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科研 | Clinical Nutrition：粪便链球菌和真杆菌群联合鞘氨醇对高脂饮食小鼠血脂的调节作用（国人佳作）

2021

05/13

微生态

A-

A+

本文的发现扩展了筛选关键粪便属的方法，并为HFD小鼠粪便微生物组与代谢物之间的关系提供了见解。

导读

背景和目标：尽管高脂饮食（HFD）会影响粪便微生物组及其代谢物的组成，但粪便细菌和代谢物在应对HFD中的相对重要性仍不清楚。本研究旨在利用微生物代谢物网络鉴定HFD小鼠粪便中的关键细菌及其代谢物，并探讨关键细菌及其代谢物对HFD小鼠血脂异常的协同调节作用。

方法：采用16srDNA测序和超高效液相色谱（UPLC/TOF-MSMS）分析平台对HFD诱导的粪便微生物群及代谢产物的组成和功能进行了研究。通过微生物代谢物网络和相关性分析，研究粪便微生物组、代谢物和血清血脂异常指标之间的关系。采用小鼠模型观察粪便代谢物对血脂异常的影响。

结果：与对照相比，共有32个细菌属发生了改变，其中上调26个细菌属，下调6个细菌属。对照组与HFD组共观察到42条通路发生改变，其中以鞘糖脂生物合成途径最为显著（倍数变化0.64；p <0.001）。同时，49种粪便代谢物在HFD中发生改变，粪便微生物群与粪便代谢有关（M2= 0.776, p = 0.008）。根据微生物代谢网络，筛选出两个主要的HUB属（HUB1:链球菌（g.Streptococcus），HUB2:真杆菌（g.Eubacterium_coprostanoligenes_group）），并在本研究中发现一个细菌代谢产物鞘氨醇。此外，HUB2与粪便鞘氨醇（r =0.646, p = 0.001）及其下游代谢途径鞘糖脂生物合成途径（r = 0.544, p = 0.009）呈正相关。HUB2和鞘氨醇之间的调节关系协同介导了HFD对TCHO（33.7%）、HDL-c（37.3%）和体重（36.7%）的影响。此外，与HFD相比，补充鞘氨醇的HFD具有较低的体重（35.12± 1.23 vs.39.42 ± 1.25，p <0.001）、TG（0.44 ± 0.08 vs.0.52 ± 0.05，p = 0.002）、TCHO（3.81± 0.34 vs.4.51 ± 0.38，p = 0.002）和LDL-c（0.82± 0.09 vs.0.97 ± 0.15，p = 0.016）。

结论：细菌g. Streptococcus和g. Eubacterium_coprostanoligenes_group是HFD粪便微生态系统中的两个枢纽细菌属，g. Eubacterium_coprostanoligenes_group通过鞘氨醇介导HFD的降血脂作用。补充鞘氨醇可改善HFD引起的血脂异常。

论文ID

原名：：Fecal g. Streptococcus and g. Eubacterium_coprostanoligenes_group combined with sphingosine to modulate the serum dyslipidemia in high-fat diet mice

