科研 | Microbiome：阿拉斯加苔藓的细菌群落及其对N2固定的贡献

2021-04-12 微生态

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北方藓类的微生物群落具有系统发育结构，而苔藓种类是微生物群落组成的最佳预测因子，而不是生境条件。

导读

高纬度生态系统中的苔藓具有多种细菌类群，其中包括N₂固定者，是这些系统中氮动态的关键因素。然而苔藓宿主物种和环境因素在构建这些微生物群落和它们的N₂固定潜力方面的相对重要性仍不清楚。我们在美国阿拉斯加州从北纬61度到69度的24个地点研究了26种北方苔藓和冻土带苔藓。我们使用独立培养的方法来探究苔藓作为宿主物种身份和位置特征的功能，以及其细菌群落的变化。我们还通过¹⁵N₂同位素富集测定了N₂固定率，并利用现有文献和基因组信息鉴定了潜在的N₂固定细菌。宿主的物种识别和宿主的进化历史都是苔藓微生物组组成的高度预测因素，突出了这些微生物群落的系统发育一致性。虽然不那么重要，但光照强度和温度也影响苔藓微生物组的组成。最后，我们鉴定了一些苔藓宿主特有的固氮细菌，包括蓝藻分支之外潜在的固氮细菌。寄主身份对苔藓相关细菌群落的强烈影响证明了苔藓在非豆科植物系统中植物与微生物相互作用方面的所发挥的效用。我们的工作也强调了新的细菌类群对高纬度生态系统中N₂固定的可能重要性。

论文ID

原名：The bacterial communities of Alaskan mosses and their contributions to N₂-fixation

译名：阿拉斯加苔藓的细菌群落及其对N₂固定的贡献

期刊：Microbiome

IF：11.607

发表时间：2021.2

通讯作者：Hannah Holland-Moritz

通讯作者单位：科罗拉多大学生态和进化生物学系

实验设计

本实验收集了26个不同苔藓物种的461个苔藓样本的微生物群落标记基因和同位素 N₂ 固定率数据。这些样本来自美国阿拉斯加的24个纬度地区(从61°N到69°N，图1)。该纬度区域中包含常见的北方和冻原栖息地类型的站点。在2016年和2017年采集样本，收集期均在6月下旬进行。场地位置和在每个场地收集的苔藓物种概述于图1中。在每个取样点上，我们建立了一个30米的取样带，该站点的纬度和经度对应于样带的中点。建立样带以捕获各站点环境异质性的宽度。在每个站点至少收集了6个普通苔藓的重复样本，并对稀有苔藓可用的数量范围内进行重复采样。苔藓样本沿样带随机采集，每隔至少5米采样一次。对于每个样本，在样带上标出最近的5米标记，并将每个样本与离其采集点最近的测量值的环境数据相关联。沿样带收集的环境数据包括土壤pH值、土壤水分、冠层覆盖、冠层组成和冠层密度。对于每个样本，从一个单一的斑块上收集苔藓，并将样本保存在冷却器中不超过2小时直到处理，这些样本用于微生物测序、同位素天然丰度、同位素富集和基因分型标本测定。此外还对N₂固定率进行测定。

图1 本研究461个样本的物种分布图和采样地点。每个样带位置的图像(左图)显示了各个场地的环境异质性。表格(右上角)显示了采样的物种列表，按每种物种采集的样本总数排序。点表示某一特定物种至少有一个样本被采集的地点。蓝框表示被确定为“丰富且普遍存在”的7种苔藓。这七个物种的图像显示在图的右下角。用于特定地点分析的苔藓种类最多的地点用星号标记。

结果

1 细菌群落组成的宿主结构

苔藓相关细菌群落平均每个样本具有 812种独特的系统类型，以8个细菌门为主。所有样本的平均相对丰度如下：Proteobacteria(49.6%), Acidobacteria（12.3%），Actinobacteria（8.4%），Bacteroidetes（7.5%），Verrucomicrobia（7.3%），Candidatus Eremiobacterota（WPS-2）（5.1%），Planctomycetes（4.2%），以及 Cyanobacteria（3.5%）（图2）。尽管发现与26个苔藓物种相关的最丰富的科和系统型在整个样本中是相当一致的，但这些分类单元的相对丰度因所讨论的寄主物种而异。细菌群落组成的差异可以通过宿主物种的身份和位点得到很好的解释（分别为变异的17.2和19.2％），其中很大一部分变异是由位点和宿主物种之间的相互作用（21.7％）解释的（表1）。

