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科研 | mBio：靶向哺乳动物聚糖增强噬菌体在胃肠道的捕食作用

2021

05/08

微生态

A-

A+

侵袭性病原菌或微生物能够引起疾病可以居住在我们胃肠道粘膜上皮的深处。

编译：微科盟弈轩，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载。

导读

人类胃肠道粘膜表面由真核细胞上皮、原核微生物群和分隔它们的富含碳水化合物的界面组成。在胃肠道中，噬菌体与其原核宿主的相互作用影响着宿主的健康，尤其是侵入性病原菌的定植。抗生素可以使用，但它们也会杀死保护性共生体。本研究报告了一种新的噬菌体，其裂解周期在肠道环境中增强。尾纤维基因的蛋白产物结合人硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，并将噬菌体定位于上皮细胞表面，它将噬菌体定位在其细菌宿主附近，这是一种定位靶向机制。靶向治疗可用于选择性地清除胃肠道的侵袭性病原体，防止疾病的发展，这一发现为发展黏膜靶向噬菌体以选择性去除黏膜表面的侵袭性病原菌提供了前景。

论文ID

原名：Targeting of Mammalian Glycans Enhances Phage Predation in the Gastrointestinal Tract

译名：靶向哺乳动物聚糖增强噬菌体在胃肠道的捕食作用

期刊：mBio

IF：6.784

发表时间：2021.02.09

通讯作者：Sabrina I. Green

通讯作者单位：美国德克萨斯州休斯顿贝勒医学院分子病毒学与微生物学系

实验设计

本研究采用细菌菌株和噬菌体ExPEC ST131分离物JJ1901用于所有实验感染小鼠模型，模型分别为混合感染年龄（6至10个月）和性别的BALB/c小鼠。且在感染之前，所有菌株在37°C条件下从LB琼脂平板上划线的单个菌落过夜生长。首先进行定植实验，小鼠经口灌胃接受10⁹ CFU剂量的ExPEC菌株JJ1901，对氯霉素耐药菌株JJ1901进行匀浆、选择性平板接种于含氯霉素的LB琼脂平板上并进行菌落计数后，测定细菌定植（粪便和肠道）。采用改良的盲肠试验，将刚安乐死小鼠的盲肠内容物汇集在无菌的0.09% NaCl溶液中，以1:5的稀释度（毫克每毫升）均匀化后离心，以10的感染倍数对上清液进行4.5小时噬菌体杀灭试验。对于粘蛋白测定，使用在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中稀释的不同浓度的猪胃粘蛋白II型，将溶粘液药物N-乙酰半胱氨酸稀释于PBS中进行解粘液试验。使用在平板上从不同菌落独立生长的中对数期培养物以表征噬菌体ES17和HP3，吸附速率常数（Ks）由吸附曲线斜率与细菌浓度的自然对数确定，每5分钟取一次时间点，获取粘蛋白涂层的吸附与纯化图像。进一步进行粘蛋白结合酶联免疫吸附试验化验和HIEM感染与成像。使用蔡司LSM 510共焦显微镜拍摄图像。使用FIJI软件（版本2.0.0）对所呈现的图像进行亮度和对比度的均匀调整。使用PRISM 8软件进行数据分析。使用ATIMA（锐利微生物分析敏捷工具箱）分析微生物组16S数据。