译名：：粪便链球菌和真杆菌群联合鞘氨醇对高脂饮食小鼠血脂的调节作用

期刊：Clinical Nutrition

IF：6.360

发表时间：2021.2.5

通讯作者：孙长颢，王茂清

通讯作者单位：哈尔滨医科大学公共卫生学院营养与食品卫生系

实验设计与方法

实验设计与方法图

图文摘要

结果

1、HFD诱导小鼠代谢紊乱模型的建立

干预后，与NCD组相比，HFD组的食物摄入量（4.04 ± 0.28vs. 3.53 ± 0.25, t = 5.71, p < 0.001，图1A），体重 (40.48 ±3.99 vs. 33.71 ± 2.47, t = 4.78, p < 0.001, Fig. 1B),血糖(14.47 ± 4.39 vs. 9.68 ± 1.57, t =3.41, p < 0.001,图1C), TG (0.53± 0.11 vs. 0.39 ± 0.10, t = 4.17, p < 0.001, 图1D), TCHO (4.82 ± 0.26 vs. 3.48 ±0.51, t = 7.71, p < 0.001 图1E), LDL-c (1.06 ± 0.17 vs. 0.65 ± 0.17, t = 5.49, p< 0.001, 图 1F), ALT(175.91 ± 67.96 vs. 41.45 ± 17.13, t = 6.36, p < 0.01, 图1H), AST (202.64 ± 33.77 vs. 23.58 ±91.27, t = 8.95, p < 0.001,图1I)和低HDL-c水平 (2.61 ± 0.34 vs. 3.44 ± 0.32, t =7.66, p < 0.001,图1G)显著增加。结果表明，本研究成功建立了HFD诱导代谢紊乱小鼠模型。

图1 干预12周后NCD与HFD临床指标的比较。（A）食物摄入量，（B）体重，（C）葡萄糖，（D）甘油三酯（TG），（E）血清总胆固醇（TCHO），（F）低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c），（G）高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c），（H）丙氨酸转氨酶（ALT），（I）天冬氨酸转氨酶（AST）。每组11个。 ^∗ p < 0.05, ^∗∗p < 0.01。

2、HFD对粪便微生物群的影响

与NCD组相比，HFD组粪便微生物的碱基数和基因序列均呈下降趋势（图2A和图2B）。OTU水平上的PCA图（图2C）和PcoA图（图2D）均显示HFD和NCD之间的粪便微生物组分明显分离。此外，HFD组内的距离大于NCD组，表明HFD可能导致粪便微生物组的差异性。

图2 NCD组和HFD组粪便微生物组和代谢物的比较。（A，B）粪便细菌碱基和序列计数的比较。（C）粪便微生物组PCA评分图。（D）粪便微生物组PCoA评分图。（E，F）分别在ESI+ 和 ESI-模式下粪便代谢谱的PCA评分图。NCD用蓝点表示，HFD用红点表示。每个数据点代表一个个体。每组11个。

在门和属水平上的详细微生物组成如图3A-B所示。在门水平上，HFD的粪便细菌组成被转移到较高的厚壁菌、变形菌、放线菌和较低的拟杆菌（图3C）。在属水平上，与NCD相比，HFD共有32个属发生显著改变，其中26个属上调，6个属下调（图3D）。此外，LEfSe分析表明，所有32个显著改变菌属都可以作为区分HFD和NCD的生物标记（图3E）。因此，这一证据表明粪便微生物群是HFD的干扰因素。通过Euclidean距离计算，显著改变菌属被有效地分为两大类群（图4A），这意味着两个类群中可能分别有两个中心属。

图3 粪便微生物组的组成和功能分析。（A，B）门和属群落分析。（C，D）门水平和属水平上的Wilcoxon秩和检验。（E）NCD与HFD的LEfSe分析。（F） NCD和HFD之间最具分化的十种KEGG途径。

3、HFD对粪便微生物群潜在功能的影响

PICRUSt分析表明，HFD和NCD患者粪便微生物群中共有1225 KOs存在显著差异。与NCD组相比，HFD组KOs上调947条，下调278条，KEGG通路42条，其中上调26条，下调16条。把不同的KO映射到被干扰的KEGG路径上。图3F列出了前十种不同的途径，涉及三种脂质相关途径。最高的是鞘糖脂生物合成（倍数变化0.64；p < 0.001），显著下调。因此，结果表明HFD可能导致脂质代谢紊乱。

在HFD中富集的属与脂肪代谢、氨基酸代谢、苯类物质代谢和脂肪聚集相关的途径呈正相关；而在HFD中减少的属与蛋白质和维生素代谢相关的途径呈正相关。因此，HFD引起的粪便细菌组成的改变可能会改变粪便细菌的功能，从而进一步影响粪便代谢产物。

