人体的不同区域如肠道、口腔、皮肤、呼吸道和泌尿生殖道定植着超过100万亿细菌，这些微生物作为一个整体，被统称为微生物群。细菌的组成和丰度对环境稳态至关重要，而微生物群不平衡（失调）对人类健康具有决定性作用。根据组织或器官的不同，生态失调可能触发不同的病理机制。尽管某些部位（如肺和阴道粘膜）的微生物-免疫之间的相互作用仍然不清楚，但最近的研究结论与微生物群的健康-宿主免疫稳态密切相关的概念保持一致。实际上，免疫细胞活性的严重程度和影响取决于组织相关细菌群落和相关的生态失调的特征。 癌症、自身免疫疾病和神经系统疾病是与微生物介导的外周免疫相关的主要病理，为广泛的人体组织参与和广泛的免疫信号传递提供了明确的实例。近十年来，神经退行性疾病与肠道和口腔微生物群的关系得到了广泛的研究，这一主题的文献综述揭示了细菌丰度变化的显著趋势。例如，帕金森病患者（Parkinson'sdisease ，PD）的微生物群中厚壁菌门Firmicutes（如粪杆菌属Faecalibacterium、梭菌属Clostridium和Blautia）普遍减少，拟杆菌门Bacteroidetes（拟杆菌属Bacteroides和普氏菌Prevotella）增加。同样，AD患者的相对丰度也发生了变化：一些属于厚壁菌门Firmicutes的属（如梭状芽胞杆菌Clostridium 和肠球菌Enterococcus）减少，拟杆菌门Bacteroidetes （如拟杆菌属Bacteroides）增加。除了共生菌群的相对丰度变化外，脑内病原体感染在神经退行性变过程中也起着关键作用。牙龈卟啉单胞菌Porphyromonas gingivalis和幽门螺杆菌Helicobacter pylori 分别与AD和PD感染细菌相关。
近年的研究表明，微生物群及其诱导免疫与神经退行性疾病的发病和进展相关。在整个机体中，微生物和分泌分子广泛与局部免疫细胞和结构相互作用，维持微环境稳态，并与远端神经免疫系统通信。例如，肠道菌群可以通过外周免疫和神经传递2种途径刺激CNS常驻免疫细胞。事实上，细菌可以直接释放（或刺激肠道细胞产生）信号介质，如与外周免疫细胞或迷走神经中枢传递相关的短链脂肪酸、脂多糖、血清素等。尽管越来越多的证据表明免疫对微生物群-脑轴十分重要，但在何种程度上微生物群-免疫通信对触发神经退行性变的作用问题仍有争议。基于此背景，本综述根据神经退行性变的发病和进展，讨论了在体外复制介导微生物群-大脑通信的广泛免疫信号的生物工程挑战。我们首先关注口腔和肠道微生物引发的外周免疫反应，然后继续研究免疫信号传递到中枢神经系统（CNS）人群以及中枢神经系统免疫活动与神经退行性疾病之间的联系。最后，我们对一种先进的体外模型进行技术分析和讨论，该模型将用于研究微生物群介导的免疫反应的神经影响（图1）。 
图1 微生物群-免疫-中枢神经系统相互作用。图中显示了生物工程方法用于重现在神经炎症和神经退行性变过程中体内主要的免疫-刺激过程。最先进的方法是基于微流控多细胞培养的芯片上器官技术（organ-on-a-chiptechnology, OOC）。 微生物群与免疫系统之间的生理相互作用是一种有益的双向交流，是2个系统内稳态的基础。细菌通过释放特定的代谢物，保护宿主不受感染，促进机体屏障完整性和免疫细胞成熟。微生物群通过物理相互作用或分子介导的刺激与宿主相互作用。细菌与宿主细胞和组织的物理相互作用主要是当病理条件导致粘膜屏障受损，并允许细菌感染。