常规病理技术

组织的取材和固定技术

知识点1：对送检组织标本的要求

送检组织标本在手术切除或活检后应当立即放入4%中性缓冲甲醛溶液中固定。尸检标本应当尽量在死亡后尽早取材固定。送检组织需要全部取材的，应当在送检单上注明，有特殊要求（如细菌培养、解释道化学分析等）应当事先联系，并且在标本未固定前进行处理。

知识点2：组织取材要求

在对送检组织标本进行详细检查的基础上，根据诊断的需要，确定取材的部位和块数。切取的组织应当按照不同的部位分别给予不同的编号或标记，以便镜检时核对。另外，尽可能在取材前对有意义的标本的表面及剖面镜下摄影，并编号存档。

知识点3：组织标本大小

组织标本大小见表

知识点4：组织取材时间

原则上，应当尽快取材，但对于外科手术切除标本较大，如胃、肺、肠等器官，一般最好先固定再取材。

知识点5：小标本的处理方式

由于在胃镜下取的样本和各种穿刺样本等一般组织块较小，因此应用易透水的薄纸包好，在取材时将标本染上伊红液，以免在包埋过程中丢失。

知识点6：成年人尸检组织取材部位和组织块数

成年人尸检组织取材部位和组织块数见表

知识点7：活检标本取材要求

活检标本取材时，应当取病变部位、病变的切缘、病变与正常组织交界处以及远离病灶的正常组织，取材时要避免挤压组织，用的刀、剪应锋利，组织的切面应当平整，大小一般在2cm×1.5cm×0.3cm。新鲜标本的保存通常在30分钟内完成，如果要进行分子生物学检测，应当严格注意无菌和时间，以避免组织内的mRNA的降解和抗原的弥散，手术标本离体后，应立即取材，并且保存在冻存管中，进行编号，带回实验室保存在液氮或-80℃的冰箱内备用。

知识点8：组织固定的目的

病理学中组织固定的主要目的是保存组织形态学特征清晰和稳定，具体包括：①抑制自溶和腐败；②保存；③硬化；④胶质物体的固化；⑤肉眼鉴别；⑥对染色的影响；⑦渗透和固定。

知识点9：组织的物理固定方法

组织固定可通过物理方法来实现，见表

知识点10：组织脱钙

组织里存有钙盐可妨碍用常规方法制作良好切片。骨组织及钙化病灶，经过固定后，需要先将钙盐除去使组织软化，才能进行常规切片。如果脱钙不全，则切片容易撕开或碎裂，损伤切片刀刀刃。脱去钙盐的过程，称为脱钙。骨组织固定24小时后，锯下不超过0.5cm厚的薄骨片，以4%甲醛溶液固定后，进行脱钙。骨组织过厚则需延长脱钙时间，但长时间浸于强酸会影响切片染色效果。

知识点11：组织脱钙的步骤

组织脱钙的步骤见表

组织包埋技术

知识点1：包埋的概念

组织经过固定、脱水、透明和浸蜡等过程后，用包埋剂（石蜡、火棉胶、树脂等）将组织块包埋成块，使得组织和包埋剂相熔一体并迅速冷却，这个程序称为包埋。

知识点2：组织石蜡包埋法

石蜡包埋法是制作光学显微镜切片的常规方法，包埋后的组织可以长期保存。包埋的方法有包埋机包埋和手工包埋两种。

知识点3：体液石蜡包埋法

痰液、胃液、尿液、胸腔积液、腹水等可以行石蜡包埋。痰液应当选用含血液的部分或较为可疑的实体部分，滴上伊红后用皱纹纸包好，然后用10%的中性甲醛固定，再经常规脱水，透明、浸蜡并包埋。新鲜的胃液、尿液、胸腔积液、腹水等体液标本，倒去上层的澄清液体，将浑浊的液体放入离心管中，以转速2000-3000转每分钟离心15分钟，倒去上清液后，用10%中性甲醛固定沉淀物，然后进行脱水透明、浸蜡、包埋。