4、HFD对粪便代谢物的影响

采用UPLC/Q-TOF-MS/MS平台检测粪便代谢物的变化。PCA评分图显示，在ESI+和ESI-模式下，HFD中的样本与NCD中的样本显著不同（图2E，F）。利用OPLS-DA模型以筛选HFD和NCD之间的代谢物变化。共检测到4114种代谢物，最终确定49种代谢物的变化符合以下标准：1）VIP≥1.5；2）倍数变化≥2.0或≤0.5；3）FDR<0.05；4）MS/MS片段比较。与NCD组相比，HFD组单甘酯（MGs）、脂肪酰胆碱、鞘氨醇、磷脂酸（PAs）、溶血磷脂酸（lysoPAs）、溶血磷脂酰乙醇胺（lysoPEs）、鞘磷脂（LysoSMs）显著减少，硬脂酸，在HFD中磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2 16:0/18:2）显著增加。由于HFD中许多细菌脂类相关途径和粪便中的脂类发生了改变，结果表明，改变的粪便脂类可能受改变的粪便微生物群的调节。

5、从微生物代谢物网络中筛选出主要的hub属

以PCoA为基础的Procrustes分析表明，粪便中代谢物的变化与属间存在着密切的联系(M2 = 0.776, p = 0.008,图4B)。微生物代谢物网络分析也显示了微生物组和代谢物之间强烈而复杂的相互调节关系。网络中的两个枢纽节点分别从HFD中上调和下调的属簇中选择（图4C）。在上调的簇中，hub属为 g.Streptococcus ，在下调的簇中，hub属为 g. Eubacterium_coprostanoligenes_group 。结果表明， g.Streptococcus 与25个变异属相关，g. Eubacterium_coprostanoligenes_group与15个变异属相关。此外，g. Streptococcus与脂肪鞘氨醇、酰基肉碱、部分PA、MGs和溶血磷脂呈负相关； g.Eubacterium_coprostanoligenes_group 与鞘氨醇、一些PA、MGs和溶血磷脂呈正相关（图4D）。因此，这些结果突出了枢纽属在调节宿主脂质代谢中的重要作用。

图4 粪便微生物组和代谢物的关联分析。（A）变异属与KEGG路径的Spearman’s相关分析。（B）基于PCoA的Procrustes分析在改变的粪便属基质和确定的代谢物谱之间。（C）粪便属间的微生物代谢物网络和已鉴定的代谢物。（D）改变的粪便属和鉴定的代谢物之间相关系数的热图。

6 、HFD与血脂异常的中介作用

双变量相关分析表明，两个枢纽属与临床指标之间存在显著相关性（图5A）。g.Streptococcus的增加与ALT、AST、TCHO、LDL-c、体重呈正相关，与HDL-c呈负相关（图5B-E）。结果表明，该菌对宿主脂质代谢有一定的危害。然而，g. Eubacterium_coprostanoligenes_group的下降与ALT、AST、Glu、TCHO、TG、LDL-c、体重呈负相关，与HDL-c呈正相关（图5F-J）。结果表明，它可能有利于宿主的脂质代谢（图5）。通过中介分析，评价hub基因对HFD所致血脂异常的中介作用。结果表明，g. Streptococcus是HFD与AST、TCHO、HDL-c之间的介导者，分别占50.6%、46.5%和51.6%；g. Eubacterium_coprostanoligenes_group是HFD与HDL-c、体重之间的介导者，分别占26.1%、17.8%和51.6%，分别为（图6A-C）。

图5 粪便微生物群、代谢物和血糖、血脂指数的关联分析。（A）临床指标与粪便菌属改变的相关系数热图，确定代谢物。（B-E） g. Streptococcus （HUB1）与血清TCHO、HDL-c、LDL-c、体重之间关系的散点图。（F-J） g. Eubacterium_coprostanoligenes_group （HUB2）与血清TCHO、HDL-c、LDL-c、体重和葡萄糖之间关系的散点图。（K-P）散点图显示了鞘氨醇（S）与血清TG、TCHO、HDL-c、LDL-c、体重和葡萄糖之间的关系。

