西南大学 | EM:调控宿主蜕皮甾类激素以促进昆虫真菌病原体Metarhizium rileyi侵染

2021
05/07

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微生态
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该研究表明,M. rileyi在表达靶向宿主ecdysone激素失活酶方面已进化出一种特定的适应性。

编译:微科盟HushKuo,编辑:微科盟木木夕、江舜尧。

微科盟原创微文,欢迎转发转载。

导读  

致病性真菌,如Metarhizium rileyiBeauveria bassiana,是广泛使用的昆虫生物防治剂。然而,关于遗传或酶促因子区分这两种真菌病原体感染靶宿主的机制知之甚少。上述任何一种真菌的感染都会增加生长水平以及蜕皮甾类激素ecdysone的水平,这类激素调节许多先天免疫途径的表达。相比于B. bassianaM. riley已经进化出能使ecdysone失活的ecdysteroid-22-氧化酶(MrE22O)。我们发现,与野生型菌株相比,MrE22O的缺失削弱了毒力,并在宿主中观察到的ecdysone滴量增加与抗菌素基因的表达升高耦合。经过工程改造以过度表达MrE22OMrE22OOE)以及在B. bassianaBb:: MrE220OE)中进行反式表达的M. rileyi菌株,与其各自的野生型亲本相比,显示出更高的毒力并减弱了宿主的免疫反应。这些结果表明,ecdysone在介导对真菌感染的响应中起重要作用,并且一些昆虫病原真菌已经进化靶向该激素作为促进感染手段的机制


论文ID


 

名:Manipulation of host ecdysteroid hormone levels facilitate infection by the fungal insect pathogen, Metarhizium rileyi

调控宿主蜕皮甾类激素以促进昆虫真菌病原体Metarhizium rileyi侵染

期刊Environmental Microbiology

IF:4.933

发表时间:2021.3.18

通讯作者:范艳华

通讯作者单位:西南大学生物技术研究中心蚕基因组生物学国家重点实验室


实验设计与方法


结果


1 真菌感染会提高昆虫ecdysone (20E)的水平,导致免疫介导的抗菌素基因表达上调
研究发现,与对照幼虫相比,两种昆虫寄主中的B. bassianaM. anisopliae均在感染过程中致使20E水平显著增加(P < 0.01)。B. bassianaM. anisopliae感染 G. mellonella 幼虫会导致20E水平升高,接种后72 h达到对照的2倍至3倍。相似地,两种真菌在侵染 S. litura 幼虫时20E水平随侵染时程升高。相比之下,M. rileyi感染导致20E浓度的升高显著于B. bassianaM. anisopliae。20E浓度均显著低于对照组(P < 0.01, 图1.A, B)。Beauveria bassiana诱导了GmCecGmGlo的最大表达,而M. anisopliae诱导了GmGalGmGstGmPGRP-B的表达。除GmGalGmGloGmPGRP-A以及GmPGRP-B的某些时间点外,M. rileyi感染的大多数情况下,所检测的大多数基因的表达均低于其他真菌,和/或与对照相比相当或更低。对S. litura而言,相似的免疫相关基因(SlGalSlGloSlCecSlLectinMoricinSlMorSlAtt)显示出与G. mellonella中相似的趋势。与 B. bassiana M. anisopliae相比,M. rileyi侵染的幼虫中大多数基因的表达更低。
直接测试20E对免疫响应基因表达和真菌毒力的影响的实验发现,注射20E诱导了G. mellonella所检测基因的表达,20E与B. bassiana分生孢子的共注射在大多数情况下没有显著增强这种作用。然而,与单独的B. bassiana相比,共注射显著提高了宿主存活率,从而使半致死时间(LT50)发生50小时左右变化。

图1. 真菌感染后ecdysone水平升高。真菌感染对ecdysone浓度影响的时程:(A)第五代G. mellonella的局部注射。(B)第四代S. litura幼虫的血腔内部注射。(C) G. mellonella幼虫经血腔注射灭活真菌(M.rileyi-IB. bassiana-I)和细胞壁成分(壳聚糖,β-葡聚糖和肽聚糖(PGN))后的ecdysone水平。

 

