科研 | Gastroenterology：通过粪便真菌结合宿主免疫因子来区分艰难梭菌感染患者与无症状携带者

2021-05-10 微生态

肠道真菌菌群靶向生物标记物和免疫因子可能成为区分CDI和Carrier的潜在诊断工具。然而，在这项测试可以用于临床诊断之前，还需要进行更大规模的队列研究，以进一步验证这些发现。

导读

背景：Clostridioides difficile感染（CDI）期间，肠道菌群的作用已经明确，但对真菌群在CDI中的作用知之甚少。本研究中，我们在特征良好的人类队列中通过对真菌菌群数据进行分析，评估了使用肠道真菌菌群特征进行CDI诊断的潜力。

方法：对不同组别（CDI组，n=58；无症状携带者，n=28以及对照组，n=32）的118例住院患者的粪便样本进行采集。基于Illumina HiSeq测序平台对所采集样本的真菌组成进行测定，并进行下游统计分析（包括α多样性分析、差异丰度分析、真菌相关网络分析和分类分析等）。

结果：CDI患者与无症状携带者之间就α和β多样性方面具有显著差异（P<0.05）。基于差异丰度分析，我们在无症状携带者中发现Cladosporium和Aspergillus被富集。CDI患者中Ascomycota与Basidiomycota的比率明显高于无症状携带者和对照组患者（P<0.05）。与较无症状携带者相比，CDI患者的宿主免疫因子与真菌菌群特征的相关性较弱。在随机森林分类中，通过使用4个真菌OTUs和6个宿主免疫标记物，可以很好的区分CDI患者和无症状携带者（AUC~92.38%）。

结论：本研究基于粪便真菌结合宿主免疫因子，为区分CDI患者和无症状携带者提供了新的生物标志物；强调了肠道真菌生物体在CDI中的重要性，但其重要程度可能被低估了。我们需要对这些发现的诊断应用和治疗潜力进行进一步的研究。

论文ID

原名：Fecal Mycobiota Combined with Host Immune Factors Distinguish Clostridioides difficile Infection from Asymptomatic Carriage

译名：通过粪便真菌结合宿主免疫因子来区分艰难梭菌感染患者与无症状携带者

期刊：Gastroenterology

IF：17.373

发表时间：2021.03

通讯作者：Yang-Yu Liu；Xinhua Chen

通讯作者单位：哈佛医学院

试验设计

所有纳入研究的患者均大于18岁。患者入排标准：

1 CDI患者（CDI）：

入组标准：临床粪便核苷酸扩增测定阳性（NAAT阳性）；新发腹泻并决定进行治疗。

排除标准：用于诊断的粪便样本超过72 h；接受CDI治疗超过24 h；接受过结肠造口术。

2 无症状携带者组（Carrier）：

入组标准：入院超过 72h，过去7天至少接受过1尺抗生素治疗；粪便样本采集48 h前无腹泻但NAAT阳性同时未接受过CDI治疗。

排除标准：患者24 h内存在2次及以上粪便松动；接受过结肠造口术；在前7天内接受口服或静脉注射甲硝唑、口服万古霉素、口服利福昔明或口服歧胺霉素24小时以上；在过去6个月内被诊断出CDI；过去7天内，C. difficile检测阴性。

3 空白组

入组标准：无腹泻的患者；经筛选为无症状携带者，但NAAT阴性。

排除标准：7天内服用抗真菌药物的患者。

所有患者根据入排标准进行分组，随后对患者的粪便样本及血清样本进行采集，用于后续分析。

结果

1 研究人群

从Beth Israel Deaconess Medical Center（BIDMC）收集的118例患者的临床队列中前瞻性收集患者粪便样本，根据入排标准，所有患者分别纳入CDI组58例，无症状携带者组28例，对照组32例。一般临床资料而言（性别，年龄，种族），三组受试者无显著差异（P > 0.05）。PERMANOVA分析显示，年龄、性别、种族等临床资料以及队列分组对真菌菌群组成没有显著影响（P > 0.05）。

2 序列数据集的特性

基于真菌ITS2测序，我们共读取到7,418,956条序列，平均每个样本62,344个reads，其平均长度约为383 bp。基于97%相似性，所有序列被分为712个OTUs。这些OTUs分属于6个真菌门、26个纲、74个目、165个科、279个属，此外，我们在种水平上共鉴定出410个OTUs。