另外，细菌分子介导的持续刺激有助于形成屏障，维持免疫系统内稳态。 能够调节或影响宿主机制的细菌分子主要有：1）脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、鞭毛蛋白等结构成分；2）PPAD等功能酶；3）细菌代谢产物，如短链脂肪酸（SCFA）和吲哚- 3 -醛（芳基烃受体配体），其中大多数具有免疫调节作用，可能导致免疫耐受或增加炎症。 根据人体组织的不同，我们可以发现不同的微生物群组成，因此有特定的细菌分子和代谢产物，其主要成分（酶和代谢物）可以根据微生物相关的部位、免疫调节作用和宿主蛋白介质来分类。为了更好地描述微生物群介导的导致神经炎症和神经退化的免疫反应的第一步，本文将关注点放在肠道和口腔微生物群--2个主要与神经退行性疾病相关的细菌群落（表1）。 表1 具有免疫调节作用的细菌分子和代谢物列表。其分子的分类依据是微生物相关的部位，宿主相互作用介质和免疫调节作用。 
肠道粘膜屏障是肠道微生物群-免疫通信的关键中介物，可将细菌与固有层物理分离，主要由粘膜层和细胞上皮组成。而其中的每个组成部分都在维持肠道屏障的稳态或抵御感染方面发挥作用。在细胞上皮的基部，免疫细胞寄生在结缔组织层粘膜层。参与肠道微生物群免疫通信的免疫细胞包括先天淋巴细胞（ILC），效应T细胞，B细胞，巨噬细胞，肥大细胞，树突状细胞（DC）等。 在健康的环境中，细菌刺激免疫细胞，从而增加免疫耐受，抑制不当的肠道炎症。多糖A （polysaccharide A，PSA）是一种共生脆弱拟杆菌Bacteroides fragilis的结构成分，具有这些免疫调节作用。管腔PSA被DCs的Toll样受体2/5 （TLR2/5）捕获。在PSA与TLR相互作用后，DCs处理抗原并将其呈递给CD4+ T细胞，从而激活CD4+ T细胞。CD4+ T细胞促进调节性T （Treg）细胞的抗炎症反应，并抑制Th1和Th17细胞产生促炎症细胞因子（图2）。 
图2 细菌PSA和组织胺触发的免疫调节途径。a）细菌PSA由DCs捕获、处理和呈现。CD4+ T细胞识别并与递呈抗原的DC MHC-II结合，与PSA产生反应，刺激Treg细胞激活并抑制Th1和Th17细胞产生促炎细胞因子。b）组胺是组氨酸代谢的代谢物，主要由肥大细胞、嗜碱性细胞和细菌释放。且根据不同类型的组胺受体（Histamine Receptor, HR），组胺可导致不同的免疫调节反应（PLC, 磷脂酶C, 裂原激活蛋白激酶, MAPK, PKB, 蛋白激酶B）。 肠道生态失调严重影响信号分子的释放和相关的免疫刺激。组胺是一种生物胺，由哺乳动物细胞中的组氨酸脱羧酶（histidinedecarboxylases，HD） 和肠道细菌（Morganella morganii和 Citrobacter freundii）产生。组胺在激发适应性和先天免疫反应的释放量潜能不仅取决于细菌，还取决于肥大细胞和嗜碱性细胞（在毒素或免疫IgE介导的机制下储存和分泌的）（图2）。 因为口腔不断地暴露于外部物质（如食物、空气和微生物），故其产生了一个非常动态的环境，且其化学和微生物组成非常复杂。与肠道屏障一样，口腔黏膜的管腔层主要以上皮细胞为特征，固有层富含免疫细胞。从微生物群-免疫相互作用的观点来看，口腔并不像肠腔室那样具有明显的特征。然而，已有研究表明，口腔微生物群稳态与免疫应答密切相关，口腔抗原呈递细胞（oral antigenpresenting cells, APC）的存在保证了生理条件下的免疫耐受。