单细胞测序技术在全麻药物神经神经发育毒性机制研究中的首次应用

据报道，美国每年约有300 万婴幼儿在全身麻醉下接受外科手术1；基于中国人口普查数据，预计我国婴幼儿在全身麻醉下接受外科手术的人数会远高于美国。由于全麻药物直接作用于脑，这一药理学特点让人们对其是否会影响脑发育和脑功能展开了相关的研究。2016 年12 月14 日，美国食品和药物管理局（FDA）发布警告：妊娠末三个月的孕妇或3 岁以下儿童在手术中重复或长时间（＞3 小时）使用全麻药和镇静药，可能会影响胎儿及儿童的大脑发育。全麻药物和围术期应激对发育脑功能的影响及其远期效应更是排在麻醉学亟待解决的十大科学问题之中，是研究的重中之重。因此，研究全麻药物对发育脑的影响机制具有重要的临床意义。

单细胞转录组测序（Single cell RNA-sequencing）是指在单细胞水平上对 RNA 进行高通量测序和分析的技术。生物的细胞与细胞之间是存在差异的，随着个体的发育，各种功能细胞之间的差异会越来越大，表达各自不同的基因，决定不同的生理功能。而单细胞测序则能够很好的解决这种异质性的问题。

临床研究发现多次全身麻醉下手术和婴幼儿患者远期特定行为学的改变如精细运动损伤和语言社交能力降低等有相关性^3-6。梅奥诊所的MASK (Mayo Anesthesia Safety in Kids)研究是关于多次麻醉影响发育脑的临床研究，其结果发表在了《Anesthesiology》和《British Journal of Anaesthesia》上。他们认为多次全身麻醉会引起部分患儿神经行为学的改变，这种改变可能不是智力损伤，而是某些特定神经行为学模式的损伤如处理速度、精细运动、运动协调和视觉运动整合方面⁴。但是，研究全麻药物诱导的神经发育毒性机制的非人灵长类和啮齿类动物模型之间尚存在一定的差异，比如临床上观察到多次全麻和手术引起婴幼儿患者远期语言和社交能力的降低^3-6和非人灵长类动物模型观察到麻醉后多种社交行为能力的损害⁷，但是多次的麻醉的幼鼠却很难观察到社交能力的损害。杏仁核是控制情绪反应和管理疼痛应激等生理功能的核心脑功能区域^8-11。

为了更好的理解灵长类和啮齿类模型的不同，上海交通大学医学院附属第九人民医院麻醉科姜虹教授联合中科院脑科学卓越创新中心仇子龙研究员使用高通量单细胞核RNA的测序方法，首次描绘了幼年猕猴大脑中的杏仁核的神经细胞类群图谱，同时对比了幼年猕猴和幼年小鼠之间的差异，发现灵长类动物和啮齿类动物在确实在多种神经细胞上存在着明显的物种差异。该研究发表在了国内主办的高影响因子一区综合性期刊《Science Bulletin》上，该研究结果有助于理解非人灵长类动物和啮齿类动物作为模型在全麻药物引起的神经发育毒性机制研究中的不同，更进一步确定非人灵长类动物模型更适合发育大脑的全麻神经毒性机制研究。

我们认为在全麻药物引起认知损伤的非人灵长类模型和啮齿类模型中，肯定有同向变化的基因，也肯定有相反变化的基因。应该在临床上找寻出引起全麻药物神经发育毒性的关键科学问题，然后使用非人灵长类动物猕猴去探索全麻药物引起神经发育毒性的机制线索，之后找到猕猴和小鼠具有相同变化的靶基因，使用小鼠模型来进行验证。

基于这个理念， 我们聚焦到了使用非人灵长类动物和啮齿类动物来研究全麻药物与术后远期精细运动损伤的机制。MASK研究认为多次全身麻醉会引起一部分患儿某种特定神经行为学模式的损伤，如处理速度、精细运动、运动协调和视觉运动整合方面⁴。2020年10月，《Anesthesiology》刊登了一个大样本出生队列研究，该研究定义麻醉和手术暴露为四岁之前，评估7-16岁的神经发育结果。发现较低的精细运动能力与多次的麻醉和手术暴露相关¹²。一项来自日本的出生队列研究⁶提示婴儿时期接受全身麻醉的患儿在1岁时神经发育迟滞风险更大，包括了沟通能力、精细运动能力、问题解决能力和社交能力。于是，我们首次以精细运动能力损伤为切入点，探索了全麻药对神经系统影响的机制。