3 粪便真菌群落的生态特征

基于Shannon-Wiener曲线分析发现，随着样本读取reads的增加，所有样本中的OTUs数量都趋于平稳，这表明我们获得了足够数量的测序样本读数，满足后续分析要求。Venn图表明，712个OTUs中有128个OTUs在三组之间共享，此外有466个OUTs单独存在于各组别之中。

在OTUs水平上用，基于Chao1指数及Shannon多样性指数，我们对3组患者粪便真菌菌群多样性进行了比较。与Carrier和对照组相比，CDI患者粪便真菌丰富度和多样性显著降低（P < 0.01；图1A和B）。基于Bray-Curtis和未加权UniFrac距离的主坐标分析（PCoA），我们发现，CDI患者粪便真菌组成的离散程度比Carrier的粪便真菌组成的离散更明显。通过配对检验（图1C和D），CDI和Carrier之间的真菌组成有显著差异（P < 0.05）。然而Carrier和对照组之间没有显著差异（P > 0.05；图1C和D）。基于对于各组间β多样性进行比较发现，CDI组的变异性最大，而Carrier组的变异性较小（图1E和F），这表明CDI组患者粪便的真菌组成变化比Carrier组的更显著。

图1 三组患者粪便微生物菌群α多样性，β多样性以及分类分析。A-B代表以Chao1指数（A）和Shannon指数（B）为基础进行的α多样性分析；C-D代表在OTU水平上，基于Bray-Curtis（C）和未加权UniFrac距离（D）对真菌组成进行的主坐标分析（PCoA）；E-F代表基于Bray-Curtis（E）和未加权UniFrac距离（F）所进行的β多样性分析。其中ns代表P > 0.05，*，**，***分别代表P < 0.05，P < 0.01以及P < 0.001。

4 肠道真菌的分类组成

门水平上，Ascomycota、Basidiomycota以及未分类的真菌门占总序列的90%以上，是三组患者粪便样本中的优势类群。属水平上，Saccharomyces，Candida，Nakaseomyces以及Penicillium是主要优势类群（图2）。与Carrier和CDI共享的真菌属相比，Carrier与对照组共享的真菌群落比例更高。通过对丰度最高的30个真菌属进行热图分析，我们同样可以发现，三组患者粪便样本中的真菌群落具有特异性。

图2 三组患者在属水平上的分类特征。

5 Ascomycota与Basidiomycota的比率

先前的研究表明，炎症性肠道疾病患者肠道真菌群处于不健康状态，其表现为Ascomycota与Basidiomycota的比率低于健康人群。因此我们聚焦于我们列队中Ascomycota与Basidiomycota的比率。通过分析发现，CDI患者Ascomycota与Basidiomycota的比率明显高于Carrier（P < 0.05，图3）。这表明，Ascomycota与Basidiomycota的比率可以代表一种真菌生物障碍指数。

图3 三组患者肠道Ascomycota和Basidiomycota的丰度及其比率。A-C分别代表Ascomycota的丰度（A），Basidiomycota的丰度（B）以及Ascomycota和Basidiomycota的比率（C）。ns代表P > 0.05，*，**，***分别代表P < 0.05，P < 0.01以及P < 0.001。

6 真菌差异丰度分析

基于微生物群落分析（ANCOM），我们检测到2个差异丰富的真菌属Aspergillus以及Cladosporium（图4）。在CDI和Carrier之间，检测到2个差异丰富的真菌OTUs（OTU657：Aspergillus proliferans以及OTU252：unclassified_g_Cladosporium，Cladosporidium的一个未分类的OTU）；同样我们在CDI和对照之间检测到3个差异丰富的真菌OTUs（OTU252；OTU584：unclassified_g_Aspergillus和OTU687：Candida dubliniensis）。在Carrier和对照之间没有发现差异的真菌属或OTUs。这些结果表明，差异丰富的真菌属或OTUs可作为区分CDI和Carrier的潜在生物标志物。

图4 对照、Carrier和CDI三组之间真菌丰度差异比较。A-B代表属水平上差异比较，C-F代表OTUs水平上差异比较。ns代表P > 0.05，*代表P < 0.05。

7 真菌相关性网络

为了在网络水平上比较三组患者的真菌群落，基于SparCC，我们构建了每个组别的真菌相关网络。与其他两组相比，CDI组的真菌相关网络结构具有明显的差异。与Carrier相比，CDI组总体真菌相关性表现的较弱（图5）。同时，与Carrier和对照相比，我们还观察到，CDI中一些真菌相关性存在缺失的现象。在三组中，Aspergillus，Cladosporium以及Saccharomyces之间存在正相关关系，而Ascomycota和Basidiomycota表现出很强的负相关关系。

