导读
目前尚未完全了解肠道菌群与自闭症谱系障碍（ASD）之间的关系。许多研究集中在正常发育（TD）和ASD儿童之间肠道微生物和代谢物的差异，但尚不清楚这些肠道微生物和代谢物是否引起ASD症状的发展。本文收集了TD和ASD儿童的粪便样本，并将它们移植到无菌（GF）小鼠中得到TD-FMT小鼠和ASD-FMT小鼠。通过行为学测试发现ASD儿童粪便中的肠道菌群可导致GF小鼠出现ASD样行为。此外，本文还对小鼠盲肠内容物进行16S rRNA基因测序以及对盲肠、血清和前额叶皮层进行非靶向代谢组学分析，发现ASD-FMT组小鼠表现出与TD-FMT组小鼠不同的肠道菌群结构并且色氨酸和5-羟色胺的代谢功能改变。与TD-FMT组小鼠相比，ASD-FMT组小鼠结肠中血清素转运蛋白（SERT）和血清素1A受体（5-HT1AR）表达水平较低，而色氨酸羟化酶1（TPH1）表达水平较高。在前额叶皮层中，ASD-FMT组小鼠TPH2和SERT表达水平升高。因此，本研究证实ASD儿童的粪便微生物组可以导致GF小鼠出现ASD样行为、肠道菌群结构以及色氨酸和5-羟色胺代谢改变，这可能与参与合成和运输血清素的一些关键蛋白变化有关。
原名：Fecal Microbiome Transplantation from Children with Autism Spectrum Disorder Modulates Tryptophan and Serotonergic Synapse Metabolism and Induces Altered Behaviors in Germ-FreeMice
译名：自闭症谱系障碍儿童粪便微生物组移植可调节色氨酸和血清素能突触代谢并诱导无菌小鼠行为改变
期刊：mSystems
IF：6.633
发表时间：2021.4.6
通讯作者：陈杰
通讯作者单位：重庆医科大学附属儿童医院儿童营养研究中心
1 源自ASD儿童的FMT促进GF小鼠产生异常行为ASD儿童肠道菌群可能会诱发无菌小鼠产生一些ASD的核心症状。在ASD-FMT组中，小鼠嗅探尿液所花费的时间明显短于TD-FMT组（图1A），但两组之间小鼠闻水和喝啤酒的时间没有差异。这表明FMT不会影响嗅觉，并暗示ASD儿童的肠道菌群可能会影响小鼠对社交气味的敏感性。在
旷场
试验中，ASD-FMT组小鼠在中心区域的运动时间明显短于TD-FMT组（图1B）（P
<
0.01），但自理时间明显长于TD-FMT组（图1C）。这表明ASD儿童的肠道菌群可能会影响小鼠产生焦虑和重复性行为。在三箱交互试验中，与TD-FMT组相比，ASD-FMT组小鼠表现出增加的重复行为并且社交性降低（P<0.001）（图1D）。
图1 对ASD-FMT组和TD-FMT组小鼠进行行为学测试。（A）嗅觉适应/戒除测试：小鼠累计嗅取棉签的时间。（B）旷场试验：两组小鼠在中心区停留的时间。（C）旷场试验：两组小鼠自我梳理时间。（D）三箱交互试验:两组小鼠在不同的盒子里待的时间。2
源自
ASD的儿童的FMT导致GF小鼠肠道菌群结构改变FMT
后，小鼠盲肠内肠道菌群组成产生变化，并且TD-FMT组和ASD-FMT组小鼠分别具有独特的肠道菌群结构。主坐标分析（PCoA）分析显示TD-FMT组和ASD-FMT组小鼠肠道菌群结构存在明显差异（图2C）。在门水平上，两组小鼠的优势菌群组成如图2D所示：拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、
unidentified_Bacteria
、疣微菌门（Verrucomicrobia）和变形菌门（Proteobacteria）的含量最多。与TD-FMT组相比，ASD-FMT组Verrucomicrobia的相对丰度显著降低，而unidentified_Bacteria的相对丰度则显著增高（图2F）。在属水平上，两组小鼠的优势菌群组成如图2E所示：与TD-FMT组相比，ASD-FMT组副杆菌属（Parabacteroides），理研菌属（Alistipes），Anarunotruncus和螺杆菌属（Helicobacter）的相对丰度显著增加，而毛螺菌属（Parasutterella），艾克曼菌属（Akkermansia），Lachnoclostridium和unidentified_Erysipelotrichaceae的相对丰度显著减少（图2G）。为了进一步鉴定TD-FMT组小鼠和ASD-FMT组小鼠的关键肠道菌群，线性判别分析（LDA）显示Verrucomicrobia和unidentified_Bacteria显示出显著的组间差异，可被确认为为关键菌门。在属水平上，Helicobacter，Lachnoclostridium和Akkermansia可被确定为关键菌属（图2H）。
