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科研 | ISME：链霉菌孢子的顺风车——活动的土壤细菌

2021

05/02

微生态

A-

A+

一些链霉菌对植物根系的定殖改善了植物的健康和性能并以自然和可持续的方式进行。

导读

链霉菌是一类固着细菌，可产生影响微生物群落行为的代谢物。新兴的研究表明，链霉菌孢子能通过各种机制分布，但尚不清楚如何将孢子运输到它们喜好的环境中，如植物根部。在本文中，我们证明了链霉菌的孢子能利用其它土壤细菌的运动机制。运动分析和显微镜研究表明，链霉菌的孢子通过与革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的鞭毛相互作用而运输到植物组织中。遗传学实验表明，孢子外壳上的结构蛋白能够促进这种运动形式。这些结果表明，无运动细菌能够利用其它微生物的运动机制来完成其生命周期中的必要阶段。

论文ID

原名：Microbial hitchhiking: how Streptomyces spores are transported by motile soil bacteria

译名：微生物搭便车：链霉菌孢子是如何被活动的土壤细菌运输的

期刊：The ISME Journal

IF：9.180

发表时间：2021.3.15

通讯作者：Ariane Briegel

通讯作者单位：荷兰莱登大学系统生物学研究所，微生物细胞生物学中心

实验设计

结果

1 枯草芽孢杆菌传播天蓝色链霉菌孢子

通过将分离的Sc孢子与Bs的液体培养物混合，然后接种到琼脂群集平板上并孵育，证明了Bs对Sc孢子的转运。5天后，在平板上可见Sc菌落，并且在所有测试样品中菌落仅在样品存在Bs时分散（n=13）（图1A）。孢子通过Bs散布到整个平板表面和平板边缘（距离接种点4.5 cm）。为了证明Sc孢子是被Bs细胞移动的，而不仅仅是漂浮在扩张的Bs菌落中，我们进行了相同的实验，但将Sc孢子和Bs培养物分别接种到平板的不同区域。生成的Sc菌落在整个平板上形成条纹，并且该条纹在所有测试样品中均以可预测的方式从Bs接种位点散发出（n=10）（图1B）。在12 cm平板上重复实验，并证明Sc孢子分散在距孢子萌发点10 cm的平板边缘（n=3）（图S1A）。为了确定运输的效率，该实验是用稀释的Sc孢子进行的，以便Sc菌落的总数可以无重叠地萌发，并可以单独计数。结果表明，在这些条件下，86±5.6%的表观菌落位于初始接种点外（n=4）（图S1B）。

2 枯草芽孢杆菌将天蓝色链霉菌孢子转运至植物组织

在自然界中，Sc和Bs会在产生分泌物的植物根部附近茁壮繁衍，但只有Bs才能移向根系。我们进行了实验来确定Bs是否能将Sc孢子运输到植物组织中。单独使用Bs菌株进行的实验表明，在植物组织周围区域，平板上的Bs细胞变得“浑浊”，这可能是由于存在有利于细菌生长的营养性植物分泌物（图1C）。像以前的实验一样，除非将Sc孢子与Bs细胞共同接种，否则单独的Sc孢子不会表现出运动，并且分散的孢子在所有情况下都优先在植物组织附近建立菌落（n=5）（图1C）。

图1.天蓝色链霉菌孢子由枯草芽孢杆菌运输。A当Sc和Bs接种在群集平板的中心时，可见的Sc菌落（白点）很明显，并且仅在有能动的Bs的情况下分散。左：Sc与Bs。中：仅Sc。右：仅Bs。B 当Sc和Bs在群集平板上的不同位置接种时，Sc菌落分散在Bs细胞的群集方向（黑色箭头）。星号表示Bs接种位点。C Bs将孢子移向植物组织。左：Sc与Bs。中：仅Sc。右：仅Bs，星号表示Bs接种位点。