7、鞘氨醇对HFD与血脂异常的调节作用

双变量相关分析表明，在改变的粪便代谢物中，鞘氨醇与所有临床指标显著相关，与ALT、AST、葡萄糖、TCHO、TG、LDL-c和体重呈负相关，与HDL-c呈正相关（图5K-P）。提示鞘氨醇对血脂紊乱有明显的治疗作用（图5）。鞘氨醇在HFD和TCHO、HDL-c、体重和AST之间的调节作用分别为30.1%、31.6%和29.7%、21.6%（图6A-C）。

图6 相关性分析。（A-C） g. Streptococcus （HUB1）、g. Eubacterium_coprostanoligenes（HUB2）、鞘氨醇（S）的介导作用，以及HUB2和鞘氨醇在HFD与TG、HDL-c和体重之间的整合介导作用。^∗p < 0.05, ^∗∗p < 0.01。

8、 g. Streptococcus 与鞘氨醇对HFD和血脂异常的协同调节作用

采用相关分析的方法研究了两个枢纽属对粪便鞘氨醇含量的影响。结果表明，g. Streptococcus与鞘糖脂生物合成途径和鞘氨醇均负相关（代谢途径：r = −0.763, p < 0.001；鞘氨醇：r = −0.665, p= 0.001，图4A，D）；g. Eubacterium_coprostanoligenes_group与鞘糖脂生物合成途径和鞘氨醇均呈正相关（代谢途径：r = 0.544, p = 0.009；鞘氨醇：r = 0.646, p = 0.001，图4A，D）。有趣的是，鞘糖脂生物合成是鞘氨醇的下游途径。因此，有证据表明，减少枢纽属可能有助于减少鞘氨醇在粪便中。

此外，还进行了Mediation分析，以探讨g.Eubacterium_coprostanoligenes_group和鞘氨醇在HFD与临床指标相关性中的协同作用。结果表明，HFD与AST、TCHO、HDL-c和体重之间的协同调节作用分别为35.7%、33.7%、37.3%和36.7%，优于单一物质（图6A-C）。

9、HFD与NCD的预测性生物标志物

ROC分析用于检验这些观察结果是否可以作为HFD的替代预测性生物标志物。结果显示，g. Streptococcus的AUC为0.967，g. Eubacterium_coprostanoligenes_group的AUC为0.868（95% CI-0.705:1，p=0.003），鞘氨醇组的AUC为0.860。值得注意的是，这些观察结果的95% CI AUC值均大于0.5，表明它们具有鉴别HFD和NCD的诊断能力。

10、鞘氨醇对HFD所致血脂异常的影响

采用UPLC/XEVO-TQ-MS平台测定粪便和血清鞘氨醇含量。与NCD组相比，HFD患者血清鞘氨醇水平较低(4.16± 1.75 vs. 7.52 ± 2.05, t = 4.15, p < 0.001, 图7B)。此外，血清鞘氨醇与粪便鞘氨醇呈正相关（r = 0.486, p = 0.022），这意味着粪便鞘氨醇可能进入循环，并进一步对脂质稳态提供生理作用。

