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温州大学 | FOOD FUNCT：羊栖菜岩藻聚糖硫酸酯在缓解2型糖尿病小鼠高血糖症过程中改变肠道微生物群和肠道代谢物

2021

04/30

微生态

A-

A+

这项工作证明了SFF通过改善胃肠健康来调节其对糖尿病的有益作用的潜在机制。

导读

2型糖尿病(T2DM)是一种复杂的代谢紊乱，现在被认为是一个主要的全球公共卫生问题。岩藻依聚糖具有多种生物活性，尤其是预防代谢性疾病。在此本研究旨在揭示羊栖菜岩藻聚糖硫酸酯(SFF)对高脂饮食(HFD)和链脲佐菌素(STZ)诱导的T2DM小鼠的有益作用。研究者注意到，一方面，SFF显著降低空腹血糖、饮食和水的摄入量以及高脂血症，而另一方面，SFF改善了葡萄糖耐受量。此外，在糖尿病小鼠中，SFF减少了附睾脂肪沉积，减轻了心脏和肝脏组织的病理变化，并减少氧化应激。为了探索这些改善作用的潜在机制，对肠道微生物群进行了分析。值得注意的是，SFF高度富集良性微生物，包括拟杆菌、粪肠球菌和布拉氏菌，并且在糖尿病小鼠结肠中增加了左旋肉碱和胆碱的水平，这可能是缓解T2DM的一个潜在机制，因此暗示SFF作为T2DM治疗的辅助药物的益处。综上所述，本研究证明了岩藻聚糖作为一种佐剂在T2DM未来管理中的应用前景。

论文ID

原名：Sargassum fusiforme fucoidan modifies gut microbiota and intestinal metabolites during alleviation of hyperglycemia in type 2 diabetic mice

译名：羊栖菜岩藻聚糖硫酸酯在缓解2型糖尿病小鼠高血糖症过程中改变肠道微生物群和肠道代谢物

期刊：Food & Function

IF：4.171

发表时间：2021.03

通讯作者：佟海滨，吴明江

通讯作者单位：温州大学生命与环境科学学院

实验设计

1 建立HFD/STZ诱导的2型糖尿病小鼠模型。

2 为了SFF对HFD/STZ诱导的糖尿病小鼠的抗糖尿病作用，将驯化一周后小鼠被分成两组，对照组小鼠（喂食正常的食物）和处理组小鼠（喂食HFD配方（68.5% AIN-93食物，20%猪油，10%蛋黄粉，1%胆固醇和0.5%胆酸钠））8周以使小鼠产生外周胰岛素抵抗。禁食一夜后，通过腹膜内给HFD喂养小鼠注射单剂量新鲜制备的STZ溶液[40 mg/kg 体重(BW)]。STZ注射后第7天测定空腹血糖(FBG)水平。注意：FBG水平在11.1至33.3 mm之间的小鼠被认为是糖尿病小鼠，需要进一步研究。患有T2DM病的小鼠被分成两组，一组被给生理盐水(DC组，n = 8)，另一组被给SFF(100 mg/kg BW) (DC+SFF组，n = 8)。对照组给一定剂量的生理盐水(对照组，n = 8)。盐水和SFF通过每天一次胃内注射给药，持续四周。在实验期间每周检测体重、食物摄入量、水消耗量和FBG。

3 为了探讨SFF对肠道微生物群落的影响,进行了16S rRNA扩增子测序以确定肠道微生物群落组成的变化。

4 为了确定NC、DC和DC+SFF组中的特定细菌分类群，研究者进行了线性判别分析(LDA)来比较每组微生物群的组成。

5 为了进一步探索SFF潜在功效的可能机制，对从小鼠结肠收集的内容物进行代谢组学分析。

结果和讨论

1 SFF可缓解糖代谢和血脂紊乱

在这里经典T2DM模型是通过高脂肪饮食(HFD)喂养诱导胰岛素抵抗，然后低剂量链脲佐菌素(STZ)注射致使β细胞轻度功能障碍，但不完全损害胰岛素分泌。以前的研究表明，与正常小鼠相比，糖尿病小鼠出现体重下降，食物和水摄入增加的症状，这些症状通过羊栖菜岩藻聚糖硫酸酯(SFF)治疗得到缓解。用SFF处理糖尿病小鼠第4周，其食物摄入和水摄入在两组中呈显著差异(P < 0.05)(图1A和B)，因此，SFF治疗显著减少了糖尿病小鼠的多饮和多食。