3 孢子的散布发生在群集和滑动的Bs菌株

Bs有两种鞭毛介导的运动模式：游动和群集，分别发生在液体环境和固体表面。当Bs感觉到它在固体表面上时，它将分化成一个游动孢子细胞，这个细胞的鞭毛数量显着增加，并产生疏水性表面活性剂，如表面活性素，从而有效地散布在整个表面上。在我们的实验中，我们使用了一种未经鉴定的可群集的Bs菌株（NCIB3610），与普通实验室菌株不同的是，普通实验室菌株缺乏分化为群集细胞的能力，也不能产生表面活性物质来进行群集运动（表S1）。为了确定Sc孢子是否通过群集和游动运动进行运输，我们用实验室培养的不能群集的Bs菌株重复了实验，在琼脂游动平板（0.27%琼脂）上没有发生孢子运输（图2A和S2）。重要的是，除了群集能力不足之外，实验室培养的菌株还积累了许多遗传缺陷。为了确保孢子散布的减少是由于细菌游动的限制，我们使用了一种具有未驯化遗传背景但已进行遗传改造的Bs菌株，因此它只能游动（ΔepshsrfAA，DK1484）。与实验室培养的菌株一样，该菌株不会将Sc孢子分散在游动平板上（图2A和S2）。因此，我们认为孢子运输是通过群集运动而不是游动来完成的。

除了鞭毛运动外，Bs还可以在表面滑动。为了确定孢子是否可以通过滑动分散，我们利用了一个具有鞭毛但鞭毛无法旋转的Bs突变体（ΔmotAB，DS222），以及一个没有鞭毛的突变体（Δhag，DS1677）。ΔmotAB菌株将孢子移动到所有样品的整个表面和琼脂平板的边缘（距离接种点4.5 cm）（n=6）（如2B和S2）。由于菌落重叠导致平板上有明显的涂抹，因此无法确定分散孢子的数量，但每个平板包含100多个分散的Sc菌落。Δhag菌株的散布明显减少，平均有3.2个孢子在距离接种点0.95±0.85 cm的平均最大距离处进行运输（n=6）（图2B、S2和S3）。因此，我们推测孢子散布也可以通过滑动发生，但鞭毛的存在有助于孢子散布（图2C）。作为额外对照，我们还首先将Bs细胞散布在平板表面上，然后再在中心接种Sc孢子来进行这些实验。与在平板中心共接种相比，Bs WT（2.06±0.05 cm）和ΔmotAB（1.25±0.16 cm）菌株的孢子散布显著减少（图S2和S4）。这些数据表明，Sc孢子是由Bs细胞运输的，Bs细胞不断地远离接种点，并且在能动的Bs覆盖平板表面后停止运输。

图2.枯草芽孢杆菌可以通过群集和滑动来运输孢子。AWT（群集菌株）能在琼脂平板上运输孢子（0.27-0.5%）（n=13），但仅游动菌株（实验室培养的WT菌株或ΔepsH srfAA）不能（0.25-0.3%琼脂）（分别为n=6和n=8）。结果的量化如图S2所示。B 具有鞭毛但缺乏鞭毛运动能力的BsΔmotAB菌株可以通过在WT水平滑动来分散孢子（n=6）。没有鞭毛的BsΔhag菌株不能通过在WT水平滑动来分散孢子（n=6）。结果的量化如图S2所示。所有Δhag平板如图S3所示。C 总之，孢子以鞭毛依赖的方式被群集（WT）和滑动（ΔmotAB）Bs细胞分散。但是，孢子不会通过游动（实验室培养或ΔepsHsrfAA）分散，在没有鞭毛的情况下通过滑动分散明显较少（Δhag）。

4 天蓝色链霉菌孢子附着在枯草芽孢杆菌鞭毛上

我们利用多种显微镜方法阐明了Bs散布Sc孢子的机制。荧光标记的Sc孢子在荧光显微镜下成像，并如预期的那样不能游动（补充视频1）。然而，当Bs细胞被添加到荧光孢子中时，这些孢子会定位在Bs细胞极点附近（补充视频2和图3A）。在某些情况下，孢子在载玻片表面上是静止的，并且可以看到一个相关的Bs细胞围绕孢子旋转（视频1）。在这些实验中观察到的Bs细胞旋转，让人联想到鞭毛被化学固定在固体表面的Bs细胞中的旋转，凭此固定鞭毛产生的扭矩来诱导细胞体旋转。该观察表明，Sc孢子直接附着在Bs鞭毛上，因此在这些情况下，它们有效地模拟了鞭毛系链。为了证实Sc孢子不直接与Bs细胞体相互作用，我们用冷冻电子显微镜对Sc孢子和Bs细胞的混合物进行了成像。与荧光显微镜图像一样，Sc孢子位于Bs细胞极点附近，但不与Bs细胞体直接接触（图3B和S5A）。总共约77%的孢子位于Bs细胞1 μm以内（n=35孢子）。为了确定孢子是否与Bs鞭毛相互作用，我们使用了一种Bs“小细胞”菌株（minD：：TnYLB），该菌株缺乏抑制其直接可视化的排泄物。事实上，当与Sc孢子混合时，在二维冷冻电镜图像中可以看到鞭毛与孢子共定位（图3C和S5B）。