用Mice model检测粪便微生物群是否影响高脂饮食诱导的粪便中鞘氨醇的含量和调节宿主脂质稳态。AG组比NCD组有较低的粪便鞘氨醇含量(3.38 ± 1.75 vs. 1.85 ± 0.95, t = 2.52,p = 0.015,图7A), 血清鞘氨醇 (7.52 ± 2.05 vs. 4.21 ± 2.10, t =3.98, p < 0.001,图7B), HDL-C (3.44 ± 0.17 vs. 3.10 ± 0.32, t = 2.16, p =0.035, 图7I)和更高的LDL-C (0.66 ± 0.06 vs. 0.85 ± 0.17, t = 3.36, p = 0.002, 图7H) 的含量。HFD-AG的食物摄入量（3.92 ± 0.10 vs.3.52 ± 0.24，t = 2.79，p = 0.011，图7C）、体重（39.42 ± 1.23 vs.34.72 ± 1.00，t = 5.23，p < 0.001，7D）、血糖（14.21 ± 2.16 vs.12.04 ± 1.43，t = 2.41，p = 0.02，图7E）、TG（0.52 ± 0.05 vs.0.42 ± 0.11，t = 2.87，p = 0.006，图7F）、TCHO（4.51 ± 0.38 vs.4.01 ± 0 .62，t = 2.33，p = 0.023，图7G）。此外，与HFD相比，HFD-SG还具有更高的粪便鞘氨醇（1.81 ± 1.21 vs.4.73 ± 1.78，t = 5.09，p < 0.001，图7A）、血清鞘氨醇（4.16 ± 1.75 vs.9.57 ± 2.27，t = 6.67，p < 0.001，图7B）和较低的体重（39.42 ± 1.23 vs.35.12 ± 1.23，t = 4.78，p < 0.001，图7D）、TG（0.52 ± 0.05 vs.0.44 ± 0.08，t = 3.27，p < 0.05图7F）、TCHO（4.51 ± 0.38 vs.3.81 ± 0.34，t = 3.37，p = 0.002，图7G）、LDL-C（0.97 ± 0.15vs. 0.82 ± 0.09，t = 2.54，p = 0.016，图7H）。结果表明，鞘氨醇能改善HFD所致的血脂紊乱。

图7 干预12周后NCD、AG、HFD、HFD-AG和HFD-SG临床指标的比较(A）粪便鞘氨醇，（B）血清鞘氨醇，（C）食物摄入量，（D）体重，（E）葡萄糖，（F）甘油三酯（TG），（G）血清总胆固醇（TCHO），（H）低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），（I）高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）。每组10只。与NCD比较，*p<0.05；与HFD比较，^＃p<0.05。

结论

在本研究中，利用微生物代谢物网络，确定了对HFD对粪便微生物群影响敏感的两个中心属g. Streptococcus和g.Eubacterium_coprostanoligenes_group。一系列的分析进一步表明，HFD降低了g.Eubacterium_coprostanoligenes_group的丰度，下调血清和粪便中鞘氨醇水平，对HFD引起的血脂异常有协同调节作用。此外，本研究还证明补充鞘氨醇可以改善HFD引起的血脂异常。

尽管高脂肪饮食改变了粪便微生物组和代谢物的组成和功能，但研究人员几乎没有考虑到某些细菌在整个微生物组和代谢物生态系统中的重要性。在这项研究中，粪便微生物组成，功能，及其代谢物的变化在HFD。研究发现HFD比NCD具有更高的粪壁厚壁菌群、变形菌群和更低的拟杆菌群，这与以前的研究一致。此外，与NCD相比，HFD中有32个属发生了变化，按Euclidean距离可分为富集菌群和亏损菌群。同样，本研究还发现，NCD和HFD的粪便代谢物也存在显著差异，提示HFD可能通过干扰的粪便微生物群引起粪便代谢物的显著变化。

为了揭示粪便微生物群与代谢物之间的综合调控关系，利用微生物代谢物网络识别了两个属群和代谢物群中的枢纽节点。结果表明，在HFD小鼠的富集属群和降低属群中， g.Streptococcus 和 g. Eubacterium_coprostanoligenes_group 分别是两个中心属。以往的研究发现，g. Streptococcus与血清和肝脏脂质水平升高呈显著正相关，变形链球菌作为g. Streptococcus中的一种，可引起非酒精性脂肪性肝炎的加重，提示变形链球菌可能促进HFD引起的血脂异常。研究发现，在HFD过程中，g. Eubacterium_coprostanoligenes_group群中的某些物种减少，能产生有益的SCFAs，具有抗炎作用。这一证据表明，g.Eubacterium_coprostanoligenes_group对HFD引起的血脂异常具有有益的作用。