图2（A和B）TD-FMT组小鼠和ASD-FMT组小鼠盲肠微生物特征比较。两组小鼠盲肠样本稀释曲线（A）和α多样性指数（B）。（C）在操作分类单元（OTU）水平上，两组小鼠盲肠微生物组成unweighted UniFrac距离度量标准的主坐标分析（PCoA）图。（D和E）TD-FMT组和ASD-FMT组小鼠在门（D）和属（E）水平上菌群的相对丰度。（F和G）用Wilcoxon秩和检验比较TD-FMT组和ASD-FMT组小鼠在门（F）和属（G）水平上的优势菌群。（H）TD-FMT组和ASD-FMT小组鼠盲肠菌群最丰富系统型的线性判别分析（LDA）值分布的直方图。
3. FMT改变GF小鼠色氨酸代谢和血清素能突触代谢途径通过对
TD-FMT组和ASD-FMT组小鼠盲肠内容物、血清样本和前额叶皮层样本进行非靶向代谢组学分析，确定ASD肠道菌群参与的代谢途径。在盲肠内容物中共检测到963种差异表达代谢物，其中ASD-FMT组有698种下调代谢物，265种上调代谢物（图3B）。在血清样本中共检测到239种差异表达代谢物，其中ASD-FMT组有122种下调代谢物，117种上调代谢物（图3D）。在前额皮质样品中共检测到65种差异表达代谢物，其中ASD-FMT组有36种下调代谢物，29种上调代谢物（图3F）。
图3 非靶向代谢组学在TD-FMT组小鼠和ASD-FMT组小鼠在不同组织中鉴定出差异丰富的代谢产物。
（
A
、
C
、
E
）两组小鼠盲肠内容物（
A
）、血清样本（
C
）和前额叶皮层（
PFC
）样本（
E
）的主成分分析（
PCA
）。
（
B
、
D
、
F
）两组小鼠盲肠内容物（
B
）、血清样品（
D
）、
PFC
样品（
F
）代谢产物改变火山图（
n=8
）。两组小鼠盲肠内容物中差异表达的代谢物主要显著富集于视黄醇、胆固醇和生物素等一些代谢通路（图4A）。盲肠内容物和血清样本中差异代谢物主要富集于生物素代谢途径（图4A和B）。前额叶皮质和血清样本中差异代谢物主要富集于胆汁分泌相关通路（图4B和C）。有趣的是，本研究发现盲肠内容物、血清样本和前额叶皮层样本中的差异代谢物富集于色氨酸代谢和5-羟色胺能突触通路（图4A～C）。
图4 代谢物富集分析。（A到C）TD-FMT组小鼠（n=8）和ASD-FMT组小鼠（n=8）盲肠内容物（A），血清样品（B）和前额叶皮层（PFC）样品（C）中KEGG差异通路。
（D）TD儿童（n=60）和ASD儿童（n=20）粪便样本中KEGG差异通路。4. ASD患儿粪便样本中色氨酸代谢和血清素能突触途径发生改变本文使用非靶向代谢组学分析TD组儿童（n=60）和ASD组儿童（n=120）的粪便代谢物。与动物实验结论一致，儿童粪便样本差异表达的代谢物同样富集于色氨酸代谢和5-羟色胺能突触的KEGG通路（图4D）。为了进一步探索色氨酸代谢和5-羟色胺能突触通路的特异性差异代谢物，本文绘制了色氨酸和5-羟色胺的简要代谢通路。与TD组儿童相比，ASD组儿童5-羟基-N-甲酰基基尿氨酸，色胺，5-羟基色氨酸和5-羟色胺含量更丰富，6-羟基褪黑激素和5-羟基吲哚-3-乙酸含量较低（图5）。
图5 TD组儿童（n=60）和ASD组儿童（n=120）色氨酸和5-羟色胺代谢途径中代谢物含量变化。与TD-FMT组小鼠相比，ASD-FMT组小鼠盲肠中Trp-Trp（色氨酸的二肽），犬尿酸和吲哚-3-乙酸的水平显著升高，而6-羟基褪黑素，吲哚-3-乳酸和5-甲氧基-吲哚乙酸的含量显著降低。（图6A）。此外，
ASD-FMT
组小鼠前额叶皮层样品中N-乙酰基-DL-色氨酸和5-羟色酚水平显著升高，而5-羟色酚水平显著降低（图6B和C）。本文研究结果表明，ASD相关肠道微生物可导致ASD-FMT小鼠和ASD儿童色氨酸和5-羟色胺代谢异常。