通过荧光显微镜观察Sc孢子与剪切鞭毛的混合物，进一步证实Sc孢子与Bs鞭毛的粘附。使用在单个鞭毛蛋白残基（T209C）中突变的Bs菌株（DS1919）对Bs鞭毛进行荧光标记。表面暴露的硫醇可直接使用具有反应性马来酰亚胺基团的染料进行标记。这种染料也标记了Sc孢子外壳表面的蛋白质。事实上，当剪切的Bs鞭毛被分离并与孢子混合，并且将不相关的鞭毛从混合物中洗掉时，大多数孢子仍然保留了相关鞭毛。总共约有64％的孢子与鞭毛有关（n=130孢子）。在某些情况下，能观察到大孢子“团块”缠绕在鞭毛中（图3D和S5C）。相比之下，没有添加孢子的鞭毛不会形成聚集体而会随机分散（图S5C）。

图3.显微镜观察法表明Sc孢子直接附着在Bs鞭毛上。A 用荧光显微镜观察未标记的Bs细胞标记的孢子，结果表明孢子定位于Bs的细胞极点。B 混合的Sc孢子和Bs细胞的冷冻电镜样品显示，孢子不直接粘附在Bs细胞体上。C 冷冻电镜显示Bs鞭毛与Sc孢子外壳共定位。D 染料标记的剪切鞭毛和孢子的荧光显微镜结果显示，孢子直接与Bs鞭毛相互作用，形成两种成分的扩展关联。

5 搭便车保存于链霉菌中

为了确定其他链霉菌中是否也存在由Bs传播的孢子，我们对Streptomyces tendae（St）、Streptomyces griseus（Sg）、Streptomyces scabies（Ss）和Streptomyces avermitilis（Sa）进行了Bs群集平板分析。为了量化孢子扩散，我们进行了群集平板试验，在平板中心（直径9cm）接种Bs细胞，并在Bs接种点周围的四个等距位置接种分离的孢子。测定了四个孢子样品的最大散布距离，即从孢子接种部位中心到最远的分散菌落的距离。野生型（WT）Sc孢子被Bs分散在100%的样品中，并从初始接种点（n=20）移动的平均最大距离2.67±0.43cm。同样，这些分析表明，St（n=12）、Sg（n=8）和Ss（n=8）孢子在100%样品中分散，其距离与WT Sc孢子的距离相似。然而，Sa孢子分散的距离明显较短（n=12）（图4A，B），并分散在83%的样品中。由于Sc和Sg的最后一个共同祖先存在于2亿多年前，并且两个物种都具有搭便车的能力，因此这些数据表明，这两个物种的祖先也具有这种扩散机制，并仍然保留下来。

6 罗德林（rodlin）蛋白促进了枯草芽孢杆菌的孢子扩散

大多数链霉菌孢子的外表面都有一个纤维状小棒层，这是一个由罗德林蛋白组成的成对排列的小棒状条纹图案。Sc和Ss孢子的扫描电子显微镜（SEM）图像显示了横条状的小棒状细胞层（图4C）。在以前的研究中，Sc、S.lividans、St、Sg和Ss的小棒在视觉上无法区分。利用本研究和先前研究的电子显微镜图像，我们测量了这些物种中小棒的间距，其高度保守且约为20nm（从小棒纤维中心测量时）（表S2）。此外，尽管该物种具有远距离的进化关系，但来自Sc、St和Sg的罗德林蛋白仍具有约34%的序列同源性（图S6）。

