“GrimAge”是一种表观遗传的死亡率预测指标

本期由姝儿分享Ekaterina Protsenko等人2021年发表在  Translational Psychiatry上的题为“ “GrimAge,” an epigenetic predictor of mortality, is accelerated in major depressive disorder的文章。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41398-021-01302-0.pdf

01摘要

重性抑郁障碍(MDD)与过早死亡有关，是一系列疾病的独立危险因素，尤其是与衰老有关的疾病，如心血管疾病、糖尿病和阿尔茨海默病。然而，MDD躯体疾病发病率增加背后的病理生理学仍然未知。有人提出，MDD表现为细胞加速老化的状态，近年来已经开发了几种细胞老化的测量方法。在这些指标中，基于可预测的年龄相关的DNA甲基化模式(DNAm)，即所谓的“表观遗传时钟”的生物年龄估计器，在捕捉精神疾病加速老化的能力方面显示出特别的前景。最近开发的称为“GrimAge”的DNAm指标是独一无二的，因为它是根据死亡时间数据进行训练的，在预测发病率和死亡率方面都优于其前辈。然而，MDD尚未对GrimAge进行调查。在这里，本文测量了49名身体健康的MDD病患者和60名年龄相匹配的健康对照者的血糖。本文发现，与健康对照组相比，患有MDD病的个体相对于他们的实际年龄表现出明显更大的衰老(p=0.001)，细胞过度衰老的中值为2年。在控制性别、当前吸烟状况和体重指数后，这种差异仍然显著(p= 0.015)。这些发现与先前在MDD提出的细胞加速老化的建议一致，但首次用表观遗传学指标预测过早死亡来证明这一点。

02引言

 重性抑郁障碍(MDD)是世界范围内导致残疾的主要原因，与早期死亡率相关，并且是与衰老过程相关的多种疾病的独立危险因素，例如心血管疾病、痴呆、骨质疏松和糖尿病等。即使考虑到生活方式因素，MDD仍然是一个独立的风险因素，增加了生物或细胞加速老化的潜在机制的可能性。

最近，表观遗传年龄已成为一种特别有前途的细胞衰老测量方法，与早期的生物年龄指标(如白细胞端粒长度)相比，它可能与死亡率有更强的相关性。这是基于年龄对分布在整个基因组13的2800万个5′-磷酸碳-G-3′(CpG)位点的子集的DNA甲基化模式有可预测的影响的发现。“表观遗传时钟”由一小组这样的CpG组成，它们的甲基化模式产生了对生物或细胞年龄的估计(“脱氧核糖核酸年龄”)，而不是严格意义上的时间年龄。CPG的具体选择在可用的“时钟”之间有所不同，并且是机器学习导出的度量标准所基于的数据的函数。当一个人的“脱氧核糖核酸年龄”超过他们的实际年龄时，他们就会经历“表观遗传年龄加速”。

然而，“脱氧核糖核酸年龄”和“脱氧核糖核酸年龄加速”的大多数测量只是死亡率的适度预测因素，可能是因为它们的推导是基于年龄，根据定义，年龄排除了那些可能标志着偏离正常年龄的CpG位点。为了改进死亡率预测，“GrimAge”钟采用了两阶段方法来推导它的算法。在第一阶段，发现CpG位点的甲基化状态与预测死亡率的血清蛋白水平或自我报告的吸烟史密切相关。在第二阶段，这些血清蛋白和吸烟史的“脱氧核糖核酸替代物”在大规模死亡时间数据的基础上进一步训练。毫不奇怪，在预测五个独立队列死亡率的能力方面，GrimAge超过了它的前辈。它还能够预测冠心病的发病时间，并显示与充血性健康衰竭、高血压、2型糖尿病、身体功能、共病和早期绝经有关。总之，因为GrimAge的CpG成分位点是健康相关和疾病相关蛋白质以及吸烟史的替代物，它显示出与全因死亡率和与年龄相关的健康状况的优越联系，因此可能比其前辈对精神疾病中细胞加速老化更敏感。

尽管人们一致认为抑郁症与过早发病和死亡有关，但很少有关于MDD17表观遗传衰老潜在变化的公开研究，也没有使用GrimAge指标。鉴于MDD表观遗传衰老的证据相对缺乏，本文对一组身体健康、未用药的中度至重度MDD病患者进行了老年加速研究，并与一组医学和精神健康对照组进行了比较。基于抑郁症患者早期死亡率的证据，本文假设MDD的GrimAge年龄加速比同样年龄的健康对照者更大。

