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科研 | Front. Biosci.：野生和圈养环境下的东北虎肠道微生物组成和功能比较分析

2021

04/06

微生态

A-

A+

该研究通过微生物组学的一系列技术和手段对野生和圈养环境下的东北虎进行研究，分析了两种环境下东北虎菌群组成和功能的差异，发现食物和环境是造成差异的主要原因。

导读

众所周知肠道微生物对于宿主的健康非常重要，微生物组成的改变可能会增加宿主感染疾病的可能性和降低对环境的适应性。目前，圈养野生动物是恢复野生种群和维持濒危种群遗传多样性的有效策略。然而，对于在野生和圈养环境下动物的肠道菌群组成和功能知之甚少，特别是大型的食肉动物，例如东北虎。因此，研究人员通过16S rRNA基因测序和宏基因组测序分析野生和圈养环境下东北虎的肠道菌群组成和功能。研究人员发现圈养东北虎肠道菌群有更高的α多样性。通过未加权聚类分析发现，野生东北虎个体间菌群组成的距离要大于圈养环境下东北虎个体间距离。功能差异涉及功能的大部分方面，特别是新陈代谢、环境信息处理、细胞过程和生物系统。结果表明，圈养和野生种群的饮食组成和环境差异导致了肠道菌群组成的差异，进而导致了肠道菌群功能的差异。研究人员通过对比野生东北虎和圈养东北虎肠道菌群功能和组成，有利于指导野生东北虎的保护管理和政策决策，这具有重要意义，也值得进一步关注肠道菌群对圈养东北虎野外生存能力的影响。

论文ID

原名：Comparative Analysis of Microbial Community Structure and Function in the Gut of Wild and Captive Amur Tiger

译名：比较分析在野生和圈养环境下东北虎肠道微生物组成和功能的差异

期刊：Frontiers in Microbiology

IF：4.235

发表时间：2020.07.24

通讯作者：马建章&姜广顺

通讯作者单位：东北林业大学野生动物与自然保护地学院

实验设计

研究人员通过雪地足迹追踪法采集野生东北虎的粪便，先用细胞色素B基因鉴定粪便样品的物种，然后用8个微卫星片段对样品进行个体识别，使用个体质量最好的样品进行肠道微生组分析。在中国东北虎林园采集圈养东北虎的粪便样品。采集前3个月，选择研究的东北虎未服用抗生素或其他药物。研究人员使用16S rRNA基因测序技术分析野生和圈养环境下东北虎肠道菌群组成，使用Qiime软件分析东北虎肠道微生物α多样性，并用Kruskal-Wallis检验进行组间差异比较。研究人员使用ANOSIM分析检验组间肠道菌群组间差异。此外，研究人员通过UniFrac’s 分析计算平均距离，用来测量同一组不同个体的肠道微生物群的相似性。基于加权和未加权的 UniFrac 距离，使用R语言的程序包进行主坐标分析（Principle co-ordinates analysis，PCoA）。因为核心菌群可能对东北虎整体的菌群功能有重要的作用，所以研究人员使用组成方法鉴定东北虎的核心菌群。为了分析圈养种群和野生种群核心微生物组的差异，利用STAMP软件中的t检验来检验组间在属分类水平上的差异。研究人员为了进一步探究其功能差异，筛选了6个野生和6个圈养东北虎粪便样品，进行宏基因组测序。研究人员使用LEfSe分析发现圈养种群和野生种群的肠道菌群功能在KEGG Level 2分类水平和CAZy酶上存在差异。为了准确评估肠道微生物群和功能之间的整体关系，只选取至少在一个测序样品内菌群丰度 > 0.1%的微生物进行了聚类分析。菌群类别和KEGG的Level2功能途径分别使用分类层次聚类和功能聚类。采用Spearman方法进行相关性分析。

结果

1 野生环境下东北虎粪便的样品鉴定和个体识别

通过雪地足迹追踪法共采集到163份样品，其中150份样品被鉴定为东北虎的粪便，并且通过微卫星识别到30只东北虎个体。样品程度最好的22份粪便用于16S rRNA基因测序，12份粪便用于宏基因组测序。样品采集的位置、用于分析的个体，如图1所示。

