阿司匹林对小鼠心肌缺血/再灌注损伤时心肌组织炎症反应的影响

【论著】

本研究拟通过建立小鼠心肌缺血/再灌注损伤（MI/RI）模型，探讨阿司匹林对MI/RI中心肌组织炎症的影响及相关机制。

1.1　实验动物

健康雄性C57BL/6小鼠60只。所用动物进行1周适应性饲养，饲养环境：室温25~27 ℃，湿度50%~70%，光暗各12 h，昼夜循环。

1.2　小鼠MI/RI模型制备

参照文献的方法制备小鼠MI/RI模型。术前禁食8 h，自由饮水，腹腔注射1%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉，手术部位脱毛，仰卧位固定，气管插管后连接呼吸机，呼吸频率为110 次/min，潮气量20 ml/kg。MedLab信号采集处理系统行ECG监测。小鼠改为45°右半侧卧位，胸骨左缘第4肋间开胸，撕开心包，暴露左冠状动脉前降支（LAD），显微镜下用6‑0带针缝合线于LAD下方穿过，将细聚乙烯管置于LAD上，扎紧线圈结扎左冠状动脉。以结扎线以下左心室壁发绀、ECG显示ST段抬高为缺血成功标志。结扎30 min后松开结扎线，以缺血区变红、抬高的ST段回落1/2以上为再灌注的标志。闭合胸腔，恢复自主呼吸后拔管。

1.3　动物分组及处理

所有小鼠分为3组（每组20只）：假手术组（S组），缺血/再灌注（I/R）组（I/R组），阿司匹林+I/R组（A+I/R组）。S组只开胸，不结扎LAD；I/R组结扎LAD 30 min后再灌注24 h：A+I/R组分别于术前2 h及再灌注结束前2 h腹腔注射阿司匹林100 mg/kg，模型制备同I/R组。

1.4　伊文蓝及2，3，5‑三苯基氯化四氮唑（TTC）双染色法检测心肌梗死面积

再灌注24 h后，每组随机选取5只小鼠，剪开腹腔并向上剪开胸腔，原位将LAD重新结扎，从下腔静脉注射2%伊文蓝0.2 ml，待小鼠全身染蓝后立刻将心脏取下，放入冰生理盐水中洗去血液及多余染料，置于−80 ℃冰箱15 min，取出置于冰上沿心脏长轴切成约1 mm的薄片，将切片放入1%TTC溶液中，烘箱37 ℃避光孵育15 min后取出，PBS冲洗后置于4%多聚甲醛溶液固定30 min。使用扫描仪扫描心脏切片，用Image‑J图像分析软件分析图像。蓝色区域为正常区域，其余区域（包括红色和白色）为缺血危险区（AAR），其中白色区域为心肌梗死区（IA），红色区域为缺血但未梗死区。心肌缺血面积计算为AAR占左心室的百分比，心肌梗死面积计算为IA占AAR的百分比。

1.5　心肌组织H‑E染色

再灌注24 h后，每组随机取5只小鼠，麻醉后打开胸腔取出心脏，置于4%多聚甲醛中固定，脱水，石蜡包埋，切片，常规H‑E染色，光学显微镜观察病理结果。

1.6　实时荧光定量PCR（RT‑qPCR）法检测心肌组织中TNF‑α、IL‑1β、IL‑6 mRNA水平

再灌注24 h后，每组随机取5只小鼠，麻醉后打开胸腔，取出心脏缺血区左心室心肌组织，Trizol提取总RNA，NanoDrop2000测定RNA浓度及纯度，将总RNA逆转录为cDNA。使用Lighter Cycler 480进行PCR扩增，反应条件：预变性95 ℃ 300 s；循环反应95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，40个循环；溶解曲线95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95℃ 15 s。采用2−△△CT计算相对表达量。引物序列：β‑Tubulin，上游引物5'‑CAGCGATGAGCACGGCATAGAC‑3'，下游引物5'‑CCAGGTTCC‑AAGTCCACCAGAATG‑3'；TNF‑α，上游引物5'‑ATGTCTCAGCCTCTTCTCZTTCGC‑3'，下游引物5'‑TTGTCACTCGAATTTTGAGA‑3'；IL‑1β，上游引物5'‑TCGCAGCAGCACATCAA‑CAAGAG‑3'，下游引物5'‑ AGGTCCACGGGAAAGACACAGG‑3'；IL‑6，上游引物5'‑CT‑CCCAACAGACCTGTCTATAC‑3'，下游引物5'‑ CCATTGCACAACTCTTTTCTCA‑3'。