如前人所述，在最初的一周，糖尿病小鼠的体重几乎与正常小鼠相同，这可能是由于注射了STZ进而导致了前者的体重减轻(图1C)。在接下来的4周内，正常对照组小鼠的体重稳步增加，而DC组小鼠的体重变化趋势相反。此外，在DC+SFF组中，4周期间体重损失显著低于DC组，这意味着给药SFF可能对糖尿病小鼠的体重控制有潜在影响。

T2DM是一组代谢综合征，其标志是血糖水平升高。在糖尿病综合治疗期间，空腹血糖(FBG)和血浆葡萄糖浓度被用于快速诊断2型糖尿病。在这项工作中，在4周治疗期间每周监测FBG。如图1D所示，在第0周(诱导糖尿病后1周)，DC和DC+ SFF组的糖尿病小鼠的FBG明显高于NC组的正常小鼠。值得注意的是，在SFF干预开始后，DC + SFF组的FBG值呈现逐渐下降的趋势，从第3周开始显著低于DC组(P < 0.05)。此外，IPGTT的结果(图1E)和超过120分钟的血糖曲线下面积(AUC)(图1F)表明，在口服葡萄糖后，SFF能够抑制这些糖尿病小鼠血糖水平的增加，这显著改善了(P < 0.05)它们的葡萄糖耐量。总的来说，这些发现表明SFF可以有效地改善由HFD/STZ引起的糖尿病小鼠的病理症状。

众所周知，糖尿病患者经常伴有血脂异常，这导致血浆TC、TG和LDL-c的积累，以及血浆HDL-c的降低。具体而言，血脂异常被认为是心血管疾病的主要危险因素，而血脂谱是T2DM心血管风险的重要因素。同样，与健康小鼠(正常对照组)相比，糖尿病小鼠(DC组)的总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇水平也较高(表1)。然而，与盐水处理的小鼠相比，给予SFF的糖尿病小鼠显示出TG水平显著降低，HDL-c水平升高。总之，这些结果证明了SFF对T2DM的潜在改善作用。

图1 SFF缓解HFD/STZ诱导的2型糖尿病小鼠的一些糖尿病症状。(A)显示食物摄入量、(B)水摄入量、(C)体重、(D)空腹血糖、(E)IPGTT和(F)曲线下面积。数据表示为平均扫描电镜(n = 8)。^“*”^、^“^**^”^、^“^***^”和^“^***^”分别在P < 0.05、P < 0.01、P < 0.001和P < 0.0001水平上与DC组有显著差异。

表1 SFF对HFD/STZ诱导的糖尿病小鼠血脂水平的影响。

注：数据表示为平均标准差。*表示在*P < 0.05和***P < 0.001水平上与DC组显著不同。

2 SFF改善糖尿病小鼠的病理形态和氧化应激

T2DM和肥胖都与非酒精性脂肪性肝病、心肌病和心血管疾病死亡率上升有关。几项研究强调，长期血液中的高葡萄糖水平会对肾脏和心脏等重要器官造成不可逆转的损害。此外，即使全身脂肪没有总体增加，T2DM病患者异位和内脏脂肪沉积的存在也可能与显著的心脏结构异常有关。在其他地方，脂肪肝被认为是与脂肪组织功能障碍和内脏脂肪沉积相关的异位脂肪的关键特征。因此，在这方面，研究者进一步评估了糖尿病小鼠的组织病理学形态(图2A)。苏木精-伊红染色结果表明，HFD/STZ诱导的糖尿病小鼠附睾脂肪组织中的脂肪细胞比喂NCD小鼠中的脂肪细胞大，而SFF处理显著减小了糖尿病小鼠的脂肪大小，DC组的脂肪细胞数量也远少于DC+ SFF组(图2B)。此外，来自NC组的H&E染色的肝切片显示正常的肝结构包括正常的肝细胞，每个肝细胞具有明确的细胞质、突出的细胞核和核仁。而糖尿病小鼠的一些肝细胞呈现扩大的脂肪空泡以及肿胀的肝细胞。随后，研究者观察到SFF治疗略微减少了这些空泡，并使浸润白细胞和肝脏肿胀的组织病理学改变成正常化。此外，与正常对照组相比，DC组的心脏切片显示出轻度至中度的肌原纤维紊乱，伴有横纹缺失和局灶性变性肌细胞，这将最终导致心脏功能受损。与DC组相比，DC + SFF组在心脏组织中具有不太严重的组织学变化，类似于NC组中反映的情况(图2A)。