应用PICRUSt分析法研究HFD患者粪便微生物群的潜在功能变化。结果表明，HFD患者粪便微生物群的脂质相关途径受到影响。在这些改变的脂质相关途径中，鞘糖脂生物合成途径的差异最为显著，提示相关代谢产物可能在HFD中受到影响。与PICRUSt分析结果一致，HFD中改变的粪便代谢产物聚集成脂质，如单甘酯（MGs）、脂肪酰胆碱、鞘氨醇、磷脂酸（PAs）等，其中鞘氨醇是一种有效的生物活性代谢物，因为它不仅与宿主代谢稳态密切相关，而且在HFD与TCHO、HDL-C、体重之间也有调节作用。此外，鞘糖脂生物合成途径是鞘氨醇的下游代谢途径，提示粪便微生物可能通过产生鞘氨醇而影响这一途径。此外，发现g. Eubacterium_coprostanoligenes_group与粪便中鞘氨醇水平呈正相关，提示g.Eubacterium_coprostanoligenes_group可能是产生鞘氨醇的直接属。同时，粪便中的g. Eubacterium_coprostanoligenes_group和鞘氨醇在HFD和TCHO、HDL-C、体重之间具有显著的协同调节作用，提示g. Eubacterium_coprostanoligenes_group和鞘氨醇之间的调节关系在维持宿主脂质稳态中起重要作用。

为了验证粪便中的鞘氨醇是否由粪便微生物群产生，本文对小鼠进行了抗生素干预实验。结果表明，粪便微生物群可降低粪便和血清鞘氨醇的丰度。同时，本文还观察到同时喂食HFD和鞘氨醇的小鼠血清TG、TCHO水平明显低于HFD，提示补充鞘氨醇可能是一种改善HFD引起的血脂异常的潜在治疗方法。这一发现得到了其他研究的支持，补充鞘磷脂可以降低血清非高密度脂蛋白胆固醇水平和肝脏中性脂质和胆固醇水平。此外，鞘氨醇的代谢物1-磷酸鞘氨醇（S1P）可以被含ApoM的HDL转运。与S1P在细胞中的争议作用不同，血浆HDL-S1P具有血管保护和抗动脉粥样硬化特性，改善心力衰竭，调节肥胖背景下棕色脂肪组织的活动，并拮抗IL1诱导的细胞凋亡。最近的一份报告还显示，2型糖尿病患者的血清HDL-S1P水平较低。在肠肝循环的基础上，细菌代谢产物进入肝脏，不仅可以将鞘氨醇代谢为S1P，还可以提供转运蛋白HDL。在本研究中，还发现粪便中的鞘氨醇与其血清水平呈正相关，表明g. Eubacterium_coprostanoligenes_group分泌的鞘氨醇可以进入循环系统，进一步调节宿主的脂质稳态。综上所述，HFD可降低g. Eubacterium_coprostanoligenes_group的丰度，下调粪便中的鞘氨醇含量，导致血清鞘氨醇和HDL-S1P水平降低，从而引起血脂异常。

本文的发现扩展了筛选关键粪便属的方法，并为HFD小鼠粪便微生物组与代谢物之间的关系提供了见解。根据综合网络图，确定了两个重要的枢纽属，它们可能通过影响粪便鞘氨醇水平来调节脂质稳态。此外，这项研究还表明，补充鞘氨醇可以显著减轻HFD引起的血脂异常。然而，本研究仍存在一些局限性。首先，虽然本文有理由相信这两个hub属可能会影响脂质代谢，但没有进行它们的移植实验。此外，还应通过动物模型验证g. Eubacterium_coprostanoligenes_group和鞘氨醇对HFD引起的血脂异常的协同调节作用。第三，需要进一步的研究来分析鞘氨醇改善血脂异常的潜在机制，这是实施特定代谢物治疗的先决条件。