亚低温对神经母细胞瘤细胞氧糖剥夺/复氧时小泛素类修饰蛋白特异性蛋白酶3表达的影响

2021
04/27

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古麻今醉
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本研究结果表明,N2a细胞经OGD/R处理后,SENP3表达上调,说明I/R可上调SENP3表达,产生神经损伤;实施亚低温的OGD/R处理后的N2a细胞SENP3表达下调,提示亚低温可能通过下调SENP3表达,减轻神经损伤。


ORIGINAL ARTICLES

【论著】

本研究采用亚低温干预小鼠神经母细胞瘤(N2a)细胞的氧糖剥夺/复氧(OGD/R)模型,研究亚低温对N2a细胞OGD/R时小泛素样修饰蛋白(SUMO)特异性蛋白酶(SENP)3表达的影响,进一步探讨其神经保护作用的机制。

 

1 材料与方法

     

1.1 实验药品及试剂

高糖培养液、无糖培养液、胎牛血清、PBS(、细胞计数试剂盒(CCK‑8)、乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒、Hoechst 33258 染色试剂盒、mRNA提取分离试剂盒、反转录试剂盒、实时荧光定量PCR(RT‑qPCR)试剂盒。


1.2 N2a细胞培养,OGD/R模型、亚低温模型的建立及分组

N2a细胞,用含10%胎牛血清、10万U/L青霉素和100 mg/L 链霉素的高糖培养液,置于37 ℃、5%CO2、74%N2、21%O2的恒温培养箱中培养,每隔1~2 d传代一次。


OGD/R模型的建立:将N2a细胞高糖培养液换成无糖培养液,置于37 ℃、5%CO2、94%N2、1%O2缺氧环境下培养3 h,缺血/缺氧结束后,重新置于高糖培养液中培养,正常条件下(37 ℃、5%CO2、95%O2)培养24 h。亚低温模型的建立:N2a细胞经OGD处理后,置于33 ℃培养箱中复糖/复氧培养24 h,其他条件不变。将N2a细胞分为3组(每组5孔):假手术组(S组)、OGD/R组和OGD/R+亚低温组(OGD/R+HT组)。S组置于37 ℃、5%CO2、74% N2、21%O2的恒温培养箱中培养,不作任何处理。


1.3 CCK‑8法检测OGD/R后N2a细胞活性

将待测N2a细胞制成的单个细胞悬液接种到96孔板,以每孔4 000个细胞的密度接种,每孔中加入100 µl高糖培养基,正常条件下(37 ℃、5%CO2、95%O2)培养,待细胞密度生长到70%~80%时,按照上述方法进行OGD/R处理后,对细胞做活性检测。向各组的5个复孔中加入10 µl CCK‑8,在细胞培养箱内孵育3 h后,用多功能酶标仪测定在450 nm处的光密度值。同时以空白孔(无细胞接种对照孔)作比色调零。S组不作任何处理,表示100%细胞存活率。细胞存活率=(实验孔光密度值-空白孔光密度值)/(对照孔光密度值-空白孔光密度值)×100%。


1.4 LDH释放率检测OGD/R后N2a细胞毒性

将N2a细胞接种至96孔板中,如上所述,待细胞密度不超过80%时,换用含1%血清的低血清培养液培养,将培养孔进行分组:背景空白对照孔、样品对照孔和处理样品孔。按照上述方法,进行OGD/R处理后,按照说明书进行后续操作,用酶标仪于490 nm处光密度值测定培养上清液中LDH含量。S组不作任何处理,表示100%LDH释放率。LDH释放率=(处理样品光密度值-背景空白对照孔)/(样品对照孔光密度值-背景空白对照孔)×100%。


1.5 Hoechst33258染色观察N2a细胞凋亡形态特征

N2a细胞接种至6孔板并进行处理(每组5孔进行处理),每孔按照2×105个细胞的密度接种,按试剂盒说明书进行染色操作并观察。PBS冲洗细胞3次,固定液固定;PBS洗2次,加入0.5 ml Hoechst33258染色5 min;PBS洗2遍,荧光显微镜下观察。