宿主身份的强烈影响并不一定意味着强大的系统发育结构;而26种寄主的细菌群落差异与苔藓宿主间的系统发育距离密切相关，与系统发育结构一致。在苔藓细菌群落组成中观察到的大部分系统发育信号是由与 Sphagnum 相关的独特群落驱动的，当分析仅限于七个Sphagnum物种时，它们自身具有很强而显著的系统发生信号（Mantel试验，rho = 0.65，p = 0.005）。

由于苔藓物种的分布与环境条件有着内在的联系，并且不是每个地点都有每个物种存在，我们使用了一个样本子集来确定在控制了场地影响后，来确定宿主身份对微生物群落的影响是否仍然显著。为此，我们选择了一些站点来单独测试宿主物种的解释效果，只关注那些同时出现超过4种苔藓的站点，每个站点至少采集了3个个体样本。结果表明在苔藓细菌群落组成上存在强烈的宿主身份和宿主系统发育信号，并且该信号与站点级环境条件的差异无关。

图2 热图显示了不同苔藓寄主物种（y轴）中丰富的细菌家族（x轴），系统发育树显示了苔藓寄主物种之间的系统发育关系。26种苔藓中只有24种包含在这张热图中。颜色表示各细菌科的相对丰度，黄色阴影表示较高的相对丰度，蓝色阴影表示较低的相对丰度。热图每个单元格中的数字显示特定细菌家族的相对丰度百分比。

表1 PERMANOVA的结果表明，宿主身份和位置在构建26种苔藓微生物群落的相对重要性。

2 取样点是细菌群落组成驱动因素

除了苔藓细菌群落具有强大的宿主分类和系统发育信号外，我们还观察到特定宿主物种的细菌群落组成在不同位点上的变化。在对7种最丰富和最普遍的苔藓物种的分析中，我们发现当宿主物种保持不变时，细菌群落的显著变化可归因于取样点（PERMANOVA，R² = 0.37 to 0.62，P < 0.005）。为了更好地理解环境因素可能有助于解释这种可归因于位点差异的变异，我们确定了与细菌群落组成相关的环境变量，然后评估这些变量的重要性和强度。我们确定了三到六个环境变量对于构建每个宿主物种中的细菌群落至关重要，总相关值范围从0.36（Pristium crista-castrensis）到0.60（Polytrichumstrictum and Hylocomium splendens）。最常见的预测因子是场地年平均气温、冠层覆盖度和阔叶树百分比。这些结果表明，温度、光照可用性（由冠层覆盖和树木类型决定）和其他冠层效应（如凋落物深度）在构建单个苔藓物种内的细菌群落中非常重要。然而，当我们用MRM检验这些变量的显著性时，大多数预测因子的系数值都很小（<0.9），显著性预测因子的子集在宿主物种之间差异很大。因此，尽管细菌群落组成的一些变化与光照可用性和温度有关，但这些影响的重要性通常很小，而且强度变化取决于所讨论的苔藓物种。