03招募程序和研究参与者

MDD (n =50)门诊患者和健康对照(n=63)通过传单、Craigslist帖子、报纸广告招募，对于MDD受试者，通过临床转诊招募。包括MDD在内的所有诊断都是根据本研究开始时使用的DSM-ⅳ指南18进行的。诊断是使用DSM-IV TR19的结构化临床访谈建立的，并由经委员会认证的精神病医生在单独的非结构化诊断评估中进行验证。使用汉密尔顿抑郁量表(HDRS)评估MDD受试者的抑郁症状严重程度，而使用抑郁症状自评量表(IDS-SR)评估MDD和对照组受试者的抑郁严重程度。所有MDD受试者的17项HDRS评分最低为17分。如果MDD受试者符合DSM-IV标准，且符合以下任何一项，则被排除在外:(1)双相情感障碍，(2)前6个月内酗酒或滥用药物，(3)进入研究后1个月内出现PTSD或进食障碍，以及(4)除重度抑郁发作外的任何精神病史，或在当前重度抑郁发作期间出现任何精神病症状。潜在的健康对照被排除在DSM-IV轴-I诊断的任何历史之外。根据病史、体检和常规血液筛查评估，所有研究参与者均无慢性病或急性疾病或感染、炎症性疾病、神经障碍或任何其他被认为可能混淆的医学状况。所有受试者均无精神药物(包括抗抑郁药)、激素补充剂、含类固醇的避孕药或其他潜在干扰药物，包括超过美国推荐每日摄入量的维生素补充剂(如维生素90毫克/天)，并且在登记前至少6周未接种任何疫苗。对于MDD受试者，根据需要允许使用短效镇静催眠药，每周最多三次，但在研究抽血前一周内不允许使用。所有受试者必须在抽血当天通过滥用药物的尿液毒理学筛查和育龄妇女怀孕的尿液测试。

04脱氧核糖核酸的制备和甲基化分析

血液样本是在一夜禁食后的早上抽取的。全血收集在酸性柠檬酸葡萄糖(ACD)管中，用于制备DNA。等分的样品在使用前在80℃冷冻保存。使用QIAmp DNA纯化试剂盒从全血中提取DNA(加州雷德伍德城Qiagen)，然后使用Tapestation(安捷伦)进行质量检查。使用我们组以前使用的方案对甲基化CpG进行鉴定和分析。基因组DNA (500 ng)用亚硫酸氢钠处理，使用酵母EZ96 DNA甲基化试剂盒(酵母研究，美国加利福尼亚州奥兰治)，全基因组DNA甲基化模式用InfiniumHuman甲基化450珠芯片阵列(Illumina，Inc.)分析。珠子芯片被清洗，单碱基延伸标记并用多层荧光染色，然后用Illumina iScan系统扫描。

样本被随机分在盘子里。在板之间没有发现视觉批次效应。包含原始强度信号的IDAT文件是使用Illumina的图像控制软件生成的。Noob背景校正23用于对数据进行预处理，然后将其提交给https://dnamage.genetics.ucla.edu的DNAm age网站进行分析。对Noob校正的数据进行主成分分析，以识别具有DNA甲基化分析异常的异常值。三个健康对照和一个MDD被排除在质量控制之外。所有样本一起处理和分析，并且主成分分析分析确认在实验采血批次中不存在显著的批次效应。所有样本都通过了质量控制，样本与“黄金标准”(一个大的全血DNAm队列的平均值)之间的平均绝对差异都低于0.08。

05表观遗传时钟

“年龄加速”被定义为按时间顺序年龄回归表观遗传年龄的残余，由前缀“年龄加速”(如“年龄加速”)表示。GrimAge时钟是由8个基于DNA甲基化的血浆蛋白标记和自我报告的吸烟习惯组成的。血浆蛋白替代物包括:胱抑素C、瘦素、组织抑制剂金属蛋白酶1 (TIMP1)、肾上腺髓质素(ADM)、β-2-微球蛋白(B2M)、生长分化因子15 (GDF15)和纤溶酶原激活抑制剂1 (PAI1)。这些蛋白质和吸烟史的DNAm替代物由前缀“DNAm”表示(例如，吸烟史的替代物为“DNAmPACKYRS”)，按时间顺序年龄回归的残差被指定为“年龄调整的”。