近日，姜虹教授团队在毒理学期刊《Cell Biology and Toxicology》上发表研究文章，该研究探索了全麻药物对婴幼儿精细运动能力损伤的机制，并首次关注了m6A甲基化在七氟烷麻醉影响精细运动损伤中的作用和机制。

m6A修饰是在RNA甲基化修饰中最丰富的一种，YTHDF1是m6A甲基化的识别蛋白之一。最近的研究发现其可以参与神经认知的形成和发展^13-15。在随后的机制研究中，我们发现七氟烷麻醉后的幼年灵长类和啮齿类动物的大脑中YTHDF1表达显著下调。对接受多次麻醉后的小鼠的前额叶皮质取材并进行了单细胞测序，来鉴定神经系统中各个细胞亚群中的YTHDF1基因的表达。皮层的功能取决于皮层中各种类型神经元的起源和功能环路中的分化方向。GABA能中间神经元占皮质神经元的15-20％。尽管中间神经元数量较少，但它们在皮层网络的发展和组织中起着至关重要的作用，包括了广泛意义上的认知和情感功能等。单细胞测序发现sp8阳性的神经元中YTHDF1的表达下降在中间神经元中最为明显，而这部分神经元，后续会发育成VIP中间神经元。我们通过RIP实验和m6A-seq实验发现m6A被高度富集在突触素(Synaptophysin)的mRNA上，同时Synaptophysin的 mRNA上有YTHDF1的结合位点。早先的研究发现Synaptophysin和全麻药物的神经发育毒性紧密相关¹⁶。过表达YTHDF1可以回救七氟烷引起的幼年小鼠精细运动能力和认知功能障碍以及Synaptophysin的变化。我们认为YTHDF1是以m6A甲基化依赖性方式调控其下游靶基因Synaptophysin的表达，继而损伤小鼠的精细运动能力和认知功能。本研究探索了全麻药物对婴幼儿精细运动能力损伤的机制，并首次关注了m6A甲基化在七氟烷麻醉影响精细运动损伤中的作用，有望为预防或治疗全麻药的神经发育毒性提供新的思路。

事实上，早在2019年，姜虹教授团队就对全麻药物引起的精细运动损伤，做过初步的探索，首次揭示全麻药物引起的髓鞘发育损伤可能是其机制之一¹⁷。该团队发现3岁以内的婴幼儿患者行七氟烷吸入全身麻醉后，其术后叶酸水平较术前均出现了下降。在七氟烷多次麻醉猕猴的动物模型中，其脑内叶酸代谢通路受到影响。叶酸作为一碳单位供体以提供甲基基团的角色进而参与体内多种甲基化过程。于是研究者们对猕猴前额叶皮质进行了全基因组甲基化测序，随后对转录组测序数据和全基因组甲基化测序进行了生物信息联合分析，发现七氟烷反复麻醉后的猕猴，其前额叶皮质中髓鞘发育关键基因ERMN的启动子区甲基化增高，其mRNA的表达下降。动物实验发现七氟烷也同样下调小鼠脑中叶酸代谢通路和ERMN的表达。重要的是，小鼠在P7天七氟烷处理后，于P14天和P30均发现了髓鞘产生减少，这意味着七氟烷对髓鞘发育的损伤是一个持续的过程。小鼠腹腔注射叶酸可以回救七氟烷引起的髓鞘产生减少以及学习和记忆能力损伤。该结果提示吸入全麻药七氟烷影响了叶酸代谢通路，导致了发育期大脑甲基化紊乱，髓鞘相关重要基因ERMN的启动子区甲基化增高，表达量下降，髓鞘发育受损，引起了远期神经行为学异常。叶酸代谢通路可能是幼儿患者接受较长手术全身麻醉时及时检测或预防麻醉对大脑发育的重要靶点，叶酸可能是治疗全麻药物神经发育毒性的潜在药物。该研究2019年5月份发表在了国际综合性期刊柳叶刀子刊《Ebiomedicine》上。三个月后，也就是2019年8月，《Anesthesiology》发表了来自约翰霍普金斯麻醉科的文章，该文章也是发现了异氟烷的髓鞘发育毒性¹⁸。

以上研究由姜虹教授团队在H0902获得的8项国家自然科学基金资助下完成。

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