图2. 真菌感染使ecdysone水平升高诱导的免疫相关基因上调。 B. bassiana M. anisopliae M. rileyi侵染后G. mellonella幼虫中免疫相关基因表达的qPCR时程分析。检测的基因包括:天蚕素 (GmCec)、Gallerimycin (GmGal)、Gloverin (GmGlo)、谷胱甘肽S-转移酶 (GmGST)及肽聚糖识别蛋白AB (GmPGRP-A,B). GmActin基因用作标准化的参考基因。

2 MrE22O在真菌感染期间使宿主20E失活
野生型M. rileyiMrE22OOEBb::MrE22OE对20E具有氧化作用,但并非由衍生自ΔMrE22O突变体或野生型B. bassiana的提取物进行转化。MrE22O的体内效应实验表明,真菌接种后,ΔMrE22O菌株未能抑制20E诱导。由于肠道微生物组会影响20E水平,使用饲喂抗生素头孢菌素的昆虫进行了相同的实验,结果与标准饲喂的昆虫显示相同特征。
 
3 缺少MrE22OMetarhizium rileyi不能抑制宿主免疫相关基因的诱导并显示出削弱的真菌毒力
宿主基因对 M. rileyi 野生型菌株和MrE22OOE 菌株的响应均相似,但SlMor除外,其在MrE22OOE菌株中的表达明显较低(P < 0.01)。无论是给昆虫喂标准饲料还是含有头孢菌素的饲料,在宿主基因表达的总体特征上均未见明显差异。研究发现,与对照相比,感染M. rileyi菌株会引起PO活性的增加。但与没有MrE22O的菌株相比,MrE22O的缺失导致注射后36小时PO活性降低约20%,注射后60小时未观察到显著差异。ΔMrE22O突变体在局部和注射实验中均显示LT50升高(毒力降低)。野生型M. rileyiMrE22OOE菌株相比,局部实验中MrE22O的缺失使LT50显著升高12.4%。血腔内部注射实验显示,亲本菌株与过度表达型菌株相比,LT50升高14%-22%。
 

图3. MrE22O的缺失增加20E和宿主免疫基因表达,并降低毒力。(A)指示真菌菌株感染的S. litura幼虫中的ecdysone浓度。(B)感染后144小时指示S. litura免疫反应的基因表达分析。SlActin作为参考基因,检测的基因包括:天蚕抗菌肽(SlAtt),杀菌肽(SlCec),GallerimycinSlGal),GloverinSlGlo),MoricinSlMor)。(C)血腔内部注射的昆虫生物实验。(D)使用局部注射方案的昆虫生物实验。*表示P <0.05,**表示P < 0.01,ns表示t检验不显著。
 
4 MrE22O对真菌感染过程中宿主生长发育的影响
在用M. rileyiMrE22O缺失突变体和/或MrE22O过表达菌株处理的 S. litura 中,蜕皮和化蛹方面没有观察到明显差异。但将分生孢子添加到S. litura的食物中后,15天内经测定中发现化蛹率存在显著差异。在该实验中,野生型M. rileyi菌株的感染导致感染后12天的化蛹率达到20%,在感染后15天逐渐增加至40%,略低于未处理的对照(图4A)。但是,用ΔMrE22O菌株处理可显著提高化蛹率,感染后10-12天可达到40%-60%,处理后15天可高达70%。MrE22OOE菌株进行处理最初抑制化蛹,在感染后10–12天仅有5%–10%的化蛹,然后在处理后15天逐渐达到40%的化蛹。处理后15天存活幼虫、进入正常化蛹的幼虫、未成功化蛹的幼虫及死亡的幼虫的百分比变化如图4B所示。
 

图4. MrE22O对宿主发育的影响.(A) Spodopteralitura 幼虫(二代)通过口服喂食(5×104分生孢子/幼虫)处理,分生孢子源于野生型 M.rileyi ΔMrE22OMrE22O组成型表达(MrE22OOE)菌株,昆虫蛹期开始计数.(B) 处理后 15天存活幼虫、进入正常化蛹的幼虫、未成功化蛹的幼虫及死亡的幼虫的百分比。
 