图2 SFF减轻糖尿病小鼠的病理变化。(A)附睾脂肪组织、肝脏和心脏样品固定在10%甲醛中，包埋在石蜡中，切片，然后用苏木精和曙红染色进行组织学分析。使用放大倍数为×400(比例尺，50 μm)的Nikon Eclipse Ti光学显微镜获得了苏木精-伊红染色切片的数字图像。(B)使用ImageJ软件定量分析脂肪细胞的数量。数据以平均标准差表示。^“**”表示与DC组显著不同，P < 0.01。

根据文献，糖尿病通常与自由基形成增加或抗氧化防御受损有关。一般来说，在糖尿病的葡萄糖氧化、脂质过氧化和非酶糖化过程中，会持续产生大量自由基。同时，这些自由基可以被抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶(CAT）清除，从而增强抗氧化防御系统的反应。值得注意的是，脂质过氧化的毒性代谢物丙二醛已被强调为代谢性疾病中氧化应激的生物标志物。因此，增强的抗氧化防御系统反映了糖尿病病理状态得到缓解。

肝脏中的抗氧化酶和丙二醛水平如图3所示。研究者注意到，与对照组相比，DC组的丙二醛水平显著升高，而SOD和CAT活性显著降低，这与大量证据表明高脂喂养和STZ注射可间接导致抗氧化能力的巨大损失相一致。研究者还发现，与DC组相比，DC+SFF组的SOD和CAT活性分别提高了34.8%和65.1%。值得注意的是，在糖尿病小鼠中进行SFF治疗可导致MDA水平显著降低(P < 0.05)。综上所述，本研究数据表明，SFF调节氧化应激失衡的能力可能是改善HFD/STZ-诱导糖尿病小鼠症状的重要机制。

图3 SFF改善糖尿病小鼠中HFD/STZ诱导的氧化应激。用试剂盒测定肝匀浆中的丙二醛水平、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性。数据表示为平均扫描电镜(n = 8)。^“*”^、^“**”和^“**”分别在P < 0.05、P < 0.01和P < 0.001水平上与DC组有显著差异。

图4 SFF重塑糖尿病小鼠肠道微生物群的结构。基于V4区进行16S rRNA扩增子测序，以确定肠道微生物群组成的变化。(A)算术平均(门级)的未加权对群法(UPGMA)。(B)拟杆菌门和厚壁菌门的相对丰度。(C)拟杆菌门和厚壁菌门的比例。

3 SFF调节肠道微生物群的组成

以前的研究已经证实，许多代谢紊乱，如糖尿病等，部分与宿主和肠道微生物群之间相互作用的不平衡有关。临床前T2DM患者的肠道微生物群显示出细菌和功能多样性降低以及群落稳定性低的特征。例如，在一项包括18名患有T2DM病的男性成人和相同数量的健康男性成人的病例对照研究中，两组之间的肠道微生物组成显示出显著差异。此外，在门水平上，T2DM成年男性的拟杆菌丰度和拟杆菌与厚壁菌门的比率均高于健康成年男性。据推测，肠道微生物群的紊乱组成可能是诱发与T2DM密切相关的低度炎症状态的直接原因。当肠道微生物群发生变化时，高水平的血浆LPS会导致内毒素的产生增加，这可能会引发炎症反应，并在糖尿病的发展中起关键作用。值得注意的是，在T2DM患者中发现了相对大量的革兰氏阴性菌。具体来说，这些细菌属于拟杆菌门和变形菌门，其中外膜的主要化合物是脂多糖，因此，恢复肠道微生物群的平衡已成为治疗糖尿病的有效策略。

为了探讨SFF对肠道微生物群落的影响，研究者对基于V4区的16S rRNA进行了扩增子测序，以确定肠道微生物群落组成的变化。肠道微生物群的多样性见环境影响指数表1。与DC组相比，DC+SFF组的肠道群落丰富度显著增加(P < 0.05)。研究者还观察到，在SFF处理后，检测的物种和肠道群落多样性没有显著变化(P > 0.05)，但与DC组相比略有增加。使用具有加权均匀性和非度量多维标度(NMDS)的主坐标分析(PCoA)(图S1A)来显示三组中分离的点(图S1B)。此外，基于加权UniFrac的算术平均值的非加权组平均法（UPGMA）发现(图4A)，DC组和NC组之间结肠细菌群落结构的相似性相对较低，而DC+SFF组中的大多数细菌群落与NC组聚集在同一单元中，因此表明SFF可能是影响细菌群落的关键因素。特别是厚壁菌门和拟杆菌门是这三个类群中最主要的门(图4A和B)。与对照组相比，在DC组中检测到高比例的拟杆菌门和厚壁菌门(图4C)。实际上，先前的研究发现SFF还可以恢复1型糖尿病小鼠肠道菌群多样性的降低，但对厚壁菌门和拟杆菌门比率的影响与目前的结果不一致，这可能是由于 1型和2型糖尿病的发病机理。

