磷酸化叉头框O4型在H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用

2021
05/04

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古麻今醉
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本研究拟以H9c2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)模型和小鼠心肌缺血/再灌注(I/R)模型模拟MI/RI,在离体细胞和在体组织中探讨p‑FoxO4在MI/RI中的作用,为临床治疗MI/RI寻求新靶点提供理论依据。


苏忠雪 刘华跃 孟晓文 王辉 张俊 嵇富海

苏州大学附属第一医院麻醉科 215021

国际麻醉学与复苏杂志,2021,42(04):337-343.

DOI:10.3760/cma.j.cn321761-20200904‑00251

 基金项目 

国家自然科学基金面上项目(81873925,81671880);

江苏省自然科学基金(BK20191171);

江苏省医学创新团队(CXTDA2017043);

苏州市重点病种项目(LCZX201603)

ORIGINAL ARTICLES

【论著】

本研究拟以H9c2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)模型和小鼠心肌缺血/再灌注(I/R)模型模拟MI/RI,在离体细胞和在体组织中探讨p‑FoxO4在MI/RI中的作用,为临床治疗MI/RI寻求新靶点提供理论依据。


 

1 材料与方法

     

1.1 H9c2心肌细胞的培养

将H9c2心肌细胞用含有10%胎牛血清及1%青霉素‑链霉素的DMEM高糖培养基于含有5%CO2的37 ℃恒温培养箱培养,隔天观察细胞状态,更换培养液并定期传代。


1.2 H9c2心肌细胞H/R模型的制备

用含95%N2、5%CO2无氧气体,流速1 L/min,充分饱和无糖培养基30 min备用。弃H9c2心肌细胞正常高糖培养基,PBS洗3遍并迅速加入适量的经无氧气体充分饱和的无糖无血清培养基。将细胞板放入缺氧小室,并用上述无氧气体置换缺氧小室内的氧气,30 min后用含有5%CO2的缺氧气体,37 ℃恒温培养箱中培养1 h。缺氧完成后将细胞培养基更换为正常培养基,于恒温培养箱中分别培养1、3、6 h。


1.3 小鼠心肌I/R模型建立

选择6~8周雄性SPF级C57/BL6小鼠,腹腔注射1%戊巴比妥50 mg/kg麻醉后进行气管插管,用小鼠呼吸机进行机械通气,潮气量为0.15 ml,呼吸频率100次/min。在小鼠胸骨左缘第四肋间开胸,结扎心脏左冠状动脉前降支30 min后,松开结扎线进行再灌注3、6、12、24 h。


1.4 实验分组

待H9c2心肌细胞培养24 h后,按随机数字表法分成4组:对照组(Control组)、缺氧1 h复氧1 h组(H1R1组)、缺氧1 h复氧3 h组(H1R3组)和缺氧1 h复氧6 h组(H1R6组)。Control组细胞不做任何处理,H1R1组细胞缺氧1 h复氧1 h,H1R3组细胞缺氧1 h复氧3 h,H1R6组细胞缺氧1 h复氧6 h。完成H/R处理后进行项目检测。


采用随机数字表法将小鼠分为5组(每组3只):假手术组(sham组)、缺血30 min再灌注3 h组(R3组)、缺血30 min再灌注6 h组(R6组)、缺血30 min再灌注12 h组(R12组)、缺血30 min再灌注24 h组(R24组)。Sham组在心脏结扎处穿线,但不结扎。R3组结扎冠状动脉左前降支30 min后再松开结扎线进行灌注3 h,R6组缺血30 min后再灌注6 h,R12组为缺血30 min后再灌注12 h,R24组为缺血30 min后再灌注24 h。


1.5 细胞增殖‑毒性检测试剂盒检测H9c2心肌细胞相对存活率

将含1×105个H9c2细胞的100 μl细胞悬液均匀种植于96孔板中,每组6个复孔,并设置空白对照组,进行H/R处理后,每孔加入10 μl CCK‑8溶液于培养箱中孵育1 h,用酶标仪450 nm测定各孔光密度(D)值,计算细胞活力。细胞相对存活率=(实验组D值-空白组D值)/(对照组D值-空白组D值)×100%。