日常的口腔活动（刷牙和咀嚼）及牙周炎经常会改变和损害口腔黏膜。牙龈屏障的破坏使牙周病原体（如 P.gingivalis 和A.actinomycetemcomitans）进入循环系统。在这种不健康的状态下，直接接触循环微生物及其分泌的分子，可强烈刺激免疫系统。核心病原体被定义为在牙周炎症和疾病的开始和进展中的口腔细菌（A.actinomycetemcomitans, P. gingivalis和T. denticola），这些病原体破坏免疫系统，产生适合和保护其他病原体增殖的炎症环境。而P. gingivalis似乎是这种颠覆行为的主要影响者，并与神经退行性疾病广泛相关。绕过杀菌免疫反应主要通过由LPS介导的2条信号通路协同激活：细菌结构成分和一种叫做gingipains的蛋白水解酶。 P. gingivalis LPS（pgLPS）有两种亚型，其特征是特定的脂质A区，且根据亚型的不同，免疫TLRs介导的通路被选择性地刺激或抑制。pgLPS和gingipains的协同作用形成了TLR2-PI3K-介导的信号通路，该通路可导致杀菌活性降低，促炎细胞因子（如IL-1β、IL-6和TNF-α）上调，并抑制吞噬体的形成和成熟。 将微生物诱导的外周免疫反应转化为神经炎症的机制比较复杂，主要包括胃肠道的迷走神经和全身的血管系统等2种传递途径。迷走神经支配着大部分消化道，并允许由神经递质和激素（如血清素、胰高血糖素样肽1和肽YY）介导的肠脑双向信号传递。肠道内分泌细胞和迷走神经感觉神经节都有一个受体系统来触发向中枢神经系统的信号交流，并促进肠道代谢产物对大脑功能的影响。迷走神经的神经节可以使用特定的受体如模式识别受体（pattern‐recognition receptors, PRR），G蛋白耦合受体（如游离脂肪酸受体3）和检测和处理微生物分子的5-HT-3受体（如 LPS），代谢产物（如SCFAs）或肠嗜铬细胞的细胞产品（如血清素）。感觉迷走神经传入纤维可以直接感觉到周围的炎症，并将其传递给大脑，再传递给神经免疫系统。沿迷走神经，细胞因子受体结合局部组织细胞因子浓度（如IL - 1β），并将信号传递给中枢神经系统CNS（可响应调节和维持免疫稳态）。迷走神经对周围炎症严重程度的调节是一种被称为炎症反射的精细调节机制。 在通过血管系统运输的分子中，细胞因子和趋化因子是将炎症从周围传导到大脑的主要因素。它们刺激循环免疫细胞，促进其迁移和成熟。此外，它们可以到达中枢神经常驻细胞并触发小胶质细胞和星形胶质细胞的反应。APCs增加细胞因子介导的免疫信号传递，将微生物抗原（如LPS）运送和呈递到大脑。 3.1 肥大细胞（ Mast Cells ）的作用 肥大细胞（Mast Cells，MCs）是影响免疫信号从外周向中枢神经系统传递的最主要的免疫细胞。最近，MCs被广泛认为与神经退行性疾病特有的神经炎症有关（图3）。
图3 肥大细胞（MCs）对肠道生态失调的反应。MCs对病原体相关分子模式（PAMPs）、损伤相关分子模式（DAMPs）、巨噬细胞因子和趋化因子做出反应，吞噬、处理和呈递抗原，并招募适应性和先天免疫细胞。MC释放的激素、生长因子、神经肽、炎症介质和酶导致BBB损伤和刺激CNS驻留细胞。 MCs来源于骨髓造血细胞，在趋化因子信号的作用下迁移到富含血管和神经的结缔组织。在健康情况下，MCs不存在CNS，但仍位于BBB的腔侧。MCs参与不同的机制，如组织修复和慢性炎症，因为具有感知并产生激素、酶、细胞因子和趋化因子（如胰蛋白酶、IL - 1β和CXCL2），吞噬以及处理和呈现抗原的能力。微生物群屏障上MCs的招募是由趋化因子的释放调控的，如CXCR2配体。例如，在肠壁，巨噬细胞释放趋化剂响应TLRs的激活，从而响应细菌信号的存在。MCs靠近固有层充当结缔组织和神经之间的连接，通过释放激素、生长因子和神经肽来促进迷走神经的免疫传递，这些可被肠内神经元受体捕获并翻译成神经信号。