结果

1 小鼠模型的噬菌体作用下的胃肠道治疗结果

由于人类胃肠道是ExPECST131的主要贮存器，我们想知道噬菌体HP3是否可以预防性地减少或消除ExPEC在肠道中的负荷。为了验证这一点，用ExPECST131临床分离物JJ1901（先前用于上述菌血症研究的小鼠模型）经口灌胃给小鼠，然后用噬菌体或抗生素治疗，如图1A所示。未经治疗的小鼠在实验过程中（6天）保持稳定的细菌定植（图1B）。当噬菌体HP3通过水或每日灌胃给动物，实验结束时，ExPEC的水平与未经处理的对照组的水平无法区分。CFU在第2天出现上升；然而，所有组在第3天趋于平稳，直到实验结束。抗生素治疗组在任何时间点均未检测到ExPEC。有趣的是，噬菌体HP3被检测并具有活性，通过噬菌斑测定法将噬菌体处理过的小鼠的粪便铺在ExPEC细菌的覆盖层上，甚至在第4天，这表明缺乏ExPEC还原并不是由于缺乏向肠道环境或噬菌体失活（请参见补充材料中的图S1A）。还应注意的是，尽管在第1至4天灌胃时噬菌体水平较高，但噬菌体在去除ExPEC方面并不比水中给予的噬菌体更有效，这表明在本实验中，噬菌体没有剂量依赖性效应。此外，在研究的最后一天，即第6天，在小鼠肠道组织（包括盲肠和结肠）中发现多达10⁵个PFU/g噬菌体，但与未治疗对照组的这些组织相比，几乎没有清除ExPEC（图1C和D）。重要的是，抗生素处理显著减少了操作分类单元（OTU）的数量和多样性，这是由考虑物种丰富度和分布的Shannon多样性指数确定的（图S1B和C）（P=0.007，P=0.009）。此外，β多样性的主成分分析（PCA）表明，抗生素组群中的小鼠聚集在一起，远离未治疗组和噬菌体组，表明抗生素对微生物组群的影响比噬菌体更深远（图S1D）。最后，我们评估了噬菌体在改良的“盲肠培养基”（CM）中的杀伤作用，该培养基来源于最近安乐死小鼠的盲肠内容物。这些盲肠内容物在无菌生理盐水中混合和均质，然后离心以去除大颗粒。这种培养基的设计是为了模拟哺乳动物肠腔的复杂性，因为它含有粪便物质、微生物组、粘液以及肠腔中可能存在的许多小分子和蛋白质（图S1E）。尽管噬菌体HP3在LB中完全消除了EXPC（水平下降了近9个对数，没有可检测到的活细菌），并且在取自同一小鼠宿主的粪便颗粒的浆液中几乎消除了EXPC（水平下降了8个对数），但在CM中几乎没有噬菌体基于的杀灭，尽管回收了近10⁶到10^7.5PFU/ml的噬菌体（图1E和F）。这些结果反映了ExPEC定植模型的结果，并表明哺乳动物GI中存在抑制这种裂解噬菌体的因子。

图1 小鼠模型的噬菌体作用下的胃肠道治疗结果。（A）在第0天用10⁹ CFU的ExPEC JJ1901灌胃小鼠，然后通过在选择性培养基（LB+氯霉素）上接种菌落计数的粪便颗粒来监测其定植情况，检测CFU水平或PFU水平（菌斑试验）；（B）实验动物的肠道（粪便）定植试验；（C）肠组织和内容物的噬菌体水平;（D）肠组织和内容物的水平；（E）4.5 h后的ExPEC水平生长情况；（F）4.5 h后噬菌体HP3的PFU计数在不同培养基中生长的时间。

图S1（A）肠道（粪便）噬菌体定植；(B）第6天粪便颗粒16srDNA分析的OTU；(C）Shannon多样性指数；(D）未加权Unifrac主坐标分析（PCoA）图显示β多样性；(E）离体盲肠模型。

2 抑制成分是粘蛋白

我们希望了解噬菌体HP3在肠道微环境中无效的原因。接下来我们测试了这种抑制作用是否与CM中存在活的细菌微生物群有关。然而，噬菌体对EXEC的杀灭并没有随着多种抗生素（包括蛋白质合成抑制剂、细胞壁抑制剂和DNA合成抑制剂）去除微生物群而增强（见图S2A和B）。（注意，抗生素有效地杀死了一个共生的、对抗生素敏感的大肠杆菌，该大肠杆菌被注入CM（图S2C））。对于抑制因子可能没有任何解决方法，本研究决定测试更激烈的治疗方法以恢复其在CM中杀死噬菌体的能力。首先，对CM进行热处理（HT CM）（图2A）。有趣的是，热处理使噬菌体HP3对EXEC的杀灭率提高了6倍以上（P<0.0001）。类似地，当CM被过滤处理（0.22 μm过滤）（FT-CM）时，在用噬菌体HP3处理后的培养基中没有可检测到的ExPEC水平（图2A），并且这一观察延伸到另一个在CM中显示抑制的噬菌体EC1（图S2D）（P<0.0001）。因此，抑制成分很大（保留在0.22 μm的过滤器上）并且对沸腾敏感。

我们认为肠道粘蛋白可能具有这种特性，因为它们具有高度的缔合性和粘性（在过滤器上捕获），并且作为蛋白质，它们对热敏感。粘蛋白是在整个胃肠系统中发现的糖蛋白，在肠上皮细胞（IECs）和共生或致病微生物群之间形成一层。此外，它们还可以作为微生物受体（30）发挥作用。为了测试粘蛋白是否抑制噬菌体杀死细菌，我们设计了另一种方法，即通过高速离心将CM分离成可溶性（S CM）和不溶性（INS CM）形式（图2B）。我们假设INS CM将包含粘蛋白，因为大肠粘蛋白通常存在于该部分中，并具有抑制噬菌体的作用，而S CM不具有这些特性。实际上，未处理的CM或INS CM中的噬菌体杀灭作用比S CM中的噬菌体杀伤作用受到更大的抑制（图2B）。为了更直接地检验粘蛋白是抑制因子的假设，将粘液溶解药物N-乙酰半胱氨酸（NAC）添加到INS CM，并将猪胃粘蛋白（1.5％[wt/vol]）添加到S CM。确实，在加入NAC后，在INS CM中观察到ExPEC噬菌体杀伤量降低了5个对数，这也使杀伤力比S CM更高（P <0.0001）。而更令人信服的是，在S CM中添加粘蛋白可以消除噬菌体对细菌的杀灭作用，使其达到最初仅在CM中观察到的水平（不显著，P =0.970）。这些结果表明在盲肠培养基中噬菌体杀伤的抑制剂是肠粘蛋白。