3 鉴定在北方苔藓中发现的潜在N₂固定者

N₂固定速率为0至21.45μg（以氮计算）苔藓干重/每天(在我们的样本集中，从7个重点苔藓物种中收集了301个样本（图3））。为了鉴定在7个重点物种中与较高的 N₂ 固定率相关的细菌类群，我们分析了类群的相对丰度与log转化的N₂固定率之间的Spearman相关性。我们鉴定了16个细菌科，包含22种系统类型，它们与测定的 N₂ 固定率呈正相关（图4）。细菌丰度与N₂固定率呈正相关。有趣的是，与测定的N₂固定率呈正相关的系统类型在苔藓宿主之间并不一定是一致的。为了更好地可视化这些关联，我们创建了一个关联网络（图5）。大多数系统类型与多种苔藓宿主的 N₂ 固定率显著相关，而S. russowii拥有一套独特的类群。单个细菌类群的相对丰度与测得的N₂固定率之间的相关性（如图3所示）并不一定表明这些细菌类群实际上具有 N₂ 固定能力。因此，我们使用了几种方法来尝试确认与测量的N₂固定率相关的细菌类群的固 N₂ 能力。如果从文献中已经知道一个系统类型可以固定 N₂ ，则可以确定它可能具有固定N₂的能力，如果它与先前分离的能够在无氮培养基上生长的细菌菌株密切相关，或者从类似环境中获得的高度相似的宏基因组组装基因组(MAG)含有nifH基因。利用这些方法，22种系统发育类型中有6种被证实可能具有固定N₂的能力（图5）。值得注意的是，在6种已确认的系统分类中，只有2种属于念草科，这是一个已知与苔藓有关的 N₂ 固定分支。其他4种系统类型来自Methylocystaceae和Bradyrhizobium, Methylibium和Acidisoma，扩大了北方苔藓中可能具有固氮能力的细菌类群。对于其他16种系统型，没有足够的证据确定其N₂固定能力。最后，一些系统类型，如Candidatus Eremiobacterota(以前为WPS-2)中的3种，不太可能是N₂固定者，因为该门成员的基因组中没有显示含有nifH基因。的来说，我们只能确认通过我们的相关性分析（图5）确定的22种细菌系统类型中的6种可能具有N₂固定能力。

图3 在数据集中，通过同位素富集测定的7种丰富且普遍存在的物种在1天潜伏期内的N₂固定率。苔藓种类由高到低排列。然而，所有7个物种都寄生有N₂-固氮微生物，其寄生率因宿主物种而异。每个圆代表一个苔藓样本的固定率。误差条表示高于和低于平均值的1个标准误差(由主条的高度表示)。

图4 单个细菌系统类型的相对丰度与测定的 N₂ 固定率之间的Spearman相关性。在本分析中使用的细菌系统类型仅限于那些平均相对丰度为> 0.1%的苔藓宿主物种（156种系统类型）。根据系统类型的科级分类，将数据划分为若干组。彩色的点和线表示细菌的系统类型，与特定苔藓物种的N₂固定显著正相关。线和点是根据苔藓的种类来着色的。灰点是137种系统发育类型的测量值，未发现与N₂固定率显著正相关。们注意到，为了提高清晰度，不同面板的x和y比例不同。

图5 相关网络显示出在每个丰富的苔藓物种内，与N₂-固定率（rho，0.33-0.78；P <0.05，）具有显著正Spearman正相关的系统型（由彩色结点表示）。节点的颜色表示每个系统类型的家族成员。系统类型被确认为潜在的N₂固定率标记其唯一标识符和星号。

讨论

1 宿主系统发育在苔藓细菌群落形成中的作用

这项研究的主要目的是确定宿主身份与位点在构建苔藓微生物群落中的相对重要性。研究表明，宿主身份和宿主系统发育对26种苔藓相关细菌群落具有很强的影响。这些结果与之前针对较小苔藓种类的研究一致，这些研究也表明，不同的苔藓宿主物种拥有不同的细菌群落。我们的研究扩展了这些结果，涵盖了在大地理区域取样的更广泛的苔藓物种多样性。我们还表明，观察到的细菌群落组成变化的很大一部分可以归因于苔藓物种之间的系统发育关系，而这种系统发育结构在很大程度上归因于拥有不同细菌群落的Sphagnum。微生物组中的这种系统发育信号可能是宿主和其微生物居民之间共同多样化的结果，但它更可能是一个独立的系统发育结构特征从环境中选择某些微生物的产物（“生态过滤”）。重要的是，我们观察到的系统发育信号比模拟建议的生态过滤模型更强。

苔藓微生物组结构中这种强烈的系统发育信号与大多数维管植物形成鲜明对比，后者在宿主物种之间通常没有信号或非常弱的系统发育信号。植物地上细菌群落的模式还不太清楚。尽管先前的研究已经发现植物物种具有不同的叶球群落，但我们仅知道三项明确测试了这些群落中系统发生信号的研究。这些研究中，所有的研究都集中在维管植物（特别是树木），系统发育信号的强度从中等到强。尽管直接比较具有挑战性，但苔藓微生物群落的系统发育信号强度与之前的叶圈研究一样强，甚至更强，尤其是在植物微生物组文献作为一个整体的背景下。