MCs除了具有影响神经反应的潜能外，还可以直接挑战病原体，促进适应性和先天免疫反应。MCs有几个受体，不仅能感知病原体相关分子模式（PAMP），也能感知损伤相关分子模式（DAMP）。DAMPs 是细胞损伤时产生和分泌的分子。细胞外ATP是DAMPs其中一种典型的代表，主要是受损的细胞、活跃的免疫细胞和细菌在不健康的条件下产生。MCs可以通过嘌呤受体P2XT的激活和促炎细胞因子和趋化因子的产生来感知和响应ATP。在失活条件下，PAMPs的结合（如LPS和鞭毛蛋白）触发MC激活，从而导致脱粒、释放促炎分子（如TNFα、IL-1和CCL5）、吞噬和抗菌肽（如cathelicidin）的产生。由于MCs也可以作为APCs，它们也可以通过加工抗原并将其呈递给其他免疫细胞来对抗细菌感染。
MCs能促进先天和适应性免疫细胞的招募、成熟和激活。MCs主要通过分泌酶（tryptase和chymase）、抗菌肽和细胞因子来刺激先天免疫，而适应性免疫细胞主要通过MCs产生的趋化因子和细胞因子来募集和激活，如CCL2、CXCL10、IL 13和IFNγ。MCs还可通过参与屏障稳态的调节导致失活，例如，肠道血液屏障（GBB）和BBB等。 3.2 肠道血液屏障（Gut-Blood Barrier, GBB）损伤 GBB是肠道微生物和血流之间的物理屏障，由肠黏膜屏障、下层结缔组织和肠毛细血管内皮组成。GBB的通透性受到上皮细胞和内皮细胞间连接的紧密控制。结缔组织在GBB稳态中的作用尚不清楚。固有层纤维细胞似乎是GBB损伤的关键结缔组织参与者。的确，当受到细菌内毒素刺激时，固有层纤维细胞释放TNFα等炎症介质，这些炎症介质可显著促进经上皮细胞抵抗（TER）的减少，导致GBB受损。调节细胞旁通透性最重要的细胞间分子连接是紧密连接蛋白（tight junction，TJ），主要是跨膜蛋白occludin和claudin和细胞质佐蛋白1 （cytoplasmic zonulin 1，ZO 1）。影响TJ稳定性的结构元素和信号通路十分多样且不断更新。最主要的决定因素是：a）炎症介质；b）上皮或内皮F-肌动蛋白组织；c）外周炎症细胞活性。 a) 在病理条件下，MCs导致脱粒和大量释放这些促炎症分子，如TNFα， IL 1β和IFN γ。TNFα被上皮细胞和内皮细胞的肿瘤坏死因子受体识别，触发肌球蛋白轻链激酶（MLCK）的最终表达。MLCK主要通过2种机制影响细胞旁通透性：①通过F-肌动蛋白重组和occludin内吞作用刺激肌球蛋白轻链磷酸化；②促进claudin-2表达，导致上皮通透性增加。 b) F-肌动蛋白的组织与TJ屏障的完整性密切相关。显微镜和药理学分析都清楚地显示TJs和肌动蛋白细胞骨架之间的物理联系。F-肌动蛋白直接结合连接细胞骨架和其他TJ蛋白的ZO蛋白，如occludin、claudin和连接粘附分子。因此，在MLCK活性的情况下，F-肌动蛋白排列的改变直接影响TJ屏障的组织和稳定性。除了细胞因子介导的机制外，免疫细胞还可以通过不同的信号通路诱导F-肌动蛋白重排来调节GBB的完整性。