沿着这些思路，已知大肠杆菌使用粘蛋白作为碳源。我们认为，定植有ExPEC的鼠类宿主在NAC处理后可能会提高，这是因为该药物释放了粘蛋白以供细菌消耗，因此可以作为系统来测试黏蛋白聚集的减少是否会增强噬菌体HP3杀死ExPEC的能力。用NAC治疗2周后，小鼠小肠中的ExPEC水平升高，而噬菌体HP3降低了ExPEC水平，尽管这并不显著（图S2E和F）。在大肠中也观察到了类似的趋势（图S2G）。与小肠相比，大肠中较不明显的作用可能是由于粘液的厚度，因此NAC分解这种粘液的可能性较低。此外，已知NAC在小肠组织中被迅速吸收，从而在远端大肠中失去其作用。

图2 抑制成分研究过程。(A）盲肠培养基（HT CM）制备过程及其测定；（B）盲肠培养基（NS CM）制备过程及其测定；（C）噬菌体在粘蛋白（1.5%[wt/vol]inLB）中进行4.5小时分析筛选后的ExPEC水平。

图S2（A）4.5小时后的ExPEC水平。该噬菌体与或不含抗生素氯霉素或（B）氨苄西林钠盐（AMP，100微克/毫升）或环丙沙星孵育(C）情况；(D）上述盲肠试验后大肠杆菌ECN（抗生素敏感）水平盲肠培养基制备后的ExPEC水平；(E）小鼠每天灌胃N-乙酰半胱氨酸2周实验方案过程；(F）小肠（组织和内容物）排出噬菌体计数和ExPEC计数；(G）大肠（组织和内容物）排出水平；(H）不同检测时期的ExPEC水平；（J）ExPEC水平的噬菌体进行试验筛选。

3 粘蛋白增强的噬菌体的发现

鉴于人类污水或动物的粪便中可能含有已经进化为靶向高粘蛋白环境（例如肠道）的宿主的噬菌体，我们筛选了噬菌体文库和最近从这些环境中分离出来的其他噬菌体（表1），以提高含1.5％粘蛋白的LB的活性（图2C）。该浓度与阻止噬菌体HP3在可溶性盲肠培养基中的活性的浓度相同，并且显示出在LB中对高达8 h的强抑制作用（图S2H）。出乎意料的是，只有一个噬菌体（称为噬菌体ES17）显著减少了LB粘蛋白培养基中的细菌（图2C）（P <0.0001，约1 log）。噬菌体ES17在黏蛋白中具有活性，尽管其效率（> 3 log）远低于噬菌体HP3，J2W，Ult1，Shp1或M1S，后者仅在LB培养基中就将ExPEC完全杀死至无法检测的水平（图S2I）。与这些数据一致，当粘蛋白的量从0％变为2％并比较噬菌体HP3和ES17对ExPEC的裂解活性时，噬菌体HP3非常有效，因为粘蛋白的浓度降低至<0.5％，但被完全抑制在更高的水平（图S2J）。但是，噬菌体ES17在HP3失活（0.5％至1％粘蛋白）的浓度下最有效，而在低于或高于此范围的浓度下活性最低。综上所述，这些数据表明噬菌体ES17具有独特的特性，可促进其在粘蛋白存在下有效裂解的能力。

噬菌体ES17是一种C3型噬菌体，其活性被粘蛋白增强。我们试图了解噬菌体ES17增强在粘蛋白中发现和裂解其细菌宿主的能力的分子机制。噬菌体ES17被确定为双链（dsDNA）病毒，属于Caudovirales目，Podoviridae科，Kuravirus属。另一种库拉病毒噬菌体PhiEco32与ES17具有相似的遗传相似性（见图S3A）。库拉病毒噬菌体具有延长的C3型衣壳，不常见的形态，短尾纤维和小的基因组。ES17具有这些相似的形态特征（衣壳> 100 nm）（图3A）。ES17具有75,007 bp的小基因组大小，带有123个预测的开放阅读框（ORF）（MN508615）（图S3B）。

图3 噬菌体ES17是一种对粘蛋白有亲和力的C3型噬菌体。(A）噬菌体ES17的透射电子显微镜（TEM）图像；(B）将粘蛋白添加到EXEC培养物中的构建过程；（C）吸附噬菌体ES17；(D）吸附噬菌体HP3；(E）1.5%粘蛋白包被孔ELISA。