图1 野生东北虎标本采集图（150只），16S rRNA基因测序（22只），宏基因组测序（12只）。

2 东北虎野生种群和圈养种群肠道菌群组成差异

研究人员对圈养和野生老虎粪便标本进行了16S rRNA基因的V3和V4区扩增测序分析发现，在门分类水平上，厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）占总微生物组丰度的93.95%。在属分类水平上，Collinsella的丰度占东北虎肠道微生物的17.94%，其他的三个优势菌属为Clostridium_sensu_stricto，Blautia和Sphingomonas。

测序分析表明，野生老虎和圈养老虎肠道菌群的物种丰富度存在显著差异（Chao1：wild，138.41 ± 78.93；captive，292.79 ± 73.56；p < 0.001），并且其他α多样性指数与此结果相似，例如Shannon指数（wild, 2.77 ± 1.22；captive, 4.19 ± 0.39；p < 0.001），Simpson指数（wild，0.66 ± 0.24；captive，0.89 ± 0.04；p < 0.001），和Observed species指数（wild，102.77 ± 58.58；captive，182 ± 34.33; p < 0.001；图 2A）。研究人员使用未加权UniFrac距离进行聚类分析，并同过ANOISM分析发现圈养种群和野生种群肠道菌群组间差异大于组内差异（r = 0.33，p = 0.001）。东北虎的野生种群和圈养种群未加权UniFrac距离均值分别为0.717和0.551。通过基于未加权UniFrac距离的PCoA分析发现，第一个PCo轴占在相似矩阵中检测到总变异为21.68%（图2B）。研究人员将OTUs注释到属分类水平上，鞘脂单胞菌属（ Sphingomonas），Collinsella，Clostridium_sensu_stricto，和芽孢杆菌属（Lysinibacillus）是野生东北虎肠道菌群的优势菌属，Collinsella，Blautia，梭菌属（Fusobacterium），和拟杆菌属（Bacteroides）是圈养东北虎的优势菌属。东北虎野生种群和圈养种群的肠道菌群共有76菌属丰度存在显著差异，例如革兰氏阳性菌芽孢杆菌属（Lysinibacillus）和革兰氏阴性菌鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）的丰度在野生东北虎的肠道菌群中显著富集（图2C）。根据Mann-Whitney U分析发现，野生老虎和圈养老虎肠道菌群的相对丰度在其他分类水平上也存在差异，其中共4个门、29个科的肠道菌群存在显著差异。四个主要的优势菌门在野生东北虎和圈养东北虎间存在显著性差异，例如放线菌门（Actinobacteria：X = 15.54 ± 21.56%；X = 28.16 ± 23.02%），梭杆菌门（Fusobacteria：X = 0.86 ± 1.9%；X = 11.92 ± 12.95%）和拟杆菌门（Bacteroidetes：X = 1.77 ± 3.45%；X = 10.54 ± 12.59%）（图2D）。

图 2 野生和圈养老虎肠道菌群的组成和功能不同。野生和圈养东北虎肠道菌群 Chao1和其他α多样性指数箱形图。（A）Alpha多样性的Shannon和Simpson指数反映了野生东北虎和圈养东北虎肠道菌群的差异。（B）基于未加权的UniFrac距离绘制所有样品间的主坐标分析（PCoA）。（C）根据细菌的物种丰富度，选择排名前20的细菌属进行热图聚类分析，以反映物种丰富度的变化。（D）根据Mann-Whitney U分析，野生和圈养东北虎肠道菌群在门分类水平上和科分类水平上的差异菌群。

3 核心肠道微生物菌群的测定

为了分析东北虎肠道菌群的基本结构，研究人员测定了核心肠道微生菌群。经测定共有109个核心OTUs，占肠道菌群组成的24.6%。以核心细菌门之间潜在的相互作用的网络分析发现，三个菌门之间，共有79个正相关和10个模块。在属分类水平上， Blautia ，Faecalimonas和 Lachnoclostridium的相对丰度在圈养种群中显著高于野生种群，特别是Blautia，在圈养种群中的相对丰度是野生种群的1.6倍（图3A）。网络分析找到了大部分的相关性，每个菌门的相互作用和两个模块化表明，厚壁菌门（Firmicutes）与放线菌门（Actinobacteria）呈正相关（图3B）。

图3 t检验显示野生东北虎和圈养东北虎在属分类水平上存在显著差异，颜色以绿色突出（A）。Spearman相关网络分析了核心微生物门的共生模式，每个节点的大小是群落丰度的比例（B）。