图6 TD-FMT组小鼠（n=8）和ASD-FMT组小鼠（n=8）盲肠（A）、血清（B）和前额皮质（PFC）（C）样本中色氨酸和5-羟色胺代谢通路的代谢物差异。5. FMT后，GF小鼠盲肠中特定细菌可能与色氨酸和5-羟色胺代谢有关TD-FMT组小鼠和ASD-FMT组小鼠盲肠内容物中差异表达代谢物和微生物群的相关性如图7所示。Parabacteroides，Alistipes，Anaerotruncus，Helicobacter，Parasutterella，Akkermansia，Lachnoclostridium和unidentified_Erysipelotrichaceae被鉴定为是两组之间具有显著差异菌属（图2G），并且与色氨酸和5-羟色胺代谢的差异表达代谢产物有关。ASD-FMT组盲肠中上调代谢产物上Trp-Trp、犬尿酸和吲哚-3-乙酸与梭菌目（order_Clostridiales）中的大多数菌属均呈正相关。此外，ASD-FMT组中这3个显著上调的代谢产物与order_Bacteroidetes中的某些菌属呈正相关，与order_Erysipelotrichales和family_erysipelotricaceae呈负相关。此外，几乎所有与ASD-FMT组上调代谢物正相关的菌属都与下调代谢物呈负相关，反之亦然。这些结果进一步证实一些特定的细菌可能与色氨酸和血清素代谢有关，包括o_Clostridiales，o_Bacteroidetes和f_erysipelotricaceae中的一些菌属。
图7 TD-FMT组和ASD-FMT组小鼠色氨酸和5-羟色胺代谢通路中显著差异代谢物与菌属的相关性。6. ASD-FMT组小鼠血清素合成和转运的关键蛋白表达改变本文检测了TD-FMT组小鼠和ASD-FMT组小鼠结肠和前额叶皮层样本中色氨酸羟化酶（TPH）、5-羟色胺转运体（SERT）和5-羟色胺1A受体（5-HT1AR）的蛋白表达水平。与TD-FMT组小鼠相比，ASD-FMT组小鼠结肠中TPH1蛋白表达水平显著上调（图8A、B），SERT和5-HT1AR表达水平显著下调（图8A、C、D）。在前额叶皮层，TPH2是参与复合胺合成的关键酶。与TD-FMT组小鼠相比，ASD-FMT组小鼠前额叶皮层中TPH2和SERT的表达水平显著上调（图8E～G），5-HT1A表达水平无显著差异（图8H）。这些结果提示ASD患者肠道菌群可能会导致无菌小鼠色氨酸和5-羟色胺代谢异常，并改变参与5-羟色胺合成和转运的关键蛋白质。
图8（A）TPH1（色氨酸羟化酶）、SERT（血清素转运体）的蛋白表达水平，TD-FMT组（移植典型发育中对照供体粪便菌群的小鼠）和ASD-FMT组（移植自闭症谱系障碍供体粪便菌群的小鼠）结肠中的5-HT1AR（5-HT1AR受体）水平。(E） 前额叶皮质（PFC）中TPH2、SERT和5-HT1AR的蛋白表达水平(B到D），结肠中TPH1（B）、SERT（C）和5-HT1AR（D）的Western blot（WB）信号定量(F至H）：PFC中TPH2（F）、SERT（G）和5-HT1AR（H）的WB信号量化。据报道，定植神经发育障碍患者肠道菌群的GF小鼠会发展与疾病相关的行为表型，这为研究肠道菌群与ASD的相互作用提供理论基础。大量研究报告了TD儿童和ASD儿童之间肠道菌群组成的差异。此外，微生物群转移疗法可改善ASD儿童的行为问题和胃肠道症状。本文实验结果表明，ASD儿童肠道菌群可可导致GF小鼠表现出ASD样行为，包括重复行为增加和社交能力下降。多项研究表明，ASD儿童具有独特的肠道菌群结构和代谢特征，本文揭示ASD儿童肠道菌群可影响GF小鼠肠道菌群的分布和组成。本文发现ASD-FMT小鼠肠道菌群中Akkermansia含量减少。ASD儿童体内Akkermansia含量较低表明其胃肠道粘液屏障较薄。已知丁酸可促进神经可塑性和记忆形成，并且Clostridiales和Erysipelotrichaceae与丁酸的产生有关。本研究中，属于o_Clostridiales的Lachnoclostridium和Erysipelotrichaceae在ASD-FMT组小鼠中含量减少。色氨酸是血清素的唯一前体，大多数由色氨酸产生的血清素储存在嗜铬细胞中，在肠道中受到刺激而释放。