为了确定该噬菌体为何与在富含粘蛋白的环境中缺乏活性的其他噬菌体不同的原因，我们检测了噬菌体ES17和HP3吸附到其大肠杆菌宿主中的能力。以前的研究数据显示，98%的HP3在10分钟内被吸附，而ES17在这段时间内仅被吸附32%。此外，根据一步生长曲线参数确定的ES17与HP3之间没有重大差异，例如突变程度（ES17，36；HP3，60）或潜伏期（ES17，32 min；HP3，22.5 min）。我们想知道粘蛋白的添加是否可以改善噬菌体ES17的吸附并抑制噬菌体HP3的吸附。本实验采用改良的吸附法，使用ExPEC和粘蛋白。简而言之，将细菌在不同浓度的粘蛋白（0％至1.5％）中温育，沉淀并洗涤以去除任何未粘附在细菌表面的粘蛋白（图3B）。接下来，用噬菌体ES17和HP3进行标准吸附测定。有趣的是，在不存在粘蛋白的情况下，噬菌体ES17在10分钟内没有吸附到ExPEC。但是，如果首先与1.5％粘蛋白一起孵育，则吸附率将提高到98％（图3C）。相反，在没有粘蛋白的情况下，98％的噬菌体HP3被吸附，在其存在下，吸附降至84％（图3D）。最后，我们采用类似酶联免疫吸附试验（ELISA）的方法来确定噬菌体ES17是否倾向于与粘蛋白包被的表面结合，这一假设与我们的数据一致。实际上，当粘蛋白与ELISA板结合时，噬菌体ES17与粘蛋白表面的结合水平要高于噬菌体HP3（图3E）（P = 0.041和P = 0.002）。综上所述，使用这些不同的方法，数据表明噬菌体ES17与粘蛋白结合，该特性可以增强其在富含粘蛋白的环境中感染大肠杆菌的能力。

4 噬菌体ES17结合人硫酸乙酰肝素蛋白聚糖

相对于其他大肠杆菌噬菌体，噬菌体ES17具有增强的能力，可在碳水化合物为主要化学成分的环境中找到其细菌宿主（例如盲肠培养基和富含粘蛋白的肉汤）。根据BLAST分析，ES17的假定尾纤维蛋白（ES17-TFP）与另一种裂解性噬菌体T7样噬菌体LM33_P1（YP_009324518.1）的尾纤维蛋白显示出高度相似性（相似度为64％；E值为0），它也靶向ST131菌株（见图S4A）。T7样噬菌体尾纤维已被证明具有针对表面糖（如形成胶囊的多糖）的内切酶。BLAST分析显示ES17-TFP含有假定的果胶酯酶（E值，7.45e-03；369 bp）。仅在其他四个噬菌体myPSH1131，myPSH2311，vB_EcoS_Golestand和LM33_P1中发现该结构域，其中只有myPSH1131与ES17具有相同的尾纤维蛋白（图S4B）。

建模的ES17-TFP的结构分析显示与噬菌体K5裂解酶结合域高度相似（E值= 4e-12）。ES17-TFP（蓝色）和K5裂合酶（红色）的预测结构如图S4C（PDB 2X3H）所示，相同的残基为黄色。噬菌体K5结合K5荚膜多糖，并充当K5多糖裂解酶。K5大肠杆菌胶囊由重复的二糖制成，该二糖与肝素和硫酸乙酰肝素（HS）的前体相同，后者是糖胺聚糖（硫酸乙酰肝素蛋白聚糖[HSPGs]）中存在的线性多糖（图S4D）。这些蛋白聚糖存在于哺乳动物细胞和粘液中。此外，肠中存在与硫酸乙酰肝素/肝素类似结构的粘蛋白（α-连接的GlcNAc或N-乙酰基-d-葡萄糖胺），并在猪胃粘蛋白（PGM）中发现。

我们推断ES17的活性增强可能是由于能够结合糖蛋白上发现的哺乳动物多糖，正如其他群体发现的噬菌体类型不同。然而，这些研究小组中没有一个将硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，存在于各种细胞类型的基底膜和表面上的普遍存在的糖蛋白鉴定为这种相互作用的可能受体。利用这种机制，噬菌体可以定位于其宿主，从而解释了其在富含粘蛋白的环境中的增强活性。我们希望进一步扩展这些观察结果，并明确指出可能介导假设活动的确切碳水化合物类型。为了验证这一想法，我们克隆并纯化了ES17-TFP（图S4E），并评估了纯化的ES17-TFP与包含来自猪胃粘蛋白（PGM），糖胺聚糖（超过860个独特聚糖结构）的聚糖阵列结合的能力，糖胺聚糖（GAGs）和由功能糖组学联合会（CFG）产生的各种合成和天然来源的聚糖（文本S1）。对于各种各样的哺乳动物聚糖，包括从猪胃粘蛋白中纯化得到的聚糖，没有观察到非常低的相对荧光单位（RFU），它是结合的代表（图S4Fi至ii）。然而，令人惊讶的是，观察到与含硫酸乙酰肝素的GAGs结合的RFU增加了几个数量级（RFU> 2,000），但结构相似的GAG透明质酸1号至20号或硫酸软骨素21号至63号（图S4Fiii）没有增加。纯化的ES17-TFP结合人硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的发现为解释为什么噬菌体ES17在肠道环境中显示出增强的活性提供了可能的机制。