06统计方法

包括的样本量是基于所有受试者从母体研究中获得的数据(“重度抑郁症中的细胞老化”；R01-MH083784)。所得样本足以检测0.54或更大的独立样本t检验的效应大小，幂为0.80，双尾α= 0.05。所有分析的p值反映了α= 0.05的双尾显著性。表观遗传年龄和年代年龄之间的相关性基于斯皮尔曼相关性。表观遗传年龄的所有测量值随后根据年代年龄进行回归，残差用于所有ANCOVA分析。GrimAge的年龄调整残差被称为“年龄加速残差”，以保持与先前文献的一致性。所有变量都通过夏皮罗-维尔克检验进行了正态性检验，Blomtransformation24was用于实现年龄加速模型的正态性。GrimAge的几个年龄调整的脱氧核糖核酸替代标记成分也发生了Blom转化:脱氧核糖核酸胱抑素c、脱氧核糖核酸瘦素、脱氧核糖核酸氨基酸和脱氧核糖核酸基质金属蛋白酶1。

对于所有亚组分析，在分析前亚组中重复Blom转化。其余经年龄调整的Dna成分呈正态分布。所有年龄调整表观遗传年龄指标的群体差异最初都是使用独立样本T检验(“模型1”)进行测试的。由于格里姆算法中包含的脱氧核糖核酸替代标记之一名义上是作为终生吸烟包装年(脱氧核糖核酸包装年)15的替代物导出的，我们在一个单独的ANCOVA(“模型2”)中对当前的烟草使用进行了共变。在“模型3”中，我们还对性别和体重指数进行了共变，因为两者都被反复证明可以改变表观遗传衰老的指标。相同的模型被应用于单独的GrimAge替代标记成分。DNAmPACKYRS以原始形式和年龄调整形式进行分析。为了控制任何未被协方差考虑的吸烟的残留效应，我们在一个“当前不吸烟者”(37 MDD，55 HC型号4和5’)。虽然在初步分析中使用了“当前”吸烟状况来最大化样本量，但在一部分参与者(41名MDD人，51名健康体检者)中可以获得关于终生吸烟暴露的额外数据。在这个亚组中重复了针对老年吸烟者和老年吸烟者的模型2和3，以确保在考虑终生吸烟时效果没有差异，终生吸烟被定义为“从不”、“以前”或“现在”吸烟者(模型6和7)。最后，我们从AgeAccelGrim中排除了DNAmPACKYRS组件。

07结果

参与者的人口统计和抑郁症状MDD组和对照组在年龄、性别分布、体重指数、种族、民族、教育程度、吸烟史或吸烟者估计的终生吸烟数量方面没有显著差异(表1)。然而，各组在当前吸烟的二元指标(是/否)上确实有所不同，MDD组报告的当前吸烟量更大(卡方=6.653，p=0.010)，正如预期的那样，抑郁症状量表(IDS)的得分也有所不同(t(54.224)= 20.239，p= 0.000)。表1进一步描述了MDD参与者的特征。

08抑郁症患者和健康对照者的年龄加速

在联合队列中，GrimAge与实际年龄显著相关(斯皮曼ρ= 0.968，p < 0.001)，在分别有MDD和对照组的参与者中(MDD:斯皮曼ρ= 0.974，p < 0.001；斯皮尔曼ρ= 0.961，p < 0.001)(图1B)，与之前报道的强相关性相一致，并且将年龄作为格里姆年龄算法的一个组成部分。与对照组相比，MDD参与者显示出明显更大的年龄加速反应(t(107)= 3.265，p = 0.001科恩的d=0.63)。基于正态性转换前的中值，这相当于2.0年的加速格里姆年龄(MDD:中值=0.364年，四分位范围(IQR)= 2.180；HC:中位数= 1.637年，四分位范围(IQR) =3.946(图1A)。在对当前吸烟进行调整后(模型2: FMDD(1，109)= 7.345，p =0.008)，以及在对吸烟、性别和体重指数进行全面调整后(模型3: FMDD(1，103)=6.095，p =0.015)，群体效应仍然具有统计学显著性(表2)。