有趣的是，Sa孢子比其他链霉菌的分布范围要小，而且它是唯一一种天生缺乏罗德林蛋白的受试菌株。与此一致的是，缺乏罗德林蛋白的Sc突变株（ΔrdlAB）能消除Bs的搭便车行为（n=3，图S2和S7）。重要的是，以前的研究表明，与WT菌株相比，ScΔrdlAB菌株在萌发过程中没有延迟，并且除了小棒层外，没有表现出任何行为或表型变化。相反，缺乏在链霉菌（ΔcslA和ΔmatAB）表面产生多糖的蛋白质的Sc突变体不受影响（n=3，图S2和S7）。然而，在ΔrdlAB菌株中，孢子扩散并没有完全消除。使用上文所述的相同群集平板分析，ΔrdlAB菌株分散在距离初始接种点0.46±0.82cm的平均最大距离处，并且在33％的样品中发生扩散（n=24）（图2）。

为了表征罗德林蛋白如何在三维空间与鞭毛相互作用，我们对含有Bs小细胞和Sc孢子的样品进行了cryo-ET实验。重组结果表明，Sc孢子呈椭圆形，并具有厚的被膜。小棒层可以看作是孢子侧面的鞘，边缘呈磨损状态，使极点暴露在外，这表明小棒鞘很容易从细胞体剥落（n=22）（图4D）。在白色链霉菌中也观察到类似的孢子形态。Bs鞭毛聚集在小棒层周围并直接与小棒层相互作用（n=12）（图4E、F和视频2）。但是由于孢子的厚度，分辨率有限，我们无法推断鞭毛是否优先结合了棒状层的特定特征。总的来说，这些数据表明小棒层通过直接与鞭毛相互作用来促进孢子的扩散。

图4. 罗德林蛋白的存在促进了链霉菌孢子的搭便车行为。A 用野生型（WT）链霉菌孢子（S. coelicolor n=20，S. tendae n=12，S. griseus n=8，S. Scabies n=8， S. avermitilis n=12）和缺乏罗德林蛋白的Sc孢子（ScΔrdlABn=24）表明，孢子分散在所有测试的野生型物种中，但S. avermitilis的分散距离最短，并且由于Sc中罗德林蛋白的丧失而使分散消失。结果表示为分散距离的平均值±平均值的标准误差。采用双尾零假设显著性检验，ScΔrdlAB和Sa的扩散与WT Sc、St、Sg和Ss菌株的差异具有统计学意义（p<0.05）。B 来自A的Bs/孢子群集平板的代表性图像。Bs接种位置用星号表示。C WT Sc孢子的EM显示小棒层具有20 nm间距的成对小棒。D 分离的Sc WT孢子的代表性cryo-ET图像显示，小棒层不覆盖整个孢子，而是使极点暴露在外（n=22）。E Cryo-ET重建显示鞭毛优先与小棒层相互作用（n=12）。比例尺100 nm。F 从E重建的分割片段清楚地表明了鞭毛：罗德林蛋白相互作用。孢子体：绿色，小棒层：紫色，鞭毛：黄色。比例尺100 nm（在线彩色数字）。

7 天蓝色链霉菌孢子的搭便车行为不限于芽孢杆菌

虽然枯草芽孢杆菌在土壤中普遍存在，但其他属也有鞭毛，也可能有助于Sc孢子的散布。因此，我们用荧光假单胞菌WT株（R1SS101）进行了群集平板试验，该菌株也与植物根系天然相关。重要的是，Pf的孢子散布与Bs相似，但Sc菌落的出现模式让人想起假单胞菌群模式（n=6）（图S8）。这些数据表明，搭便车是一个广泛的机制，可使链霉菌的孢子在厘米级分散（图5）。

图5.搭便车模型概述。气生链霉菌的孢子通过直接附着在运动细菌的鞭毛上（插图），在厘米尺度上被运输到植物根系。在这里，孢子萌发并产生抗生素（红色梯度）来抵御微生物竞争者（在线彩色图）。