人肠小肠（HIE）是器官型高阶培养物，已作为模拟人小肠的代用品而流行。它们可以生长为具有内腔和隐窝/绒毛轴的三维结构，也可以生长为促进宿主与病原体相互作用的2维单层。这些培养物也是有用的，因为它们表达人肠中发现的多种聚糖，包括粘蛋白和蛋白聚糖。在高Wnt培养基中分化5 d天后，从结肠干细胞中分离出人肠类单层（HIEMs）。将噬菌体ES17或HP3加入融合的HIEM中1小时，充分洗涤，并使用针对每种噬菌体的抗体通过免疫荧光显微镜观察。在HIEMs肠上皮细胞（IEC）的表面上几乎没有观察到可检测到的噬菌体HP3，但是当HP3单独固定在载玻片上时，抗体产生针对噬菌体的强大信号和特异性（图4A和S4G）。噬菌体ES17（绿色）在顶侧与IEC均匀结合，包括观察到突出的Muc2（红色）定位的区域，也包括在没有Muc2染色的区域（图4Aii）。为了确定噬菌体ES17是否通过硫酸乙酰肝素与HIEMs的IEC结合，我们用肝素酶III对HIEMs进行了预处理，以酶促方式去除了HSPG，然后评估了噬菌体的结合。实际上，用肝素酶处理的HIEMs在质和量上均显著降低了结合的ES17的水平（图4Bi至vii）（P<0.0001）。该发现与特异性结合HSPG的纯化的尾纤维蛋白一致。ES17在粘液层和IEC表面的定位是通过与HSPG结合而实现的，HSPG可能会将噬菌体定位在在肠道微环境中找到其细菌靶标所需的确切位置。为了证明与HIEM结合的ES17仍然可以感染细菌，我们利用了引起腹泻的病原性肠聚合性大肠杆菌（EAEC），它与ExPEC一样以网状聚集模式牢固地粘附于HIEM。在本实验中，我们用噬菌体ES17预包被HIEMs，如上所述洗涤它们，然后用EAEC菌株042感染它们。如前所述，用Giemsa-Wright染色法固定HIEMs，观察细胞和细菌。感染的HIEMs对具有聚集表型的细胞表现出强大的细菌粘附性（图S4Hii，红色箭头）。然而，噬菌体包被的HIEMs在类器官表面显示出显著降低的EAEC（图S4Hiii和iv）（P =0.007），表明结合的ES17仍对这种重要的形成生物膜的病原体具有传染性。

图4 ES17与人肠类上皮细胞（HIEMs）表面结合示意图。(A）ES17与人肠类上皮细胞（HIEMs）表面结合的染色示意图；未添加噬菌体（i）、添加噬菌体ES17（ii）和添加噬菌体HP3（iii）；(B）肝素酶III与或不与上述噬菌体一起培养：未添加噬菌体（i和ii）、添加噬菌体ES17（iii）、添加噬菌体HP3（iv）、与ES17（v）孵育的Hep iii处理的HIEMs以及与HP3（vi）孵育的Hep iii处理的HIEMs。

图S4（A）ES17-TFP和噬菌体LM33的BLAST比较分析；(B）ES17-TFP果胶酯酶结构域的blast分析；(C）结构显示预测的TFP尾纤维蛋白结构（蓝色）和K5裂解酶结构（红色）；（D）肝素散或K5胶囊及硫酸乙酰肝素衍生物的结构；(E）蛋白质SDS-PAGE凝胶显示纯化的ES-TFP混合洗脱液和基准蛋白阶梯；(Fi）使用纯化ES17-TFP作为GBP（聚糖结合蛋白）的相对荧光单位（RFU）对来自纯化猪胃粘蛋白的138个聚糖进行聚糖微阵列分析。（Fii）使用TFP作为GBP对来自功能性糖组学联合体的560个定义的聚糖进行聚糖阵列分析(图ii）使用TFP作为GBP，对170个带电荷的糖胺聚糖（GAG）进行聚糖阵列分析；HIEMs（i）未感染或（ii）感染EAEC 042（iii）或在EAEC之前用噬菌体ES17预处理。