图5 基于属比较确定微生物组成的相似性。热图代表了一组细菌群落，它们在属水平上相对丰富。使用邻体连接方法对细菌群落或OTUs进行系统发育聚类，而使用UniFrac分析基于图谱模式对文库进行聚类。微生物属的相对丰度(对数值)以红到蓝的颜色代码显示(从高到低的丰度)。

使用聚类作为热图，进一步分析了属水平上肠道微生物群的相对丰度(图5)，其中红色代码表示微生物群的更高丰度。总体而言，鉴定出35个属，其丰度在NC组和DC组之间存在差异。值得注意的是，在SFF组中，研究者发现瘤胃梭菌属、布劳特氏菌属和普拉梭菌的相对丰度似乎有所提高(P < 0.05)，产生了与正常对照组相似的分布(图5和S2)。此外，本研究显示，施用SFF后，拟杆菌属、副杆菌属和肠球菌的丰度显著增加，而脱硫弧菌和罗姆布茨菌的丰度显著降低(图S2)。

为了确定NC、DC和DC+SFF组中的特定细菌分类群，研究者进行了线性判别分析(LDA)来比较每组微生物群的组成（score>3表示相对较高的丰度）。如图6所示，三组肠道微生物群的组成显示呈显著差异。研究者注意到，SFF的施用选择性地富集了6个群落，包括Lachnoclostridium,Anaerotruncus 和 Enterobacter，以及Parabacteroidesgoldsteinii、Enterococcus faecalis和Lactococcus lactis。同时，在DC组中脱硫弧菌(变形菌门)的相对丰度有所增加。

一些难以消化的碳水化合物，如岩藻聚糖、菊粉和阿拉伯半乳聚糖，在结肠肠道微生物群的发酵中起着关键作用。目前，越来越多的证据表明，产生短链脂肪酸(SCFAs)的微生物群在向肠上皮提供能量和营养、减轻炎症和调节葡萄糖稳态方面表现出独特的作用。先前的研究将Blautia与改善血糖和血脂稳态联系起来，以缓解T2DM。除了通过抑制NF-κB途径降低肠道通透性外，Faecalibacterium产生的丁酸盐可能通过5-羟色胺转运体和PPAR-γ途径发挥这种作用。膳食岩藻依聚糖可以显著增加Blautia和 Faecalibacterium，(SCFAs)-产生菌的相对丰度，这些细菌主要通过不可消化的碳水化合物或膳食纤维的发酵产生丁酸。此外，一些细菌的丰度（如Ruminiclostridium和 Bacteroides）与糖尿病的发展呈显著的负相关，而SFF处理增加了它们在糖尿病小鼠中的相对丰度。相比之下，据报道，在DC组的富集的Romboutsia与脂肪代谢呈正相关。此外，一些研究发现，喂食HFD的小鼠体内的变形杆菌数量和脂多糖水平显著增加。脱硫弧菌是一种硫酸盐还原细菌，被归类为与一些炎症性疾病相关的机会性病原体。

除了产生内毒素之外，脱硫弧菌还具有将硫酸盐还原成H₂S的能力，这已被证明会破坏肠道上皮细胞的能量代谢，从而破坏肠道屏障。本研究结果显示，DC组有高丰度的变形菌，尤其是脱硫弧菌(图6和S2)和水平升高的血浆脂多糖(图S3)。此外，在属水平上的Spearman’s相关分析结果(图S4)表明，脱硫弧菌与LPS血清水平、FBG和TG含量呈正相关(P < 0.05)。值得一提的是，在SFF处理后，LPS血清水平的丰富度显著增加，而脱硫弧菌的丰富度显著降低。此外，与DC组相比，SFF显著降低了血清脂多糖水平(图S3)。因此，DC+SFF组中适当数量的Faecalibacterium和Blautia以及较低数量的脱硫弧菌可能会降低血清LPS水平以保护肠道屏障功能，这可能最终有利于改善T2DM的胰岛素抵抗。