1.6 实时定量聚合酶链反应qPCR)检测FoxO4、Bim、Bcl‑2和Bax的mRNA表达

将H9c2细胞均匀接种于6孔板中,分成Control组、H1R1组、H1R3组和H1R6组,每组3个复孔;在动物实验中则对5组小鼠心肌进行取材,均采用Trizol试剂(生产批号:15596‑026,北京索莱宝科技有限公司)提取细胞中的总RNA,检测RNA浓度及纯度,将RNA逆转录成cDNA,FoxO4、Bim、Bcl‑2、Bax及内参引物序列由上海生工生物工程设计与合成,FoxO4上游引物为GAATCCTGGGGGCTGTAA,下游引物为GCTGATGAGTTCTGCATATGAC;Bim上游引物为GCACTGACTGACTGGCTCTGTTC,下游引物为GAGAGGCAGCAGAATCCAAGCAC;Bcl‑2上游引物为GATGACTTCTCTCGTCGCTAC,下游引物为GAACTCAAAGAAGGCCACAATC;Bax上游引物为TTGCCCTCTTCTACTTTGCTAG,下游引物为CCATGATGGTTCTGATCAGCTC;内参上游引物为GGGAGGTGATAAGCGATGAA下游引物为AGGGACATA‑ CTTGCCACCTG。逆转录过程分两步:第一步为去基因组DNA反应,将1 μg RNA、1 μl DNA和DEPC水共10 μl混合,45 ℃孵育5 min,反应结束后于冰上静置;第二步为逆转录反应,将第一步冰上静置过的10 μl混合液加入10 μl的2*NovoScript® Plus 1st Strand cDNA Synthesis Supermix轻轻混匀。50 ℃ 孵育30 min,再75 ℃孵育5 min,终止反应,获得的cDNA样品−20 ℃保存。qPCR体系包括前后引物各1 μl、subgreen 5 μl、DEPC水2 μl、cDNA 1 μl,共10 μl。扩增条件为95 ℃ 1 min,每个循环为95 ℃ 20 s,60 ℃ 1 min,45个循环。以β‑tubulin为内参,每组目的基因和内参重复3孔。荧光定量PCR仪器检测的CT值是每个样本的荧光强度达到预先设定阈值的循环数,目的基因的mRNA相对表达量=2−∆∆CT×100%。


1.7 Hoechst试剂盒检测细胞凋亡率

将H9c2心肌细胞均匀接种于载玻片上,分为Control组和H1R1组,每组重复3次,加入培养基过夜,使密度为50%~80%,行H/R处理后使用Hoechst 试剂盒进行固定,染色,封片。荧光显微镜观察被染色细胞核的形态,并计算细胞凋亡率(细胞凋亡率=同一视野中凋亡细胞数/所有细胞数×100%)。


1.8 Western blot 法检测H9c2心肌细胞蛋白表达

将H9c2心肌细胞接种于中号培养皿,每组重复3次,进行相应H/R处理后提取蛋白,并用BCA试剂盒检测蛋白浓度,每组各取30 μg进行SDS‑PAGE电泳分离蛋白。将蛋白转移到偏二氟乙烯膜,并用5%脱脂牛奶(生产批号:S30865,上海源叶生物科技有限公司)封闭2 h,再用对应分子的抗体(抗FoxO4抗体、抗磷酸化FoxO4抗体、抗Bim抗体、抗Bcl‑2抗体、抗Bax抗体)封闭4 ℃过夜,再用Tris缓冲盐水吐温溶液(TBST)洗膜3次,每次15 min,用辣根过氧化物酶标记山羊抗兔抗体孵育2 h,再次用TBST溶液洗膜3次,每次15 min,进行显色。结果用Image J软件分析条带的灰度值,并以目的条带/β‑tubulin的灰度值计为目的蛋白表达量。


 

2 结 果

     