5 噬菌体ES17杀死哺乳动物肠道中的ExPE

本研究发现噬菌体ES17在粘蛋白存在下显示出增强的裂解活性，这是在富含粘蛋白的模拟腔环境中筛选的几种噬菌体中最好的，并且通过HSPGs结合人类器官型培养物iec促使对该噬菌体是否能够克服肠道诱导的噬菌体裂解活性对HP3噬菌体定植实验的抑制作用。我们首先测试了ES17在盲肠培养基中是否有效。事实上，与噬菌体HP3相比，噬菌体ES17在这种环境中的EXEC去除率提高了2.5 log（图5A）（P<0.0001）。在此实验中，对OTU的数量或Shannon多样性指数没有影响，表明噬菌体ES17在仅去除目标ExPEC菌株时具有高度选择性（见图S5A和B）。接下来我们在鼠肠中测试了噬菌体ES17对ExPEC的作用。如图1A所示，用ExPEC定植动物，并用噬菌体ES17或HP3处理（图5B）。噬菌体的剂量也从10⁹PFU增加到10¹⁰PFU，以评估是否提供更多的噬菌体会提高HP3降低ExPEC的能力，尤其是在更近端的区域，因为噬菌体会在消化道中缓慢移动。在第6天对小肠和大肠的检查表明，所有组中的噬菌体水平都很高（10⁶至10⁸PFU/g肠组织）（图5C）。用噬菌体HP3处理的动物在小肠组织中没有可检测到的CFU（图5D），但与盲肠未处理对照的水平却没有区别。肠道中这种减少和噬菌体水平的提高可能是由于与图1所用的剂量（10⁹PFU）相比，给予动物的每日噬菌体剂量（10¹⁰PFU）的对数增加。相比之下，每只用噬菌体ES17处理的动物，无论是小肠还是大肠，都没有可检测到的ExPEC水平，这表明这种裂解性噬菌体具有在复杂的粘膜环境（例如大肠）中靶向ExPEC的独特能力。

图5 噬菌体ES17在哺乳动物肠道中死亡。(A）在盲肠培养基或LB中进行4.5小时生长试验后的ExPEC水平；(B）小鼠于第0天用109 CFU的ExPECJJ1901灌胃过程；(C）菌斑分析肠道（组织）内容物噬菌体水平；(D）肠（组织）和内容物排出水平。

图S5（A）与噬菌体ES17孵育后盲肠培养基的16SrDNA分析的OTU；(B）与噬菌体ES17孵育后盲肠培养基的Shannon多样性指数。

讨论

所有抗生素的一个限制是它们具有广泛的杀灭活性，并且在复杂的人体环境（包括人体血液、尿液或全身粘膜表面）中没有良好功能的固有特征。特别是，胃肠道（GIT）是一个高度复杂的系统，由多种器官和组织组成，其中包括多种细胞类型。在粘膜表面发现的某些细胞和因子可能会影响肠的能力，包括肠上皮细胞、肠内分泌细胞、干细胞、分泌粘液的杯状细胞、抗菌肽（AMPs；来自Paneth细胞）和分泌性免疫球蛋白A。更复杂的是，GIT被大量微生物定居，其中包括古细菌，真菌，原生生物和与宿主共同进化的细菌，称为人类肠道微生物群。噬菌体必须通过这个复杂的生态系统找到并感染宿主。由于估计GIT中已经存在超过10¹⁰PFU/g的噬菌体，因此这表明噬菌体可以在这种环境中繁衍生息。由于估计GIT中已经存在超过10¹⁰PFU/g的噬菌体，因此这表明噬菌体可以在这种环境中繁衍生息。我们的结果表明：（i）在体外对大肠杆菌ST131有溶解作用的噬菌体HP3，在小鼠败血症模型中非常有效地消除菌血症，但在小鼠肠道中进行相同性质的测试时，其无效；（ii）抑制作用是由肠粘蛋白引起的，（iii）设计用于模拟管腔环境的培养基可用于鉴定在这种环境中具有增强的水解活性的噬菌体，并且（iv）从人类废水中分离的荚病毒噬菌体克服了这种抑制活性，因为噬菌体结合存在于粘液中或固定化的肝素硫酸化蛋白聚糖的能力增强在肠上皮细胞表面，这很可能驱动噬菌体定位靶向宿主细菌的确切生态位。此外，我们的数据显示，与抗生素治疗相比，这种治疗并没有改变肠道微生物群的多样性。综上所述，这些数据表明了噬菌体捕食的一种新机制，该机制对于杀死肠道环境中的细菌可能非常有用。