90%以上的色氨酸可通过犬尿氨酸途径氧化为犬尿酸或通过喹啉酸途径氧化为喹啉酸。色氨酸还可以被肠道菌群代谢为吲哚及其衍生物。ASD患者体内色氨酸水平降低，血浆中犬尿氨酸/色氨酸比率增加。目前大多数研究支持ASD儿童血清中的血清素水平升高，大脑中血清素水平降低。并且动物研究证实，色氨酸和5-羟色胺的代谢受到肠道菌群调节。本文结论表明ASD-FMT组小鼠显示色氨酸代谢中犬尿氨酸途径产物水平升高，5-羟色胺代谢产物水平降低，并且吲哚产物代谢水平也发生改变。此外，ASD儿童犬尿氨酸途径产物水平升高，而5-羟色胺代谢产物水平降低。因此，本文研究表明色氨酸和5-羟色胺代谢的改变可能是ASD相关肠道菌群结构改变的结果。最近的研究表明，ASD患者o_Clostridiales中一些与粘膜相关的细菌水平增加，其中梭状芽胞杆菌可促进结肠肠嗜铬细胞内5-羟色胺的生物合成。此外，Clostridium，Ruminococcus，Blautia和Lactobacillus已被证实能够将色氨酸转化为色胺。与上述结果一致，本文研究表明大多数o_Clostridiales与ASD-FMT组小鼠盲肠中色氨酸和5-羟色胺代谢产物水平增加呈正相关，而与其水平减少呈负相关。短链脂肪酸是肠道菌群在胃肠道中的主要代谢产物，包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸。已知道在小鼠脑室内注射丙酸后可诱发ASD样行为，其潜在机制可能与神经递质的调节有关。已知Clostridia和Bacteroides可以产生丙酸，并且o_Bacteroidales被证实参与色氨酸和5-羟色胺代谢。因此，本文推测o_Bacteroidales的中一些菌属可能与丙酸的产生有关，并通过调节色氨酸和5-羟色胺代谢间接影响ASD行为。有研究表明，ASD患者肠道中可产丁酸盐的Erysipelotricaceae水平明显减少。本文结论与上述一致，并且进一步指出f_Erysipelotrichaceae中的unidentified_Erysipelotricaceae，Holdemania和Dielma参与ASD-FMT组小鼠色氨酸和5-羟色胺代谢。TPH是催化5-羟色胺合成的限速步骤，TPH1主要存在于肠和脾等外周器官中，而TPH2则存在于脑干中。ASD儿童血清5-羟色胺水平升高可能与SERT和血清素受体变化有关。SERT位于突触前5-羟色胺的神经末梢和轴突以及5-羟色胺细胞体中，这些转运蛋白分子可以从突触间隙快速清除5-羟色胺，并有效控制5-羟色胺浓度，因此SERT水平改变可能会导致生理功能障碍。5-HT1A受体在前额叶皮层中占主导地位，并可通过负反馈回路调节5-羟色胺的释放。本文发现中，与TD-FMT组小鼠相比，ASD-FMT组小鼠TPH1在结肠表达水平较高，而SERT和5-HT1AR的表达水平较低。这可能是ASD-FMT组小鼠血清素代谢产物减少而引起的自我调节。研究表明，ASD儿童血清中血清素水平升高，而大脑中血清素水平降低。本文结果显示，与TD-FMT组小鼠相比，ASD-FMT组小鼠前额皮质中TPH2和SERT表达水平显著升高。因此，本文作者推测ASD-FMT组小鼠前额皮质SERT表达的增加可能导致中枢中5-羟色胺水平的降低。本文结果为肠道微生物影响色氨酸和5-羟色胺代谢的分子机制提供初步线索。
ASD儿童粪便中的肠道菌群会导致GF小鼠出现ASD样行为，肠道菌群结构改变以及色氨酸和5-羟色胺代谢改变。色氨酸和5-羟色胺代谢通路在ASD和TD儿童以及ASD-FMT和TD-FMT小鼠中均发生改变。一些特定的肠道菌群，如o_Clostridiales，o_Bacteroidales和f_Erysipelotrichaceae与色氨酸和5-羟色胺的代谢有关。此外，ASD相关肠道菌群可能会改变GF小鼠血清素合成和转运相关蛋白的表达，这可能是色氨酸和5-羟色胺代谢变化的分子基础。本文为研究肠道菌群与ASD之间的关系提供理论基础。然而，其病因和具体的调控机制仍有待阐明，还需要在动物和人类队列中进一步验证本文结论，确认某些微生物及其代谢对ASD的影响，并阐明其潜在的调控机制。
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