例如，募集的MCs释放tryptase和chymase，这是2种激活受体（PAR2）的丝氨酸蛋白酶靶向上皮细胞或内皮蛋白酶。PAR2的分裂导致细胞骨架F-肌动蛋白的重新分配，从而导致ZOs离域。 c) 外周炎症细胞也通过细胞内诱导的一氧化氮合酶（iNOS）活性调节GBB的通透性。在生理条件下，肠上皮细胞通过组成性合成一氧化氮（NO）来维持肠道黏膜屏障的功能。在失活状态下，内毒素和细胞因子诱导炎症细胞iNOS过度产生NO。过量的NO合成会通过以下多因素的机制导致GBB泄漏：剧毒的蛋白质氧化和硝化；亚硝基化作用；肠细胞凋亡或坏死；肠细胞迁移障碍。 总的来说，GBB损伤显著增加了细菌分子、促炎信号和APCs沿血管系统进入其他身体组织的流量。事实上，GBB功能障碍与多种病理有关，如炎症性疾病和神经退行性疾病。 细菌和促炎症因子对BBB的损害是触发神经炎症和神经退行性变的关键。在生理条件下，这种屏障具有高度的选择性，避免了毒素和有害生物化学信号的通过。它由细胞和细胞外成分组成，主要包括星形胶质细胞、周细胞、内皮细胞和细胞外基质（ECM）。BBB通透性失调可使免疫信号分子和白细胞浸润。例如，MCs可以从BBB基底膜移动，穿透脑实质，直接刺激CNS常驻人群。除了这些机制外，胶质细胞（星形胶质细胞和小胶质细胞）与MCs之间的相互作用也促进了BBB的损伤。MCs可以直接与胶质细胞接触或通过外泌体沟通，而外泌体可以自由通过BBB。MC胞外囊泡含有信号分子，可用于免疫系统和中枢神经系统之间的双向通信。 星形胶质细胞是中枢神经系统中最丰富的胶质成分，是BBB的三大基本细胞之一。尽管星形胶质细胞并未确认为是免疫细胞，但其与免疫系统之间的复杂通信使它们在神经炎症和神经变性中发挥着关键作用，可通过感知和释放免疫信号分子来影响MC和小胶质细胞的成熟和激活。在存在PAMPs和DAMPs（如细菌LSP和胞外ATP）的情况下，BBB星形胶质细胞可以通过特定受体（如PRR）检测分子，并通过释放细胞因子如IL-33和IL-1β作出反应。这些白介素刺激MCs产生IL 13, IL 13进一步触发胶质趋化因子和细胞因子的产生，并增加促炎症信号传导。在CD40L/CD40介导的机制下，星形胶质细胞与MCs的直接接触。这种相互作用导致MCs脱粒并释放促炎分子，如细胞因子、组胺和生长因子。这种促炎症分泌直接影响了BBB的完整性，因为它加速了TJ的破坏和增加了细胞通透性。在这种受损的情况下，MCs可以大量穿过屏障，将信号分子直接传播到CNS。例如，小胶质细胞组胺受体（HR1 4）很容易检测到与组胺相关的颗粒释放到大脑中。同时，组胺刺激了由小胶质细胞触发的神经炎症活化作用。 MCs也可以通过释放CCL5等趋化因子，促进小胶质表型向促炎M1状态的转变。另一方面，小胶质细胞对DAMP或PAMP的检测可以刺激MCs。例如，小胶质细胞受体P2X和P2Y被ATP激活，刺激小胶质细胞趋化，促炎细胞因子和趋化因子的分泌，从而激活MCs。补充成分C5a是MCs -胶质细胞双向通信的另一个典型代表。在严重的炎症中，巨噬细胞和中性粒细胞可产生大量的C5a，沿着血管系统流动并到达CNS。因此，星形细胞、小胶质细胞和MC C5a受体被激活和上调，将炎症扩展到大脑。
由PAMPs、DAMPs和相对免疫反应引起的屏障功能障碍在所有神经退行性疾病中都很常见。其中，大多数疾病均显示出到达大脑的微生物群分子水平升高。在AD和PD中，血管系统、迷走神经运输肽和神经递质都参与了病理蛋白聚集和神经元细胞变性过程。