尚未研究潜在的狭窄或有限的噬菌体生态范围，而不是其狭窄的宿主范围能力。通过一个实验过程的消除，我们确定粘蛋白可以极大地抑制噬菌体感染。粘蛋白由丝氨酸和苏氨酸的串联重复序列组成，它们充当o-连接聚糖（N-乙酰半乳糖胺，N-乙酰氨基葡萄糖，岩藻糖，半乳糖和唾液酸）的附着位点。构成粘液肠层的形成凝胶的粘蛋白是通过二硫键连接的粘蛋白的大分子聚合物（最高40 MDa）。当我们将噬菌体与猪胃粘蛋白（由形成凝胶的粘蛋白MUC 5AC组成）一起孵育时，发现细菌的杀伤力降低或没有。但是，当我们添加N-乙酰半胱氨酸（NAC）时，它会通过减少将这些粘蛋白聚合物保持在一起的二硫键发挥粘液溶解作用，从而恢复了细菌杀灭作用。NAC是一种经过测试并在临床上用于治疗包括囊性纤维化（CF）和慢性阻塞性肺疾病（COPD）在内的综合症的药物。在这两种情况下，它会使肺部的黏液变松，但由于它的抗氧化作用，它也可以作为对乙酰氨基酚过量的一种治疗方法。也许这种药物也可以用作噬菌体的佐剂，以帮助治疗在富含粘蛋白的生态系统（如CF患者的肠道或肺部）中被细菌感染的患者。我们在小鼠中测试了口服NAC治疗，发现它在改善小肠中噬菌体介导的细菌杀伤上比在大肠中更有效。NAC已显示仅在60分钟后口服即可迅速吸收。口服NAC的半衰期短，为2.5 h，肠内生物利用度为10％。NAC可能没有对远端大肠产生粘液溶解作用。有趣的是，我们观察到采用NAC治疗的肠组织中ExPEC水平升高。某些病原体例ExPEC可能在黏液层减少的环境中繁殖。

另一种不同于用NAC修饰噬菌体的可能性是，寻找已进化出表型的噬菌体，这些表型可增强它们在特定生态系统（如GIT）中与细菌宿主相遇的能力。噬菌体ES17最初是从人类污水中分离出来的，属于荚膜病毒科，具有类似C3的细长衣壳形态和桨状短尾纤维。与噬菌体HP3相比，噬菌体ES17在盲肠培养基（CM）和小鼠肠道定植模型中显示出显著的杀灭效果。噬菌体ES17与粘蛋白的结合效果明显好，与粘蛋白混合的细菌增加了噬菌体的吸附。这个概念有优先权。噬菌体粘附粘液（BAM）模型提出噬菌体通过hoc蛋白或类似于T4的噬菌体衣壳蛋白上的Ig（免疫球蛋白折叠样）结构域与粘液结合。这一机制被认为是为了解释噬菌体如何结合到后生动物粘膜表面，并增加遇到细菌宿主的可能性，可能是通过一种独特的受控扩散增加与细菌靶的虚假相互作用。这些研究表明，在10分钟（45分钟）内，有粘蛋白存在时，噬菌体对T4的吸附率从65%增加到80%。在有粘蛋白存在的情况下，噬菌体ES17的吸附变化是全部或没有，在10分钟内从0%到98%。这表明粘蛋白可能是噬菌体ES17的一种“桥受体”，因为这种噬菌体在没有粘蛋白的情况下，甚至在非常高的噬菌体水平下，也不能起到杀灭作用。在大肠杆菌嵌入粘蛋白基质的情况下，这种模型是有意义的，可能会分解粘蛋白作为碳源，从而将其结合，从而使噬菌体能够使荚膜多糖结合机制适应蛋白多糖上突出的结构相关糖。

与用NAC终止噬菌体不同，另一种可能性是寻找具有进化表型的噬菌体，这些表型增强了它们在特定生态系统（如GIT）中与细菌宿主的接触能力。噬菌体ES17最初是从人类污水中分离出来的，是Podoviridae的一员，具有C3状伸长的衣壳形态，带有桨状短尾纤维。与噬菌体HP3相比，噬菌体ES17在盲肠培养基（CM）和小鼠肠道菌落模型中显示出显著的杀伤作用。噬菌体ES17与黏蛋白的结合明显更好，并且将细菌与黏蛋白混合可增加噬菌体的吸附。这个概念优先。噬菌体黏附（BAM）模型提出，噬菌体通过存在于类似于T4的噬菌体衣壳蛋白上的hoc蛋白或Ig（免疫球蛋白折叠样）结构域与黏液结合。建议通过这种机制来解释噬菌体如何与后生动物粘膜表面结合并增加其与细菌宿主接触的可能性，这可能是通过独特类型的受控扩散来增加的，该扩散增加了与其细菌靶标的杂散相互作用。这些研究表明，在粘蛋白存在下，在10分钟内，T4吸附从噬菌体吸收的65％增加到80％。在存在粘蛋白的情况下，噬菌体ES17的吸附变化全部或全部消失，在10分钟内从0％到98％。这表明粘蛋白可能是噬菌体ES17的“桥受体”类型，因为这种噬菌体在不存在粘蛋白的情况下，即使在非常高的噬菌体水平下也无法杀死。这样的模型在埋入粘蛋白基质中的大肠杆菌中可能是有意义的，也许会将粘蛋白分解为碳源并因此将其结合，从而使噬菌体将荚膜多糖结合机制适应结构相关的糖。在蛋白聚糖上突出。