在微生物组组成中所观察到的系统发育信号强烈地受到Sphagnum moss所具有的不同于其他苔藓的细菌群落的驱动。Sphagnum moss的细菌群落中很强的系统发生信号可能是由于泥炭解剖所特有的内部隔室（即透明细胞）对生态系统进行了过滤。透明细胞保持水分，并携带微生物，这些细胞的属性因水藻种类而异。在其他宿主微生物群中，内部隔室通常与更强的系统发育信号相联系。

2 苔藓细菌群落中潜在的N₂固定类群的多样性

在北纬生态系统中，苔藓具有多种潜在的N ₂ -fixers，它们在调节氮的可用性方面起着关键作用。我们能够从14个细菌家族中鉴定出22种细菌系统型，它们的相对丰度与测得的N₂固定率呈正相关（图4），这表明不同种类的细菌类群与测得的N₂固定率之间有很强的联系。苔藓物种寄主不同的潜在N ₂-fixers ，它们与每个宿主物种的系统类型具有更强的相关性（图5）。Sphagnum moss的成员（特别是S. russowii）通常拥有一套独特的细菌分类群，与其他采样的任何苔藓物种中的N₂固定率均不相关（图5）。Sphagnum moss不仅拥有独特的微生物群落（图2），而且还拥有潜在的N₂-fixers的独特群落，这一独特的群落可能部分解释了整个泥炭藓种中观察到的较高的N₂固定率（图3）。

苔藓可能具有大量固定N₂的细菌，这很可能是重要的生态特征。虽然不同的N₂-fixers可能直接竞争，但也有可能它们在苔藓宿主中有不同的生态位。例如，氧气光合作用剂（例如蓝细菌）可能会受到光照条件的限制，而产氧性光合作用的N₂-fixers（Acidisoma）可能能够将N₂固定在对于蓝细菌而言次优的光照条件下。未来工作的一个有希望的方向是确定苔藓中的N ₂ 固定率是如何直接或间接地相互作用的产物。

3 环境在形成苔藓细菌群落中的作用

除了具有独特的细菌群落的苔藓物种和谱系外，与单个苔藓物种相关的细菌在组成上是可变的，这种细菌群落组成的种内变化可以通过测量的场地特征，即光可用性和温度来预测。光线的可用性特别有趣，因为它是控制N₂固定率的常用因素。多项研究将光诱导的N₂固定增加归因于蓝藻的光合作用存在。但是，其他光养生物（包括来自Alphaproteobacteria的抗生光养生物或候选Emeriobacterota（WPS-2））也是苔藓细菌群落的重要成员，这些类群也可能有助于细菌群落对光可利用性的反应，突出了潜在的光化养分在苔藓微生物组中的重要贡献。

由于很大一部分变异可归因于位置，但我们测量的环境预测因子是相当弱的预测因子，很可能“位置”可以由本研究中未测量的一系列因素更好地代表。这些因素可能包括非生物因素（例如林分龄，父本基岩材料，甚至痕量金属的可用性或局部生物因素，例如宿主苔藓的基因型）；或通过下层维管植物群落的遮蔽引起的光利用度的变化（在我们的冠层覆盖测量中没有捕捉到）使原生生物和微动物自上而下的控制；或由于周围微环境微生物的定植而导致的群落更替而导致N₂固定率的变化。此外，我们的结果表明，宿主物种的身份而非测量或未测量的环境因素是细菌群落结构的更一致的指标，并且苔藓物种分布可能比站点特征更重要，以了解苔藓微生物组对生态系统过程的贡献,包括N₂固定。

结论

研究结果表明，北方藓类的微生物群落具有系统发育结构，而苔藓种类是微生物群落组成的最佳预测因子，而不是生境条件。相反，尽管我们的结果表明光照和温度对苔藓微生物组的组成有显著但微妙的影响，但苔藓微生物组的组成却不容易从场地特征中预测。我们还发现，潜在的N ₂ 固定细菌的特性是宿主物种特异性的，这表明N ₂ 固定可能在宿主水平上预测得最好。最后，我们发现的许多潜在的N₂固定微生物都不是蓝藻菌。这些非蓝藻细菌值得进一步研究，以更好地了解控制北方藓类固定速率的过程。更普遍地说，我们的工作证明了苔藓在研究植物微生物群方面的效用，并拓宽了我们对苔藓-微生物相互作用如何影响高纬度生态系统中氮动态的理解。