激活的CNS胶质细胞直接参与到大多数神经退行性疾病的发病和进展中，被细菌来源的刺激和病理特征激活，如蛋白原纤维和包涵体。胶质细胞直接对有毒的原纤维和包涵体作出反应，包围它们并触发吞噬机制和募集其他免疫细胞。而持续暴露于炎症刺激下的CNS常驻细胞会导致持续的胶质过度反应。有证据表明，这种慢性小胶质细胞过度刺激对抵抗病理信号的能力有不利影响，可转变为一种以吞噬和释放促炎分子失调为特征的自噬性衰老表型。 除了这些神经胶质反应外，星形胶质细胞和小胶质细胞在病理状态中也有特定的贡献。例如，在亨廷顿病（Huntington's disease，HD）中，突变的亨廷顿蛋白（the mutated protein huntingtin）也会影响免疫细胞。这损害了免疫细胞迁移和对化学吸引物刺激作出反应的能力。突变的小胶质细胞不能聚集外周免疫细胞（如巨噬细胞和单核细胞），因此不能对毒性事件作出适当的反应。这会导致中枢神经系统免疫失调，增加神经炎症。在PD中，非生物条件不仅影响周围免疫反应和肠道屏障稳态，而且还影响PD标志的形成和繁殖。例如，当PD屏障受损时，细菌LPS可到达大脑并促进α-syn纤维性颤动。LPS和LPS-α-syn低聚物共同刺激神经炎症，导致免疫过度反应。 AD是最常见的神经退行性疾病，其特征是认知障碍和细胞内外蛋白聚集。在AD患者中，CNS固有免疫细胞集中在蛋白聚集物附近，并释放促炎症介质（如IL 6、TNFα和TGFβ），导致病理神经炎症。在增加神经炎症和AD标志形成方面，微生物群发挥着十分关键的作用。一些肠道细菌（如 Escherichiacoli, Staphylococcus aureus和 Bacillus subtilis）能够产生Aβ纤维，而有研究表明细菌LPS可进一步促进细胞外Aβ纤维性颤动。生态失调不仅增加细菌Aβ纤维的形成，还可通过损害屏障的通透性帮助Aβ到达大脑。一旦淀粉样斑块出现在大脑中，CNS常驻免疫细胞就通过小胶质细胞清除肽作出反应。这一过程依赖于触发骨髓细胞表达受体2（TREM2）的活性，它触发吞噬、促进炎症细胞因子分泌和氧化应激。有学者发现TREM2的免疫调节是由TLR4负调控的。在生物失调的情况下，细菌内毒素（如LPS）到达大脑，激活TLR4并间接下调TREM2的表达。这导致神经炎症的过度反应和Aβ肽清除缺陷。 肌萎缩性侧索硬化症（ALS）和多发性硬化症（MS）是2种影响肌肉和神经的神经退行性疾病。肌萎缩性侧索硬化症（ALS）表现为上下运动神经元的进行性丧失，导致瘫痪、认知障碍和死亡。由于ALS的病因复杂且多因素，其发病机制尚不清楚。肌萎缩性侧索硬化症（ALS）的发生与超过50个基因有关，涉及到多种分子和细胞机制的蛋白编码，如蛋白聚集物降解的异常调节、线粒体功能障碍和轴突信号传导障碍。各种不同ALS的共同特征为全身炎症，会导致神经元死亡和ALS运动障碍。而肠道微生物失衡会增加炎症前状态和疾病的严重程度。例如，最近的研究表明，失调通过渗入GBB和增加促炎细胞因子与趋化因子（如IL-1β、IL-8、CXCL1和-2）的单核细胞表达以及ALS血清中的内毒素水平，促进了ALS的发展。 MS是一种以神经细胞纤维脱髓鞘为特征的炎症性脱髓鞘疾病，可导致大脑与其他受神经支配的身体组织之间的神经信号中断，运动功能失去控制，精神和情绪障碍。外周和CNS常驻免疫细胞的免疫反应失调可加速轴突髓鞘降解。在MS中，Treg细胞失调导致Th17细胞增殖和促炎症活性。