噬菌体已显示在尾巴纤维上存在多种碳水化合物结合蛋白，以结合细菌细胞表面上存在的不同糖类。其中最多样化的是荚膜解聚酶，其结合并分解细菌分泌的荚膜碳水化合物。由于细菌荚膜类型的多样性，这些荚膜解聚酶具有多样性。胶囊类型已被证明可模仿肠道系统的某些成分，包括粘液层中的糖。细菌可以利用这些机制来破坏免疫系统并允许宿主的定植。噬菌体ES17在尾纤维蛋白中含有一个推测的荚膜解聚酶结构域。然而，我们只能检测到与人体肠道糖类的相互作用，即糖胺聚糖-硫酸乙酰肝素。这表明噬菌体ES17通过与哺乳动物糖类结合而适应粘膜环境。硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）在多种细胞表面表达，并在肠上皮细胞表面显著表达。其中一个更吸引人的发现是，来源于结肠干细胞的人类类肠杆菌特异性结合了噬菌体ES17，而不是另一种大肠杆菌噬菌体HP3。HSPG由硫酸化多糖的重复单元-硫酸乙酰肝素（HS）组成。HS是一种线性多糖，起始于前体肝素（α1,4-连接的N-乙酰氨基葡萄糖[GlcNAc]和β1,4-连接的葡萄糖醛酸[GlcUA]的双糖）。随后由于硫酸化和差向异构化而产生的修饰导致形成成熟形式的多糖HS。噬菌体K5利用尾穗裂合酶（KflA）结合并降解大肠杆菌菌株上的K5胶囊。由于K5胶囊多糖已被证明在结构上与硫酸乙酰肝素前体乙酰肝素相同，因此该酶也可以起肝素酶的作用。K5肝素裂解酶可切断N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸的连接，但被硫酸化区域抑制。进一步的同源性搜索表明，在ES17-TFP中发现的碳水化合物结合域在结构上与噬菌体K5尾穗中存在的结合域同源。考虑到肝素酶III与K5裂解酶结合和降解的区域相同，ES17-TFP可能利用相同的受体。事实上，从土壤细菌肝素黄杆菌中添加肝素酶III，其特异性切割HS的未修饰（未硫酸化）NAC结构域（GlcNAc-GlcUA）和NA/NS结构域（GlcNS[N-磺基-d-葡萄糖胺]和GlcNAc），导致噬菌体ES17与细胞的结合被废除，这意味着ES17对这种类型的聚糖具有高度特异性。粘蛋白和硫酸乙酰肝素（Ⅲ类α-连接的GlcNAc）的结构相似性表明，该蛋白也可能靶向这些肠粘蛋白。这种相互作用是由噬菌体ES17的尾纤维蛋白驱动的，与hoc蛋白无关，也不包含BAM模型预测的Ig样折叠。因此，噬菌体ES17似乎使用了一种新的机制，不仅定位于富含粘蛋白的表面，而且还直接定位于哺乳动物的上皮表面（图6）。然而，本研究的一个局限性在于，我们没有确定噬菌体ES17在其尾部纤维与粘蛋白或硫酸乙酰肝素结合后，如何与细胞表面的受体结合。我们推测ES17可以修饰这些聚糖，从而到达这些表面受体并吸附到EXEC上。

然而，这种上皮结合能力使噬菌体能够到达粘膜表面深处可能存在细菌庇护所的区域。几种病原体，包括细菌和人类致病性病毒，已被证明与HS结合并将其用作受体。值得注意的是，在这一发现的同时，我们的实验室发现EAEC也使用HSPGs作为受体。我们很容易推测，这种特性可能也被噬菌体获得，如本文所述。

图6 模型显示：（1）肠粘液层的黏液抑制噬菌体感染；（2）噬菌体ES17能与粘液结合，并利用其他肠道聚糖作为受体感染和杀死粘液嵌入细菌；（3）ES17等噬菌体可通过结合硫酸肝素聚糖包裹肠上皮，以防止侵袭性病原体感染。

侵袭性病原菌或微生物能够引起疾病可以居住在我们胃肠道粘膜上皮的深处。需要有针对性的有效抗菌治疗来对抗这些致病微生物，其中许多可能具有多重耐药性。在这里，我们分离到一种溶解性噬菌体（噬菌体），它可以通过结合硫酸乙酰肝素聚糖定位于上皮表面，将其定位在宿主大肠杆菌附近。这种靶向治疗可用于选择性地清除胃肠道的侵袭性病原体，从而预防疾病的发展。

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