最近，据报道，多糖可以增加Parabacteroides goldsteinii的丰度，减少炎性细胞因子的释放，并减轻由HFD诱导的氧化应激引起的组织损伤。此外，Parabacteroides goldsteinii可以产生琥珀酸，进而调节糖脂代谢，修复肠道完整性，并通过激活肠道FXR信号通路促进肝糖原合成。因此，SFF治疗后HFD/STZ诱导的糖尿病小鼠症状的减轻可能归因于Parabacteroides goldsteinii的增加。总之，本研究数据表明，SFF可能通过重塑肠道微生物群的结构在缓解T2DM病中发挥重要作用。

图6处理组间分类群的线性判别分析得分不同。列出的LDA评分阈值> 3，表明相应组的相对丰度高于其他两组。蓝色、绿色和红色条代表分别在DC + SFF, NC,和 DC显著增加的分类群。

图7 SFF对糖尿病小鼠结肠代谢谱的影响。热图显示，在VIP > 1和P < 0.05时，与DC组相比，DC + SFF组的代谢物发生了显著变化(t检验)。

4 SFF处理调节糖尿病小鼠结肠中的代谢组

为了进一步探索SFF潜在功效的可能机制，研究者在此使用从小鼠结肠收集的内容物进行代谢组学分析。基于投影中的变量重要性(VIP)>1和P < 0.05，鉴定了14种不同的代谢物。此外，选择在DC组和SFF组之间显示水平变化的代谢物进行进一步分析，并使用热图观察这些代谢物的平均标准化量(图7)。在代谢物中，(R)-肉碱和胆碱在DC + SFF组中显示出显著增加的水平，而在DC组中它们的水平降低(图S5)。特别地，左旋肉碱(LC)，长链脂肪酸β-氧化在脂质代谢中发挥不可或缺的作用，并且还具有抗氧化特性。在其他地方，实验动物研究清楚地表明，补充肉碱可以改善胰岛素抵抗状态下的葡萄糖耐量，如糖尿病或肥胖症。然而，肠道微生物对这些物质的特定发酵可以形成有毒化合物，这可能导致宿主上皮的破坏并引起炎症。

肉碱和胆碱可以被肠道微生物群的菌种代谢为三甲胺(TMA)，包括变形菌和梭状芽孢杆菌(尤其是梭状芽孢杆菌簇XIVa和真细菌属的成员)。进入肝脏后，TMA被氧化成三甲胺氮氧化物(TMAO)，通过促进泡沫细胞(富含脂质的巨噬细胞)的形成和改变胆固醇的转运而加重动脉粥样硬化。因此，血清TMAO水平升高与心血管疾病密切相关。此外，TMAO对葡萄糖耐量的有害影响可能与炎症有关。

多项代谢研究报告称，TMAO血清和尿液水平升高的HFD喂养小鼠易受葡萄糖稳态受损和非酒精性脂肪性肝病的影响。另一项研究进一步表明，饮食中的TMAO加剧了HFD喂养小鼠的葡萄糖不耐受。在这项研究中，与SFF处理的小鼠相比，在HFD/STZ诱导的糖尿病小鼠中检测到丰富的变形菌(图6)，以及低水平的肉碱和胆碱。因此，推测SFF可以改变肠道微生物群，特别是减少变形菌的丰度，以减少肉碱和胆碱的代谢，从而抑制TMA和TMAO的形成。然而，肠道微生物群介导的脂质代谢和健康后果之间的关系尚不清楚，因为这些领域的积极研究仍处于早期发展阶段。因此，未来的研究需要提供证据，特别是血清TMAO水平，这将证明SFF对肠道微生物群的代谢相关调节。

结论

总之，本研究在此探讨了SFF对HFD/STZ诱导的糖尿病小鼠的抗糖尿病作用。然后，利用16SrRNA测序、多元统计和代谢组学分析糖尿病小鼠肠道微生物群的相对丰度和不同代谢物的水平。随后，研究者注意到，一方面，给药SFF显著降低了FBG水平、食物消耗、水摄入和血脂，而另一方面，它减轻了脂肪组织、肝脏和心脏的病理损伤并抑制了HFD/STZ诱导的糖尿病小鼠的氧化应激。同时，SFF改变了肠道微生物群的组成，增加了结肠中肉碱和胆碱的水平。总的来说，这项工作证明了SFF通过改善胃肠健康来调节其对糖尿病的有益作用的潜在机制。因此，本研究目前的研究表明，SFF有很大的潜力作为功能性食品或药物补充，以减轻T2DM及其并发症。