虽然老年抑郁障碍组的老年抑郁障碍明显高于对照组，但它与MDD组17项汉密尔顿抑郁量表(HDRS)的抑郁严重程度评分没有显著相关性(r = 0.088，p =0.550)，也与报告的抑郁生存期或未治疗抑郁天数(生存期:r = 0.009，p = 0.953未治疗天数:r=0.061，p =0.676)、终生抑郁的慢性程度(r = 0.014，p =0.926)或当前抑郁发作的持续时间(r = 0.125，p =0.391)(变量定义见表1)。单个尘粒组分标记和脱氧核糖核酸包的作用尘粒时钟的好处之一是，它的每一个替代脱氧核糖核酸标记本身都可以被查询，以探索它们对加速细胞衰老的贡献。

在个体代孕者中，MDD和健康对照参与者之间只有年龄调整后的脱氧核糖核酸甲基化水平、原始和年龄调整后的脱氧核糖核酸甲基化水平存在显著差异(表2)。年龄调整的脱氧核糖核酸胱抑素C的组间差异在吸烟调整后仍然存在，但在完全调整吸烟/性别/体重指数后，没有统计学意义。相比之下，原始数据和年龄调整后的数据组差异在完全调整后仍然存在(表2)。

值得注意的是，虽然DNAmPACKYRS指标是作为自我报告吸烟史的替代指标开发的，但它所包含的172个CpG与许多其他功能相关。为了探索脱氧核糖核酸累积年数指标是否捕捉到了衰老的某些非吸烟特有的潜在生物学方面，我们(1)将年龄加速老化和脱氧核糖核酸累积年数的组间分析限制在MDD组和对照组的当前不吸烟者，并且(2)在一个有详细吸烟暴露数据的亚队列参与者中，三个级别的“从未”、“以前”和“当前”吸烟状态是共同变化的。在目前的不吸烟者中，我们仍然发现MDD组和健康对照组之间在总体年龄差距方面存在统计学上的显著差异(模型4:t(89.68)= 2.383，p =0.019，科恩的d =0.49)。

以及原始数据和年龄调整后的数据均存在显著差异(模型4:原始数据:t(90)= 2.401，p =0.018，科恩的d = 0.51)年龄调整:t(89.15)= 2.656，p=0.009，科恩d=0.55(表3)。然而，由于样本量较小，在对性别和体重指数进行完全调整后，不吸烟者的年龄加速反应的差异没有统计学意义(模型5: FMDD(1，88)=3.417，p=0.068)，而原始数据和年龄调整后的数据的差异仍然存在(模型5:原始数据:FMDD(1，88) =4.855，p = 0.030)；年龄调整:FMDD(1，88) =5.796，p =0.018。补充材料中进一步详细介绍了对终生吸烟状况的影响的短期分析，与目前的吸烟状况相对照。简而言之，当改变三级终生吸烟状态时，MDD和HC之间年龄、吸烟率和吸烟率的差异持续存在。

在DNAmPACKYRS指标中包含的172个CpG中，对应于芳香烃受体阻遏物(AHRR)基因的cg05575921位点。为了探索cg05575921甲基化位点是否可能导致MDD和HC之间的差异(与吸烟无关)，评估了cg05575921甲基化(1)与吸烟相关和(2)MDD和HC之间的差异。这些结果出现在补充材料中，但简单地说，我们没有发现MDD和HC之间的cg05575921甲基化的差异。研究发现了与“当前”吸烟状态相关的显著低甲基化，这与先前关于cg05575921位点作为吸烟暴露标志的报道一致。

09讨论

在这篇论文中，我们使用最近开发的GrimAge指标，在MDD提出了表观遗传衰老的证据，该指标与发病率和死亡率高度相关，在一个独特的患有严重未治疗抑郁症的身体健康参与者队列中。身体健康、未用药的MDD患者比健康的正常对照者表现出更大的衰老加速，表观遗传衰老加速的中位差为2年。重要的是，在对吸烟、性别和体重指数进行调整后，健康参与者和MDD患者之间的年龄差距仍然存在。这表明，虽然这些变量导致了尘垢，但与MDD的联系仍然超出了可归因于它们的范围。到目前为止，在MDD关于表观遗传衰老的报道很少，在MDD也没有专门的报道。。根据荷兰推导的表观遗传年龄估计，基于80，000个CPG，该小组发现与健康对照组相比，抑郁症患者的表观遗传年龄显著加快。基本模型和完全调整模型的影响都很小，科恩的d分别为0.20和0.18。并且显示平均7.68个月的过度表观遗传老化。