讨论

固着链霉菌有一个复杂的生命周期，涉及形成分化为孢子的气生菌丝。包括Sc在内的一些链霉菌的孢子通过直接附着在昆虫和线虫上而在很长的距离上散布。有趣的是，最近的报告发现链霉菌分泌的特定挥发性代谢物吸引节肢动物作为孢子扩散的机制，它们可以诱导链霉菌“探索者细胞”的形成，同时使微生物竞争者挨饿。但是，目前尚不清楚孢子是如何以厘米级的方式特别地分散到植物根系微环境中。在这里，我们证明了链霉菌孢子能直接附着在鞭毛上并利用土壤微生物的运动机制。虽然这些实验证明在忽略目的地的情况下，Sc孢子能被Bs和Pf散布，但是这些运动细菌也被认为与植物根部有关。因此，这种被称为搭便车的散布机制，可能为链霉菌孢子提供了一种转移到有利环境的机制。事实上，用拟南芥进行的分析表明，Bs可以将Sc孢子运输到植物组织中。这样可使孢子在营养丰富的植物渗出液附近萌发，生成可产生抗生素的丝状菌落，从而保护植物免受潜在的植物病原体的侵害。

两种孢子外壳蛋白RdlA和RdlB促进了搭便车行为，它们存在于大多数链霉菌中。这些蛋白质在孢子的外表面组装成成对排列的细丝，称为小棒，间隔约20 nm（表S2）。到目前为止，小棒的功能仍然是难以捉摸的。有趣的是，细菌鞭毛丝的直径也约为20 nm。因此，小棒层有可能为鞭毛提供一个紧握的表面，鞭毛被“包裹”在由罗德林蛋白形成的凹槽中，从而促进孢子的运输。然而，由于全细胞重建的分辨率有限，我们的cryo-ET数据不能支持这种推测。因此，目前仍不清楚小棒层的哪些特性能促进与鞭毛的相互作用。

新兴研究表明，鞭毛优先与疏水表面相互作用，鞭毛蛋白可以进行甲基化以增加鞭毛的疏水性。疏水性的增加使得病原菌能够粘附在宿主细胞上，而鞭毛对植物细胞的粘附也与建立定殖有关。鞭毛的疏水性可促进与疏水性孢子的相互作用，并可解释在没有罗德林蛋白的情况下可见的孢子运输，因为没有罗德林蛋白的孢子表面仍然是疏水的（在Sa WT和ScΔrdlAB菌株中）。因此，促进附着到植物根上的鞭毛相互作用也可能有助于粘附到孢子上，并需要运动细菌不进化来消除这种相互作用。由于孢子：鞭毛的相互作用在一定程度上是由疏水相互作用促成的，因此这种运输方式可能会受到影响范德华筛选距离的环境因素的影响，如盐浓度和pH。

尽管孢子搭便车对活动伙伴似乎不利，但先前的研究表明真菌菌丝可以形成所谓的“真菌高速公路”，为运动的细菌在气隙(如土壤中的气隙)上架起桥梁。与真菌一样，链霉菌形成结构类似真菌菌丝的气生菌丝。因此，链霉菌可能能为其运动伙伴形成“细菌桥”，但这种相互作用尚未报道。如果这种“细菌桥”真的形成，这将为系统提供一种以前在非运动真菌孢子和运动细菌之间观察到的协同运输。

搭便车模型得到了先前研究的支持，该研究检测了另外两种根部定殖微生物的相互作用：非移动真菌Af和运动细菌拟杆菌旋涡（Pv）。Af孢子通过直接附着在鞭毛上而被Pv以群集依赖的方式分散；向Af孢子外壳中添加过量的纯化Pv鞭毛或扰动能消除散布。此外，扫描电镜照片显示Pv鞭毛和Af孢子直接接触。尽管这项研究没有确定粘附在鞭毛上的孢子衣成分（s），但曲霉菌的孢子也具有小杆棒层。此外，这项研究表明，一些青霉菌也可以通过Pv运输，这些真菌具有小棒层。总的来说，这些数据可能表明，孢子通过形成一个有条纹的小棒层搭便车到运动的细菌上是一种扩散机制，它在生命的两个领域中共同的进化。

结论

一些链霉菌对植物根系的定殖改善了植物的健康和性能并以自然和可持续的方式进行。因此，我们的数据适用于旨在改善链霉菌根部定植的土壤条件的工业举措。同样，许多曲霉菌，例如Af和A.niger，是人类和植物的病原体。因此，对这些固着生物搭便车的研究可能阐明未知的感染机制。