知识点4：冷冻干燥包埋法

新鲜组织在液氮中速冻后，先真空抽气，排除组织内的水分，然后将充分干燥的组织用甲醛蒸气固定。再将固定的组织浸入石蜡内浸蜡，最后用石蜡包埋。冷冻干燥包埋法包埋蜡块可以用于免疫荧光、免疫酶标记，也可用于放射自显影及1GSS方法。

石蜡切片技术

知识点1：石蜡切片技术的概念

组织经石蜡包埋后制成的蜡块，用切片机制成切片的过程，称为石蜡切片技术。

知识点2：石蜡切片技术——组织的取材和固定

⑴取材：取材时组织块的大小厚薄应当适当，陈旧、腐败和干枯的组织不宜制作切片。

⑵固定：组织固定时，固定液的量应当充足，至少要在4倍以上，同时要注意组织块不要与容器粘连。固定不及时和固定不当的组织，染色时常出现核质着色较浅，轮廓不清，以及出现不同程度的片状发白区。

知识点3：石蜡切片技术——组织脱水、透明和浸蜡

⑴脱水：组织脱水用的各级乙醇，应当保证相应浓度，以便组织脱水彻底。无水乙醇中的组织块放置时间不宜过长。脱水乙醇，特别是无水乙醇中混有水分，则组织脱水不彻底。

⑵透明：二甲苯透明应当充分，否则不利于石蜡的浸透。

⑶浸蜡：组织在二甲苯内的时间应当严格掌握，时间不足，则石蜡不易浸透。浸蜡的温度不宜过高，时间长短也应当加以控制。

知识点4：石蜡切片困难的处理

石蜡切片困难主要有两种情况：①组织太硬；②切制时组织易碎（如皮肤、骨骼或血凝块）。

无论是组织切片遇到困难，还是组织未做先期的防护处理，都可以先将组织浸入香柏油中软化，然后以二甲苯洗去香柏油，重新浸蜡包埋，最后以常规方法切片。

常规染色技术

知识点1：苏木素-伊红染色

在组织病理学中，苏木素-伊红染色是一种日常使用最广泛的常规染色方法。常规苏木素染色的对比染色是用伊红，也有采用焰红，因为焰红比伊红色泽更鲜明，还有采用橘黄G，比布里希猩红，波尔多红等作为对比染色。

知识点2：Harris苏木素液的配制方法

Harris苏木素液的配制液见表

⑴加热溶解甲液：将甲液加热溶解后，密封待用。

⑵甲、乙液混合：将乙液加热溶解至沸，去火，待溶液仍处于小沸腾状态时，将甲液徐徐倾入其中，全部混合后，使溶液在短时间内加热至沸腾，去火后，将氧化汞缓慢倾入溶液中。

⑶加温、冷却：液体变为深紫色后，待氧化汞全部放入再将溶液加温至沸腾片刻，立即将溶液放入流动的冷水中，连续摇晃，直至溶液完全冷却为止。

⑷过滤：隔夜后过滤，加入冰醋酸（按5%比例）混匀，过滤后，保存于冰箱内备用。

知识点3：Hansen苏木素液的配制方法

Hansen苏木素液的配制液见表

⑴将甲液、乙液分别加热溶解，然后将甲、乙两液混合。

⑵将丙液溶解后缓缓滴入，待全部混合后，再次煮沸1分钟，冷却后过滤，即可使用。

知识点4：Heidenhain铁苏木素液的配制方法

Heidenhain铁苏木素液的配制液见表

硫酸铁铵只有紫色的透明结晶才能使用；苏木素是溶于乙醇中后加水。苏木素液需要放置4-5周才能成熟。临用时，将甲、乙两液等量混合后使用。

知识点5：伊红染色

伊红是最常用的胞质染料，本身溶于醇而不溶于水，为砖红色粉末状或酱红色结晶。配方：伊红Y（水溶）0.5-1g，蒸馏水99ml。如果取用伊红Y（醇溶性）应当溶于99ml 75%或95%的乙醇中。如果在伊红液中加入0.5ml冰醋酸，可以加速其染色过程，使得胞质的色泽更加艳丽。

知识点6：苏木素-伊红染色前的切片预处理

苏木素-伊红染色前的切片预处理见表

知识点7：人工操作苏木素-伊红染色

人工操作苏木素-伊红染色的步骤和结果见表