1.6 RT‑qPCR分析SENP3的相对表达量

提取N2a细胞的总RNA,采用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测RNA的纯度及浓度;将总RNA反转录成cDNA,并保存于−20 ℃;将cDNA按照说明书制备PCR反应体系,并置于ABI7300荧光实时定量聚合酶链反应仪检测SENP3水平。所有实验重复5次,所有样品均为正常内部控制。采用2−△△Ct计算SENP3的相对表达量,以GADPH为内参。


1.7 Western blot法测定SENP3蛋白水平

N2a细胞用PBS冲洗细胞1次,在RIPA裂解液中加入PMSF至终浓度为1 mmol/L备用。每孔加入稀释后的RIPA裂解液200 μl,充分裂解细胞后收集裂解液4 ℃、10 000 g离心5 min,吸取上清液。BCA法测定蛋白质浓度,根据说明书配置分离胶和浓缩胶。在蛋白质样品中加入2×SDS‑PAGE上样缓冲液(含DTT),每20 μl蛋白样品中加入20 μl上样缓冲液,混匀,100 ℃、5 min使蛋白变性,复温后离心收集上清液,加入到SDS‑PAGE加样孔中电泳。湿转法转膜成功后,用5%脱脂牛奶室温封闭2 h,用1×TBST洗膜3次,4 ℃孵育一抗过夜,室温条件下孵育含辣根过氧化酶的二抗1 h, ECL发光,曝光显影。采用Image J图像分析软件测定SENP3的表达水平,以目的蛋白与内参β‑actin的比值表示目的蛋白的水平。


 

2 结 果

     

2.1 各组N2a细胞活力的比较

与S组比较,OGD/R 组和OGD/R+HT组细胞存活率下降(P<0.05);与OGD/R 组比较,OGD/R+HT组细胞存活率升高(P<0.05)。见表1。


2.2 各组N2a细胞LDH释放率的比较

与S组比较,OGD/R 组和OGD/R+HT组细胞LDH释放率升高(P<0.05);与OGD/R 组比较,OGD/R+HT组细胞LDH释放率降低(P<0.05)。见表1。

 

2.3 各组N2a细胞Hoechst33258染色后形态变化

S组细胞经Hoechst33258染色后,细胞呈正常蓝色(图中显示为灰白色),OGD/R组凋亡细胞中呈亮蓝色的细胞核(图中显示为亮白色)数量大量增多,OGD/R+HT组呈亮蓝色凋亡细胞核数量减少。见图1。

 

2.4 各组N2a细胞SENP3的相对表达量与蛋白水平的比较

与S组比较,OGD/R 组和OGD/R+HT组SENP3的相对表达量和蛋白水平升高(P<0.05);OGD/R 组比较,OGD/R+HT组SENP3相对表达量和蛋白水平降低(P<0.05)。见表2。

 
 

3 讨 论

     

本研究通过建立N2a细胞OGD/R模型来模拟脑I/R损伤,进一步研究亚低温发挥神经保护作用的机制。


N2a细胞经OGD/R处理后,测得细胞活力降低、LDH释放率增加、凋亡细胞增多,表明OGD/R后细胞发生明显损伤,本研究模型建立成功。经亚低温处理后我们发现,细胞损伤明显减轻、活力升高、LDH释放率减少、凋亡细胞减少,说明亚低温减轻N2a细胞经OGD/R处理后的损伤,发挥神经保护作用。


本研究结果表明,N2a细胞经OGD/R处理后,SENP3表达上调,说明I/R可上调SENP3表达,产生神经损伤;实施亚低温的OGD/R处理后的N2a细胞SENP3表达下调,提示亚低温可能通过下调SENP3表达,减轻神经损伤。亚低温通过何种途径下调SENP3发挥神经保护作用的机制有待进一步研究。


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关键词:
神经母细胞瘤,特异性蛋白酶,泛素类,释放率

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