果表明，这种相互作用对Nobiletin的抗肥胖作用具有重要作用。在排泄研究中，与Nobiletin相比，在粪便中发现了更多生物活性更高的去甲基化代谢物。此外，长期口服Nobiletin可改变肠道微生物群，改善去甲基化活性，增加短链脂肪酸的产生。肠道菌群对Nobiletin的生物转化活性可能高于宿主，因为在小鼠粪便中检测到的DDMN比例高于肝脏和大脑。通过分析肠道微生物群组成的动态变化，发现2种细菌（Allobaculum和Roseburia）与nobiletin生物转化相关。Allobaculum和Roseburia被多次报道具有许多健康益处，这表明Nobiletin在体内抗肥胖活性的途径之一应该是富集功能细菌。
附：缩写
PMF Polymethoxyflavone （多甲氧基黄酮）
AMPK AMP-activated protein kinase （腺苷酸活化蛋白激酶）
HFD High fat diet （高脂饮食）
NOB Nobiletin （川陈皮素）
DMN Demethylnobiletin （去甲基川陈皮素）
DDMN Didemethylnobiletin （二去甲基川陈皮素）
SCFA Shortchain fatty acids （短链脂肪酸）
BBB Blood brain barrier（血脑屏障）
010-82736610
股票代码: 872612
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