4 东北虎野生种群和圈养种群肠道菌群功能的差异

宏基因组分析确认了7711个KOs，包括50个KEGG Level2分类功能。野生东北虎的肠道菌群功能在KEGG Level2上高丰度的功能为：细胞运动、形成与再生、真核生物群落，和传染病：病毒、信号传导、免疫系统、血液循环系统、运输和分解代谢、信号分子和相互作用、物质依赖、内分泌代谢病和癌症。而圈养东北虎的多糖生物合成、代谢和遗传信息处理的丰度更高（图4A）。根据酶的LEfSe分析发现，许多酶类家族在野生东北虎的肠道菌群中显著富集，包括糖苷水解酶家族（glycoside hydrolases，GH）、碳水化合物酯酶（carbohydrate esterases，CEs）和碳水化合物结合模块（carbohydrate-bindingmodules，CBMs），与此相反，糖苷水解酶在圈养和野生的东北虎肠道菌群中，主要的差异是糖苷水解酶家族（图4B）。

图4 LEfSe分析KEGG Level2 (A) andCAZy (B)在野生和圈养东北虎肠道菌群显著富集的功能和酶类。

5 肠道微生物菌群组成与功能的关系

为了识别共变的模式，研究人员通过Ward方法将野生个体的菌群分成三个聚类。聚类1的优势菌群为属于厚壁菌门（Firmicutes）的梭菌属（Clostridium），聚类2的优势菌群为属于厚壁菌门（Firmicutes）的肠球菌属（Enterococcus）和Paeniclostridium，剩余的细菌分类属于聚类3，包括5个优势菌门，主要的优势菌属为属于厚壁菌门（Firmicutes）的Blautia、属于放线菌门（Actinobacteria）的Actinoplanes和属于变形菌门（Proteobacteria）的弯曲杆菌属(Campylobacter)。根据相关结果分析，我们发现聚类2与功能群没有关系，并且聚类1对细菌的转运和分解代谢、细胞运动、内分泌系统和传染病有促进作用。聚类3与大部分功能群呈显著正相关。

圈养东北虎肠道微生物聚类与野生东北虎类似。聚类 1为属于厚壁菌门（Firmicutes）的Blautia，该菌群丰度占圈养东北虎的肠道菌群丰度的59.95%。聚类2包括属于厚壁菌门（ Firmicutes）的梭菌属（ Clostridium）、Blautia和属于变形菌门（Proteobacteria）的埃希氏杆菌属（Escherichia）。剩余的细菌分类属于聚类3，包括5个优势菌门，主要的优势菌属为属于拟杆菌门（Bacteroidetes）的拟杆菌属（Bacteroides），属于厚壁菌门（Firmicutes）的的梭菌属（Clostridium）和属于放线菌门（Actinobacteria）的迪茨氏菌属（Dietzia）。聚类1与细胞膜转运、衰老和免疫系统显著正相关，而聚类3对物质依赖性途径具有抑制作用。

研究人员发现野生东北虎的肠道菌群与代谢类别（脂质代谢，其他次生代谢产物的生物合成，异种生物的生物降解和代谢）、环境信息处理（膜运输和信号转导）、细胞过程（运输、分解代谢和细胞运动）和生物系统（内分泌系统）呈显著相关性。而圈养东北虎的肠道菌群与消化系统功能、物质依赖、寄生虫病等有显著相关性。

讨论

肠道微生物群与宿主健康密切相关，对身体的代谢、免疫、进化等诸多功能起着重要作用。分析肠道微生物群的差异是放生东北虎，以帮助东北虎扩大野生种群的关键步骤。因此，研究人员通过16S rRNA基因和宏基因组测序技术对野生东北虎和圈养东北虎进行肠道微生物组成和功能分析。东北虎的肠道菌群由17个菌门组成，厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）是最重要的组成菌门，这与之前对圈养虎肠道菌群的研究结果一致。在属水平上，Collinsella为是优势菌属，与循环胰岛素呈正相关。研究表明，Collinsella的丰度取决于宿主的饮食摄入量，圈养老虎的丰度明显更高。

与研究人员预测相反，圈养老虎的肠道微生物多样性明显更高，这可能是因为圈养老虎有更多的机会与其他个体接触，与饲养员和游客的互动更频繁。这与圈养海豹的肠道菌群多样性更高的结果相似。此外，我们还发现野生虎的未加权UniFrac距离差异较大，说明野生个体的肠道菌群组成差异较大。根据PCoA和ANOSIM分析的结果，这两组之间有明显的差异，说明野生种群和圈养种群之间的细菌群落差异明显。