5 Metarhizium rileyi MrE22O改变肠道细菌微生物组的数量
宿主死亡3天后的尸检显示,与野生型和MrE22OOE菌株相比,ΔMrE22O菌株对死虫表面的定殖更快,而在饲喂含有抗生素(头孢菌素)的昆虫中则无定殖情况。由MrE22O调控的20E水平会导致肠道细菌微生物组的数量差异。CFU计数和细菌RT-PCR定量数据均表明,M. rileyi野生型或MrE22O菌株的感染增加了细菌载量,而ΔMrE22O感染却使昆虫的总体细菌载量降低。与ΔMrE22O菌株相比,感染野生型M. rileyiMrE22OOE菌株的幼虫的菌丝体生长明显降低,尸体分生孢子产量降低,死后6天降低了25%–85%。喂食昆虫细菌抗生素可以改善这种效果,与喂食标准食物相比,喂食抗生素的幼虫尸体上分生孢子产率高31%–65%。为了进一步确定MrE22O的作用,为了进一步证实MrE22O的作用,从异源酵母表达系统Pichia pastoris表达并纯化了该蛋白。纯化的蛋白质,通过HPLC验证了E22O活性。与对照相比,注射纯化的MrE22OS. litura幼虫12h后20E浓度显著降低(57%,P < 0.01)。此外,在经过MrE22O处理的幼虫(12小时)中,与对照组相比,一组免疫相关基因的表达降低了10%–60%(注射后12和18小时),总细菌载量增加了150%(P < 0.01)。此外,与单独注射ΔMrE22O相比,将纯化的MrE22O与源自MrE22O缺失菌株的分生孢子共同注射降低了免疫相关基因的表达,将毒力表型恢复为野生型菌株的毒力表型。
 

图5. MrE22O的缺失导致宿主肠道微生物组的改变和宿主尸体上真菌的生长。(A)死后3天,尸体上真菌外生的代表性图像。(B) M. rileyi ΔMrE22O MrE22O 组成型表达(MrE22OOE)菌株处理120和144h后S. litura肠道细菌总数的16S核糖体DNA定量分析。(C)M. rileyiΔMrE22OMrE22O组成型表达(MrE22OOE)菌株致死的 S. litura 尸体上分生孢子的定量分析。(D)感染后120 h,指示真菌菌株感染的幼虫宿主肠道总细菌集落形成单位(CFUs)。
 
6 B. bassianaMrE22O的表达导致菌株能够降低宿主20E的浓度并抑制宿主免疫相关基因的表达,从而导致真菌毒力的总体增加

为了分析B. bassianaMrE22O的表达对宿主20E水平的影响,将Bb::MrE22O-8菌株用于以G. mellonella幼虫为宿主的局部感染。定量分析了野生型B. bassianaBb::MrE22O-8侵染G. mellonella中的ecdysone水平发现,相比于野生型亲本,表达Bb::MrE22O-8的菌株在整个感染过程中使ecdysone水平降低(25%–50%)。与野生型相比,包括GmPGRP-AGmPGRP-BGmGloGmGalGmFerGmGSTGmCec在内的一套与G. mellonella免疫相关基因的表达均显示出降低趋势(GmGST除外)。昆虫生物实验结果显示,MrE22O在B. bassiana中的显著表达(P < 0.01)提高了真菌毒力以对抗G. mellonella幼虫,宿主的半数致死时间(LT50)和杀死宿主所需的半数致死浓度(LC50)降低。与野生型菌株相比,Bb::MrE22O-8的LT50相对于G. mellonella降低了30%(即更具毒性)。接种后5天, Bb::MrE22O-8菌株的平均致死浓度也降低了12倍,LC50取值为(17.3±3.0)×106分生孢子/ ml(Bb::MrE22O-8)到(1.45±0.23)×106(野生型亲本)之间。正如在表达MrE22OM. rileyi菌株中观察到的,MrE22OB. bassiana中的表达还引起被感染G. mellonella中细菌载量的增加和尸体上真菌生长的延迟。

 