在本文的样本中发现MDD参与者和健康对照组之间的格林年龄加速存在显著差异，调整前科恩d=0.63，表观遗传老化中值为2年。如果复制的话，这里看到的更大的效应大小可能是由于所使用的特定表观遗传老化度量或我们样本特征的差异。考虑到当前烟草使用的显著群体间差异和年龄-年龄-收入比指标的数据组间差异，在解释本文的发现时考虑烟草使用的作用是很重要的，与MDD无关。 我们采用了两种分析策略。(1)将我们的队列限制为“当前不吸烟者”，以及(2)将我们的队列限制为有足够详细吸烟史的受试者，并根据该史进行调整。这些分析与我们的假设相一致，即年龄加速老化和年龄调整的糖尿病肾病与MDD病无关，与吸烟无关。

本文的发现模式也与陆等人在他们最初发表的关于GrimAge的文章中的模式一致，他们在文章中证明了DNAmPACKYRS可以预测从不吸烟者的寿命，表明这种对172个CpG位点甲基化的综合测量反映了并非烟草使用特有的潜在生物过程的变化。在这些位点中，cg05575921位点及其相关基因——芳香烃受体阻遏物(AHRR)——与精神病和衰老的病理生理学潜在相关。我们比较了MDD和HC在这个位点的甲基化，没有发现明显的差异。尽管如此，根据AHRR在人类研究中的动脉粥样硬化和PTSD中的作用的证据，结合来自动物研究的证据，该证据暗示AHRR的靶-芳基烃受体-在衰老(特别是脑衰老)和神经炎症中的功能障碍，AHRR仍然是抑郁症和其他精神疾病进一步研究的有趣和有价值的目标。

本文研究的优势包括我们样本的当前MDD症状的临床显著程度，通过结构化和独立的非结构化精神病学访谈对MDD诊断的验证，以及要求所有参与者在进入研究前至少6周内保持无药物治疗。尽管他们的抑郁症很严重，但本文的样本在其他方面都是健康的，因为本文排除了目前或过去有可能影响表观遗传衰老的严重病史的人。本文旨在评估MDD本身的影响，而不是那些共病的医疗条件或抗抑郁药的使用。然而，通过这样做，我们可能选择了不完全代表“一般社区”抑郁症的患者样本，这些患者可能具有生物弹性，因此经历较少的抑郁症躯体后遗症。本文的健康对照组也是如此，他们也是因为没有躯体疾病和药物而被选中的。 健康对照和MDDs之间的年龄差距主要是由于HCs中低于预期的尘粒数，而不是MDDs中高于预期的尘粒数。我们认为这是因为我们仔细排除了两个样本中的躯体疾病，这与基于自然主义社区的样本形成了对比，从这些样本中可以得出格里姆Age指标。

 这项研究的局限性包括我们适度的样本量。因此，本文的发现需要在更大、更多样化的人群中进行验证。此外，尽管参与者在注册前至少6周基本上没有服用药物，但我们不能排除之前使用抗抑郁药或其他药物的长期影响。我们也只有一部分参与者的终生吸烟史的详细数据，因此在我们的初步分析中只能对目前的吸烟状况进行调整。虽然我们的亚短期分析表明，MDD对年龄加速反应的影响在调整详细的终生吸烟暴露方面是稳健的，但我们的“从不”吸烟者样本太小，无法获得足够的分析能力，我们的结果需要在具有大量吸烟暴露数据的队列中或在一大群“从不”吸烟者中进行复制。最后，虽然GrimAge指标被证明可以预测其他人群的死亡率，但我们不能断言，在没有长期纵向数据或有银行DNA样本的回顾性数据的MDD病患者中，它确实可以预测死亡率。

与非精神疾病患者相比，MDD病患者的平均预期寿命较短，严重躯体疾病共病率较高。原因尚不清楚，但我们的数据提出了与GrimAge相关的表观遗传变化是相关的可能性。然而，许多问题仍然没有答案。我们的数据没有说明这些变化的稳定性和可逆性，没有说明这些表观遗传变化与MDD晚期疾病和死亡率的实际联系，没有说明MDD和GrimAge之间是否存在因果关系，也没有说明我们注意到的GrimAge差异是否是MDD其他精神疾病特有的。此外，虽然本文的目标是评估MDD加速老龄化的可能性，而不是确定其原因，但这一系列研究的最终目的是确定将MDD与寿命缩短和“健康寿命”联系起来的生物机制。在理解像MDD这样的严重精神疾病背后的细胞生物学方面的进展，可能是理解疾病和死亡风险增加的关键。