通过图2D可以看到野生和圈养东北虎在属分类水平上差异明显。鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）和芽孢杆菌属（Lysinibacillus）在野生东北虎肠道菌群中显著富集，这两种菌属分别可以降解水中的铜和产生大量的酶。圈养环境下显著富集的拟杆菌属（Bacteroides）和Blautia与饲养食物中含有大量的脂肪和蛋白质有关。野生东北虎和圈养东北虎肠道菌群组成差异的原因可能是饮食和生境异质性共同作用的结果。野生东北虎活动范围广，栖息地植被类型多样，食物资源丰富。被老虎捕食的动物有10多种，通常野生东北虎每周能成功捕获一次大型猎物。然而，圈养东北虎通常以鸭、猪肉和牛肉为食，定期、连续进食和较少运动是圈养动物典型的共同特征。因此，在野生东北虎的肠道菌群中发现了许多在环境中普遍存在的微生物，而圈养东北虎体内的优势细菌与营养消耗有关。

本研究发现野生东北虎和圈养东北虎肠道微生物群的生物学功能存在显著差异。野生东北虎肠道菌群的十二种显著差异路径分为五大类（环境信息处理、细胞过程、生物系统、人类疾病等）。这些功能大部分与人类疾病有关，这些疾病本质上受到环境因素或机体系统的影响，在保证宿主正常功能和维持稳定状态方面发挥着重要作用。这些途径在野生东北虎肠道菌群中显著富集，可能是因为野生种群比圈养种群面临着更多样化的环境，比如扩大它们的领土和家园范围，以及捕猎各种猎物以获取能量供应。圈养东北虎肠道菌群显著富集的功能属于新陈代谢，可以帮助宿主消化、吸收。这与圈养东北虎虎稳定的食物摄入和相对较少的运动相关。LEfSe分析发现，圈养东北虎肠道菌群中显著富集的GHs显著多与野生东北虎，稳定的食物来源需要圈养东北虎比野生东北虎拥有更多的酶来进行新陈代谢，这证明了饮食干预的效应。

通过对比结果，我们发现，在野生东北虎的肠道菌群中，属于厚壁菌门（Firmicutes）的梭菌属（Clostridium）与传染病功能呈正相关，另一项分析也得出类似的结论，Clostridium perfringen是引起细菌性疾病的第二大常见细菌。在圈养东北虎肠道菌群的聚类3中，与物质依赖（酒精、可卡因、和苯丙胺上瘾）具有抑制性作用，此结果可能与圈养老虎服用一些治疗和预防疾病的药物有关，这也会显著改变肠道微生物群的组成。野生东北虎肠道菌群的聚类3，可以促进环境信息处理、细胞过程和生物系统这3大类的功能，这也是野生和圈养老虎肠道菌群功能的主要差异。在圈养东北虎的肠道微生中，显著富集的的梭菌属（Clostridium）、Blautia和埃希氏杆菌属（Escherichia）与寄生虫疾病感染相关，C. perfringens属于梭菌属（Clostridium）的孢子在以前研究的水中被发现。管理者可能需要监督饮用水的质量，以减少病原菌的存在。

该研究通过对东北虎粪便标本的16S rRNA基因和宏基因组分析，对东北虎肠道微生物组进行了全面的分类。通过比较分析发现，圈养和野生种群的肠道菌群组成和功能存在显著差异，饮食和环境对这些差异有很大影响。圈养东北虎与野生东北虎肠道微生物组成和功能的差异将极大地影响圈养东北虎对野生环境的适应能力。这些发现对圈养东北虎的引种和维持野生种群稳态、遗传多样性具有重要意义。

东北虎是我国一级保护动物，在IUCN红色名录中被列为濒危（CN）动物。为了保护动物遗产多样性和维持东北野生环境下的生态平衡，需要对东北虎开展一系列的科学研究。该研究通过微生物组学的一系列技术和手段对野生和圈养环境下的东北虎进行研究，分析了两种环境下东北虎菌群组成和功能的差异，发现食物和环境是造成差异的主要原因。并且，研究人员依据微生物组学的数据和分析结果，为保护圈养和野生环境下的东北虎提出了一系列合理有效的措施，并为未来的研究和管理打下了坚实的基础。