Th17细胞通过产生促炎细胞因子和趋化因子来触发脱髓鞘，这将引来其他免疫细胞并加剧炎症。众所周知，肠道和口腔微生物失衡通过促进外周环境到大脑的促炎状态，深刻影响MS的发展。例如，失调诱导的小胶质细胞和巨噬细胞的过度反应导致大脑氧化应激和兴奋性毒性，这是多发性硬化神经变性的特征。而最近的发现表明，MS中微生物群和神经炎症之间的相互作用是双向的，有可能通过靶向微生物组成来影响病程。 总之，本文已经描述了生物复杂性微生物群免疫系统与神经退行性变的联系。目前，研究整个微生物群-免疫-CNS轴的常用实验方法是基于动物模型。根据3Rs原则（替代、减少和细化），考虑到一些不同的临床前模型与人类生理（例如,不同的微生物群组成），一种先进的体外建模诞生了——它提出了具有挑战性的战略，可降低实验体内变异性，通过分析单个微环境和生物介质来研究轴的复杂性。在细胞培养领域，生物工程和器官芯片（OOC）技术的出现适用于模拟基于人体免疫系统的机制，为更可靠的体外工具提供了新的技术输入。 由于传统的2D细胞培养系统无法重现大部分有关微生物群-免疫-CNS轴的复杂性，为解决上述挑战，OOC技术提供了一个很有前途的体外工具。目前一般用于模拟免疫功能的体外模型不包括与生理相关的条件，如原生体内微环境的流体流动、间质组织的3D结构、分子穿越多种屏障的通道，或不同细胞群之间的相互作用。最先进的免疫通信模型的主要工程特征是对免疫组织相互作用的再现。在存在组织特异性细胞类型的标准孔中培养免疫细胞仍然不能代表体内情况，在体内情况下，免疫细胞通过膜、基质、边界环境中的流动与其他细胞群相互作用，引导免疫细胞的运输、招募和信号转导。因此，当前免疫介导的OOC系统采用各种技术策略，为免疫器官相互作用建模重建人工屏障（表2）。 表2 最近的OOC模型和相关技术特征，根据免疫介导现象进行分类 
接下来，我们将讨论最新的用于微生物群免疫CNS建模的细胞培养系统，强调复制与生理相关的OOC所必需的基础工程方面（图4）。
图4 微生物群-免疫-CNS网络的理想体外模型，突出了最先进的工程系统可能实现的主要物理和生物特征。从上到下：厌氧肠道细菌的培养是在动态条件下，在生理水平的剪切应力的影响下。控制厌氧培养基流动输送分泌的细菌分子，这些细菌分子通过肠道屏障扩散，由肠上皮细胞上基于黏液蛋白的双分子层黏液重建。在屏障的另一边维持着一个已调整的氧梯度。微生物活动从血液通道招募免疫细胞在间隙，代表一个灌注微通道。间隙中的免疫细胞开始分泌炎症介质，这些炎症介质可以自由地扩散回肠道屏障。另一方面，细菌分子和免疫系统细胞因子可以通过血液到达中枢神经系统。BBB有一种选择性渗透的多孔膜调节流体的外渗和分子的扩散。最后一个腔室是由多培养的中枢神经系统常驻细胞组成的仿生3D基质，类似于大脑内的ECM。 肠道屏障是微生物群-免疫-CNS轴中炎症反应的第一介质。文献中对其体外建模有所提及，其中OOCs的典型例子通常被称为肠道芯片（gut‐on‐chips, GOCs）能成功地融合了生理学相关的特征，如细菌分子的流动，在缺氧-好氧相互作用（anoxic-oxic interface, AOI）中共培养微生物。强健的双层黏液层具有生理厚度，或为类似蠕动的运动而产生的物理变形。然而，从免疫反应建模的角度来看，目前大多数体外肠道模型缺乏组织驻留的免疫细胞。纳入典型的人类微生物群和人类免疫细胞仍然是获得可靠和可预测结果的基本需要。 免疫系统芯片首选的细胞来源是人类初级免疫细胞。理想情况下，该细胞源应具有完整的免疫功能，如抗病原体、分泌细胞因子或趋化因子、维持免疫细胞分化状态，并可大规模获得。过去，分离的人类外周血单个核细胞（ peripheralblood mononuclear cells, PBMCs）已被用于各种体外模型；PBMCs包含先天和适应性免疫细胞的混合群体，也可以分化为树突状细胞和巨噬细胞。