2.1 细胞相对存活率比较

与Control组[(99.4±3.8)%]比较,H1R1组[(50.6±4.1)%]、H1R3组[(65.2±4.0)%]和H1R6组[(78.4±1.9)%]细胞相对生存率下降,H1R1组最低(P<0.05)。与H1R1组比较,H1R3组和H1R6组细胞相对存活率升高(P<0.05)。与H1R3组比较,H1R6组细胞相对存活率升高(P<0.05)。


2.2 qPCR检测FoxO4、Bim、Bcl‑2和Bax基因水平变化

与Control比较,H1R1组、H1R3组、H1R6组FoxO4 mRNA表达增加(P<0.05),H1R1组Bim mRNA表达升高(P<0.05),H1R1组Bcl‑2 mRNA表达减少(P<0.05),H1R1组Bax mRNA表达增加(P<0.05),H1R3组、H1R6组Bax mRNA表达减少(P<0.05);与H1R1组比较,H1R3组、H1R6组Bim mRNA表达和Bax mRNA表达降低(P<0.05)。见图1。

 

与Sham组比较,R12组、R24组FoxO4 mRNA含量增加(P<0.05),R6组Bim mRNA减少(P<0.05),R24组Bim mRNA含量增加(P<0.05),R3组、R12组、R24组Bcl‑2 mRNA含量减少(P<0.05),R6组和R24组Bax mRNA含量增加(P<0.05)。与R3组比较,R12组和R24组FoxO4 mRNA含量增加(P<0.05),R12组和R24组Bim mRNA含量增加(P<0.05),R6组、R12组和R24组Bax mRNA含量增加(P<0.05)。与R6组比较,R12组和R24组FoxO4 mRNA含量及Bim mRNA含量增加(P<0.05)。与R12组比较,R24组FoxO4 mRNA、Bim mRNA、Bax mRNA含量增加(P<0.05)。见图2。

 

2.3 Hoechst 试剂盒检测细胞凋亡率

H1R1组凋亡率高于Control组(P<0.05,图3)。

 

2.4 Western blot检测各蛋白的表达量

与Control组比较,H1R1组FoxO4、p‑FoxO4、Bim、Bax蛋白含量增高(P<0.05),Bcl‑2蛋白含量降低(P<0.05,图4)。

 
 

3 讨 论

     

本实验采用H9c2心肌细胞H/R模型模拟临床上MI/RI,探讨FoxO4在H9c2心肌细胞H/R损伤中的作用。同时在动物实验中进行基因水平上的验证。


实验结果显示,当细胞发生H/R损伤时,细胞的相对存活率降低,并出现细胞核的崩解和皱缩,提示细胞出现凋亡。同时FoxO4 mRNA含量及蛋白水平和p‑FoxO4蛋白水平增高,提示转录因子FoxO4以磷酸化形式调控细胞凋亡参与心肌细胞的H/R损伤。同时我们还观察到Bim、Bax的mRNA水平和蛋白含量增加,Bcl‑2 mRNA水平和蛋白含量减少。同时在动物实验中也验证了小鼠发生MI/RI后,FoxO4、Bim、Bax的mRNA水平增加,Bcl‑2 mRNA水平减少。其中Bim为只有一个BH3结构域的Bcl‑2家族促凋亡因子,Bim在生理和病理生理条件下均会启动内在的凋亡途径。在间接激活模型中,Bim与抗凋亡Bcl‑2蛋白的结合导致Bak和Bax的释放,使其可用于诱导细胞凋亡。所以本研究结果进一步表明当细胞受到H/R损伤应激后,上调促凋亡因子Bim,并结合抑凋亡因子Bcl‑2,激活促凋亡因子Bax。另有文献报道,Bax的激活可导致线粒体外膜内的同质齐聚和组装,然后发生线粒体外膜透化,细胞色素c释放导致线粒体通透性增加,最终使细胞发生内在途径的凋亡。因此,我们推测当细胞受到H/R损伤后,FoxO4以及p‑FoxO4水平增加,可能通过调控细胞凋亡的内在途径参与心肌细胞的H/R损伤。


本文由作者自行上传,并且作者对本文图文涉及知识产权负全部责任。如有侵权请及时联系(邮箱:nanxingjun@hmkx.cn
关键词:
细胞,min,心肌细胞,FoxO

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