一鸣惊人:反转录子基因编辑,超越CRISPR,谱写基因编辑新篇章

2021
05/03

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生物世界
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RLR是一种更简单,更灵活的基因编辑工具。


撰文 | 王聪
编辑 | nagashi
排版 | 水成文

细菌噬菌体之间的军备竞赛导致细菌发展出了精妙的防御系统,近年来生命科学领域最大的突破——CRISPR基因编辑技术,正是从细菌的防御系统发展而来。

实际上,细菌除了CRISPR之外,还有其他防御系统,2020年11月5日,以色列维茨曼研究所的 Rotem Sorek 团队在 Cell 发表论文证实一种名为反转录子(Retron)的细菌的遗传元件同样也是细菌抵抗噬菌体的防御系统。

那么,反转录子(Retron)能否像CRISPR一样,被开发成强大的基因编辑工具呢?

2021年4月27日,哈佛医学院乔治·丘奇(George Church)团队在 PNAS 期刊发表了题为:High-throughput functional variant screens via in vivo production of single-stranded DNA 的研究论文。


乔治·丘奇团队创建了一个基于反转录子(Retron)的基因组编辑新工具,并将其命名为Retron Library Recombineering(RLR)。


该新型基因组编辑工具更简单、更灵活,可同时产生数百万个突变,通过给这些突变细胞打上“条形码”,可用于进行高通量功能筛选,可超过CRISPR-Cas技术支持的功能筛选的规模和特异性,而且避免了CRISPR基因编辑时经常观察到的毒性,并提高了研究人员探索基因组水平突变的能力。



反转录子的发现

上世纪80年代,研究土壤细菌的研究人员困惑地发现,许多单链DNA短序列散布在细菌的细胞质中。1984年,约州立大学石溪分校的 Thomas Yee 等人最早在 Cell 论文中提到了这一发现。

紧接着,研究人员发现每一个DNA片段都会与带有互补碱基序列的RNA相连,这使得他们意识到一种叫做逆转录酶的酶从附着的RNA中合成了DNA,并由此形成了一个由RNA、DNA和酶组成的复合体。随后科学家们发现这一复合体即是 反转录子 (Retron)。

直到36多年后的2020年,以色列维茨曼研究所的 Rotem Sorek 团队在 Cell 发表论文, 首次解析了反转录子 (Retron) 的功能,证实其是细菌抵抗噬菌体的防御系统


反转录子的基因编辑潜力

反转录子(Retron) 会通过逆转录产生单链多拷贝卫星DNA (msDNA) ,有研究表明,msDNA可以充当重组供体,在基因组中进行基因编辑。这种编辑方式与CRISPR不同,不需要额外的向导 (guide) 反转录子 的另一个吸引人之处在于它们的序列本身可以用作“条形码”,以识别细菌池中的哪些个体已接收到反转录子序列,从而可以更快地汇总筛选精确创建的突变菌株。

当研究人员了解到 反转录子 CRISPR系统类似,是细菌中的一种防御系统后,基于反转录子 的基因组编辑开始吸引越来越多的目光。

到目前为止,基于反转录子的基因组编辑系统效率还很低,且不能在在哺乳动物细胞中发挥作用。尽管如此,反转录子在基因组编辑应用中仍显示出独特的优势。

反转录子重组

如下图所示,将含有目的突变 黑色 反转录子序列 红色 逆转录酶 (RT) 一起导入细胞,然后反转录子产生单链DNA,借助于单链退火蛋白 (SSAP) ,携带目的突变的单链DNA被整合进复制产生的子代细胞的基因组中。

反转录子重组原理图

为了提高效率,研究团队对细菌进行了修改,首先,使细菌细胞的天然错配修复机制失活,然后敲除了两个编码外切核酸酶的基因,这些修改极大地增加了反转录子整合到基因组中的比例,效率高达90%以上

然后,研究团队使用基于反转录子 (Retron) Retron Library Recombineering RLR 对大肠杆菌进行了验证,证实RLR具有足够的灵敏性和精确度,能够检测到大肠杆菌由非常相似的突变导致的耐药性的微小差异

更重要的是,通过对整个细菌库中的反转录子进行测序,而不需要对单个突变体进行分离和测序,就能够收集这些数据,可以极大地加快研究过程。

然后,研究团队继续推进RLR向前迈进,以查看它是否可以用于随机片段化的DNA,并找到一次可以使用多少个录子。研究团队“切碎”了一种具有高度耐药性的大肠杆菌菌株的基因组,通过反转录子质粒文库,能够一次性快速生产和筛选数百万个可追踪的DNA突变,相当于同时进行几百万次实验,能够观察到整个基因组突变的影响,以及这些突变之间如何相互作用。


跨越CRISPR

使用CRISPR-Cas9基因编辑,可以发现和切割特定的DNA片段,然后利用细胞的系我修复,实现对基因的精确编辑,但这一过程比较复杂,而且Cas9还可能出现脱靶,导致细胞毒性。

重组 技术同样可以实现基因编辑,将含有所需突变的单链DNA和单链退火蛋白 (SSAP) 导入正在分裂复制的细胞内,就可以将突变引入子代细胞中,可以在不破坏细胞DNA的情况下有效产生基因突变,这种基于重组的方法更简单,可以在许多细胞中使用以创建复杂的突变库。但是,要弄清楚这些突变的作用是什么,就需要对每个突变体进行分离、测序和表征,这是一项几乎不可能完成的工作。

而现在, 乔治·丘奇 (George Church) 团队开发的这个名为  RLR 的新型基因编辑工具,使上述不可能完成的任务变得更加容易。

RLR使我们能够进行CRISPR不可能完成的工作,构建远超CRISPR的筛选文库,并使用它们同时筛选数百万个序列,从而轻松生成和分析大量数据。

总的来说, RLR是一种更简单,更灵活的基因编辑工具,可用于高度多重实验,消除了CRISPR基因编辑时经常观察到的毒性,并提高了研究人员探索基因组水平突变的能力。

论文链接:
https://doi.org/10.1016/0092-8674(84)90541-5
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(20)31306-4
https://www.pnas.org/content/118/18/e2018181118


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关键词:
基因组,录子,反转,谱写,细菌,细胞,序列

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