图5 对照（A）、Carrier（B）和CDI（C）三组真菌相关性网络比较。

8 基于宿主免疫标志物和肠道真菌群的CDI分类诊断的准确性

为了说明粪便真菌群和免疫因子的诊断能力，我们通过构建一个随机森林分类来区分CDI和Carrier或对照的差异。采用受试者工作特性曲线下面积（AUC）评价分类效果。在对CDI和携带者的分类中，我们发现OTU486（unclassified_o_Pleosporales）是最主要的特征，其AUC为0.664，而GCSF仍然是最主要的免疫特征，其AUC为0.820（图6A）。对于OTUs（或免疫因子）所设定的最佳标记物，我们发现其AUC值为0.818（或0.8524）。但将真菌OTUs和免疫特征相结合时，达到了更优的效果（AUC值为0.924）。最优组合包括4种真菌OTU（OTU657：Aspergillus_proliferans，OTU35：未分类真菌，OTU252：unclassified_g_Cladosporium，OTU486）和6种免疫标志物（GCSF、IL6、IL8、IL10、TNFα和IL4）（图6C）。在CDI和对照分类中，首位OTU（OTU584：unclassified_g_Aspergillus）、首位免疫特征（GCSF）、最优OTUs特征集、最优免疫因素特征集、最优真菌OTUs和免疫因素组合特征集的平均AUC值分别为0.751、0.857、0.746、0.955和0.950（图6B）。这其中最佳组合特征集由1个真菌OTU（OTU584）和5个免疫标志物（GCSF、TNFα、IL6、IL4和MCP1）组成（图6D）。这些结果表明，基于真菌OTUs和免疫因子组合特征集的随机森林分类模型在区分CDI和Carrier（或对照组）方面具有很强的诊断性能。

图6 基于随机森林模型的分类分析。A，C代表CDI vs. Carrier；B，D代表CDI vs. Control。A和B显示了接收器工作特性（ROC）曲线，C和D显示了排名最高几个特征。

9 血清生物标志物与真菌群特征的相关性

为了揭示肠道真菌菌群和宿主免疫系统之间的相互作用，我们计算了真菌组成（属水平）与宿主免疫标志物循环水平之间的相关性（图7）。总体而言，三组患者肠道真菌属与宿主免疫因子的相关性有很大差异。与CDI相比，Carrier患者肠道真菌属与宿主免疫因子之间存在更强的正相关性。例如，在每一组中，我们聚焦于两个主要的真菌属（Saccharomyces和Aspergillus）与宿主免疫因素的相关性。在CDI组，我们观察到Saccharomyces与IL6、GCSF呈负相关关系。在Carrier组中，Aspergillus与IL1β、IL8与TNFα之间呈正相关关系，Saccharomyces与MCP1之间呈正相关；Saccharomyces与抗毒素B IgA、抗毒素A IgM呈负相关关系。在对照组中，Saccharomyces与IL4呈显著正相关关系。这些结果表明，肠道真菌属与宿主免疫因子的相关性对肠道真菌的定殖/感染状态非常敏感。

图7 对照（A）、Carrier（B）和CDI（C）三组粪便真菌丰度与血清中宿主免疫标志物之间的Spearman相关性分析。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001。

讨论

我们的研究首次报道了基于粪便真菌OTUs和血清免疫标记物的诊断模型用于区分CDI患者和无症状携带者（Carrier），同时该模型表现出强大的诊断潜力。我们发现CDI组真菌的α多样性（丰富度和多样性）和β多样性显著低于Carrier，并且两组在门和属水平上的真菌丰度有显著差异。Ascomycota与Basidiomycota的比率可作为区分CDI与Carrier或对照人群真菌失调的指标。在三个不同的组别中，真菌菌群特征和血清细胞因子之间的显著差异表明宿主系统免疫反应和肠道真菌菌群之间存在相互作用。