1.7　Western blot法检测心肌甲酰肽受体 2（FPR2）蛋白水平

再灌注24 h后，每组取剩余5只小鼠，麻醉后打开胸腔，取出心脏缺血区左心室心肌组织。将组织剪碎后加入RIPA及PMSF，研磨仪研磨至无固态组织，离心后取上清液。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。按30 μg蛋白上样量进行电泳（SDS‑PAGE，10%分离胶），转膜，室温下5%脱脂牛奶封闭2 h，加入一抗FPR2、β‑Tubulin，4 ℃摇床孵育过夜。Tris‑HCL缓冲液+Tween 20（TBST缓冲液）漂洗3遍，加入相应山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG，室温孵育2 h后洗膜3遍，ECL发光获得图像，Image J软件对条带进行灰度分析，以FPR2与β‑Tubulin条带的灰度值的比值反应蛋白水平。

1.8　ELISA法检测血清阿司匹林诱生型脂氧素A4（15‑epi‑LXA4）水平

再灌注24 h后摘眼球取血，静置1 h，3 000 r/min离心15 min，取上清液。按ELISA试剂盒说明检测血清15‑epi‑LXA4水平。

2.1　各组心肌缺血面积和梗死面积比较

与S组比较，I/R组和A+I/R组的心肌缺血面积及心肌梗死面积均增加（P<0.05）。与I/R组比较，A+I/R组心肌缺血面积差异无统计学意义（P>0.05），心肌梗死面积减小（P<0.05）。见图1。

2.2　各组H‑E染色组织损伤比较

S组心肌细胞结构完整，无水肿，未见明显炎症细胞浸润；I/R组心肌细胞排列紊乱，心肌纤维断裂，间质肿胀伴大量炎症细胞浸润，部分细胞核固缩；A+I/R组心肌细胞排列相对整齐，少量心肌纤维断裂，间质轻微水肿，炎症细胞浸润较I/R组减轻，偶见细胞核固缩。见图2。

2.3　各组心肌组织TNF‑α、IL‑1β、IL‑6 mRNA水平比较

与S组比较，I/R组和A+I/R组TNF‑α、IL‑1β、IL‑6 mRNA水平升高（P<0.05）。与I/R组比较，A+I/R组TNF‑α、IL‑1β、IL‑6 mRNA水平降低（P<0.05）。见表1。

2.4　各组血清15‑epi‑LXA4水平比较

与S组比较，I/R组和A+I/R组血清15‑epi‑LXA4水平升高（P<0.05）。与I/R组比较，A+I/R组血清15‑epi‑LXA4水平升高（P<0.05）。见图3。

2.5　各组心肌组织FPR2蛋白水平比较

与S组和I/R组比较，A+I/R组FPR2蛋白水平升高（P<0.05）。见图4。

本研究结果显示，与S组比较，I/R组心肌梗死面积增加，心肌组织TNF‑α、IL‑1β、IL‑6 mRNA水平升高，心肌损伤加重，炎症细胞浸润明显，提示MI/RI模型建立成功。与I/R组比较，A+I/R组心肌梗死面积减小，心肌组织TNF‑α、IL‑1β、IL‑6 mRNA水平降低，心肌损伤减轻，炎症细胞浸润减少，表明阿司匹林可以减轻受损心肌炎症反应，对小鼠MI/RI产生保护作用。

本研究结果显示，与I/R组比较，A+I/R组血清15‑epi‑LXA4水平升高，FPR2蛋白水平升高。由此，我们推测阿司匹林促进15‑epi‑LXA4的合成以及激活FPR2受体发挥抗炎作用，对小鼠MI/RI产生保护作用。