图6. B. bassianaMrE22O的表达对宿主的影响。MrE22O表达 B. bassiana 侵染的G. mellonella幼虫中ecdysone浓度及宿主基因表达分析。野生型B. bassiana菌株(WT)及MrE22O表达型B.bassiana菌株通过局部注射侵染 G. mellonella 幼虫。(A)宿主血淋巴中的20E浓度。(B-H)基于总RNA提取的GmPGRP-A, BGmGloGmGalGmFerGmGSTGmCec基因的RT-PCR分析。*表示P <0.05,**表示P < 0.01,ns表示t检验不显著。

图7. B. bassiana中MrE22O的表达增加了真菌毒力,但减少了尸体上真菌的生长。(A)B. bassianaBb-MrE22OOE的昆虫生物实验分析(G. mellonella幼虫作为宿主)。(B)B. bassiana菌株感染96h后G. mellonella幼虫宿主中的总细菌数分析。(C)头孢菌素抑制G. mellonella幼虫的肠道菌群生长。(D)死后4天尸体上真菌生长的代表性图像。

讨论

 
昆虫激素(JH和蜕皮甾类激素20-hydroxy-ecdysone (20E)等)在调节昆虫各种生理过程(包括昆虫的发育,生长,繁殖,衰老和免疫力)中起着重要作用。我们的研究表明,昆虫利用20E作为信号分子来上调免疫相关基因的表达来响应真菌的感染,M. rileyi产生MrE22O转化20E使其失活。M. rileyi的体外蜕皮甾类激素失活活性已被报道,然而该酶的生物学作用和产生的后果尚未鉴定。MrE22O可以抑制昆虫的防御反应,增强真菌的毒性。MrE22O的存在促进感染的宿主免疫抑制的效果使宿主微生物组发生变化,同时也最终改变了病原体。宿主免疫系统受到抑制,肠道细菌微生物组发生变化,可能导致真菌在尸体上定殖和形成孢子的能力/速率降低,进一步证实了尸体上的生长是寄生生命周期的重要且离散的阶段,有助于昆虫病原真菌的适应性。由于孢子形成被认为是整体适应性的关键因素,因此孢子减产会带来很大的不利影响。MrE22O在感染初期赋予了益处,但在尸体上分生孢子的生产期间产生不利影响。这有助于解释为什么E22O基因在昆虫致病性真菌中分布不广泛。
尽管昆虫似乎使用20E作为信号分子来诱导免疫相关基因的表达,但在昆虫病原真菌中,靶向20E似乎是一种受限制的现象,即缺少E22O基因不会使 B. bassiana 成为比M. rileyi更弱的病原体。然而 M. rileyi  MrE22OB. bassiana中的变异表达抑制20E水平,进而降低了宿主防御性免疫相关途径的激活,最终提高了转基因菌株的毒力。权衡是显而易见的,并且与野生型亲本菌株相比,表达MrE22O B. bassiana 菌株在宿主尸体上的分生孢子减少。因此,需要进一步使M. rileyi具有更明显的生态学优势,这可能与寄主的范围和可用性,以及环境因素和/或与其他微生物的竞争有关。
尽管(致病性)真菌诱导20E水平升高的途径尚待确定,但数据显示灭活真菌细胞以及细胞壁成分能够诱导增加的20E水平,因此该过程可能是由模式识别受体介导的。从B. bassiana异源表达的结果可以看出,MrE22O基因在提高昆虫病原性真菌效力方面具有潜在应用性,从而增加可用于改善昆虫病原性真菌毒性的策略。另外,通过靶向关键宿主激素,可以降低目标宿主对生物防治剂产生抗药性的可能性。
 

结论


总而言之,该研究表明,M. rileyi在表达靶向宿主ecdysone激素失活酶方面已进化出一种特定的适应性。赋予病原体优势的机制之一可能是通过阻断ecdysone对先天免疫途径的激活。然而,通过干扰正常的免疫功能,会引发宿主微生物组的改变,从而导致宿主尸体上的分生减少。因此,MrE22O基因是拮抗多效性的示例,在真菌(致病性)生命周期的早期提供益处,在后期阶段致害。
本文由作者自行上传,并且作者对本文图文涉及知识产权负全部责任。如有侵权请及时联系(邮箱:nanxingjun@hmkx.cn
关键词:
蜕皮甾类,病原体,真菌,激素,昆虫,侵染,菌株

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