健康和患病队列之间的比较突出了类别发现（检测新的疾病亚型）和类别预测（预测个人或群体的疾病亚型）的重要性。先前的研究表明，宿主炎症标志物（包括血清细胞因子、钙保护素和粪便乳铁蛋白）具有诊断的潜力；但这些标志物在CDI中不具有特异性，因此不是最优的生物标志物。本研究中，我们基于最优真菌OTU的分类分析，对于区分CDI和Carrier表现出很强的分类潜力（AUC~0.818）。当我们将肠道真菌OTUs以及宿主免疫标记物整合到一起时，我们确定了CDI的特异性免疫真菌群特征，进一步提高了区分CDI和Carrier的分类性能（AUC~0.924）。我们先前的研究发现，仅血清粒细胞集落刺激因子浓度就可以鉴别CDI和Carrier（AUC~0.842）。因此，肠道真菌OTUS的加入进一步增强了GCSF的鉴别能力。

与Carrier和对照组相比，CDI组患者的粪便真菌丰富度和多样性明显降低。CDI和Carrier之间的β多样性也显著不同，先前基于PCoA的分析同样发现，CDI和非CDI之间存在显著的聚集性。这些结果表明肠道真菌菌群在Carrier和CDI之间发生了明显的转移，提示真菌群落的改变可能在CDI的发病机制中发挥着重要作用。更为丰富的真菌群落多样性或丰富度是肠道真菌菌群相对健康的标志，这同样适用于接受抗生素治疗的患者。

本研究中，Ascomycota和Ascomycota是这三组患者肠道真菌中的两个优势类群，这与以前的研究结果一致。Candida，Saccharomyces，Penicillium，Aspergillus以及Cladosporium是人类胃肠道中最常见的真菌属。与此相一致的，我们的研究发现Saccharomyces和Candida是所有三组患者中的两个优势类群。此外，我们还观察到Ascomycota的丰度与Basidiomycota的丰度呈显著负相关关系。因此，CDI患者Ascomycota与Basidiomycota的比例高于Carrier，这暗示出Ascomycota与Basidiomycota之间的失衡可能与CDI的病理生物学有关，可作为区分CDI和Carrier的生物标志物。

虽然Candida是CDI中含量最丰富的属之一，但其在CDI组和Carrier组之间并未表现出显著差别。这可能是由于Candida内的高度异质性，以及我们所使用的测序方法在物种水平上很难对真菌进行更好的识别。而CDI与Candida定植或疾病的关系已经有所研究。本研究中，我们在CDI组患者中发现Saccharomyces枯竭，这表明Saccharomyces在肠道中具有潜在的有益作用，这与我们之前的研究相一致。此外，在CDI组中，Saccharomyces的丰度与IL6有很强的负相关性。血清IL6浓度与CDI严重程度和死亡率的相关性已有研究进行了阐述，虽然这些相关性的方向性尚不清楚，但有研究表明，Saccharomyces cerevisae能够抑制肠细胞中IL6的转录和翻译。通过ANCOM对真菌分类组成的差异丰度分析，我们在CDI和Carrier（或对照）之间发现了两个差异的真菌属：Aspergillus和Cladosporium。与Carrier（或对照）相比，CDI中Aspergillus和Cladosporium的减少可能表明这些真菌在CDI风险患者中的有益作用。另一项研究表明，与CDI相比，Aspergillus penicillioides在健康个体中的丰度更高；采用粪便微生物菌群移植治疗CDI患者可以恢复该物种的丰富。与CDI相比，Carrier/对照人群中Cladosporium的丰度增加，据我们所知，这也是首次发现。因此，Cladosporium可能会对有CDI风险的患者起到保护作用。网络分析在Carrier/对照组中的真菌丰度具有很强的相关性，但这种相关性在CDI组中是不存在的。此外，CDI组的真菌相关性弱于Carrier对照组。其原因可归因于CDI处于一种生理真菌相关性被破坏的状态。这些相关性的缺失可能反映了菌群免疫串扰可能介导的疾病易感性，但这些相互作用的方向性仍有待进一步研究。

总结

综上，我们描述了C. difficile定植-感染中先前未知的肠道真菌群特征，确定了可能在疾病发病机制中起关键作用的真菌分类单元，同时明确了具有潜在应用价值的诊断特征的特定真菌标记物。肠道真菌菌群靶向生物标记物和免疫因子可能成为区分CDI和Carrier的潜在诊断工具。然而，在这项测试可以用于临床诊断之前，还需要进行更大规模的队列研究，以进一步验证这些发现。通过宏基因组测序对关键真菌属或OTUs进行系统研究，可能会进一步提高这些标记对CDI的诊断价值。尽管如此，还需要进一步开发一种比真菌生物群测序更简单、更便宜的方法。