有学者将PBMCs引入GOC的基底外侧毛细血管通道，以模拟免疫细胞移动到固有层。采用经典的双通道或多层结构，在管腔侧建立肠上皮层，另一侧建立内皮层。炎症激活随后被LPS或葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium, DSS）在管腔通道的流入模拟，导致其通过招募PBMCs的屏障扩散。最有趣的结果是PBMCs的存在诱导了肠绒毛损伤和上皮屏障功能的改变，IL-8和其他炎症细胞因子的表达增强。此外，有研究证明LPS与肠上皮细胞的生理接触是如何帮助DC成熟，并触发它们侵入上皮细胞层——树突状细胞穿过屏障形成树突，直到它们与腔隙接触。这些例子展示了最完整和进化的肠道屏障炎症芯片模型，肠道芯片技术（Intestine-on-a-chiptechnology ）可以很好地模拟肠道屏障的腔壁，为许多工程解决方案提供可能性。
然而，上皮单层细胞下微环境的深层结构和功能还没有完全清楚。肠道微血管系统是炎症因子进入中枢神经系统（CNS）的直接通道，是微生物群-外周免疫通信的关键。双灌注腔的结构不允许对腔内分子交换现象的机理研究。目前已利用创新的快速成型技术开发了多层微器件。通过这种方式，上皮特殊结构的微相互作用和内皮细胞（endothelial cells，EC）可以以调节微尺度细胞间隙厚度的方式添加到GOC模型中，并在不同层中引入类似 ECM的生物材料，使其与 ECM更加接近，从而显著调节内皮细胞和上皮细胞的活性。因此，系统需要变得更加复杂来包括微循环体系结构的多种特征。 值得注意的是，3D结构再现仍然具有挑战性。近期最先进的模型是通过注射ECs和患者来源的小肠肌成纤维细胞后在微流控通道内重建灌注毛细血管网络建立的。侧微通道（Side micro-channels ）允许控制细胞流入中央腔（血管开始生成的位置），从而获得了一个功能性的微血管系统，也可观察对微环境刺激的反应，包括氧张力，细胞浓度，生长因子和药物治疗。将这种新的培养技术整合到GOC的腔室中，可以使ECs与肠道上皮细胞的相互作用成为可能，并实时监测免疫系统对微生物影响的反应（例如，分子运输和白细胞外渗）。在更复杂的情况下，与标准化模型相比，GOC中存在明显更强的3D肠绒毛（3D intestinal villi ）和内部微循环屏障功能。因此，我们认为，体循环与管腔流的耦合模型将为体外模拟肠道炎症开辟新的途径。 为了把肠道炎症内的直接神经接触纳入肠道芯片模型中，肯定还要对肠-脑通信过程中的触发阶段进行完整的描述。迷走神经通过与肠上皮细胞直接或间接的相互作用来连接肠道和大脑的生物学功能。最近的一篇综述中只报道了少数神经支配的OOCs的例子，仅仅只是一组有限的组织类型。他们将目前的设备分为2大类：突触和与神经连接的突触（neuroeffector junction, NEJ）芯片。在本篇综述里，我们想指出的是连接微通道的空间分区方法：受神经支配的芯片有2个突触室和多个平行的轴突通过通道。这种结构可以在特定情况下模拟2个不同的脑区之间的神经通信，比如在前人已研究的2个脑区中，或者在重建组织特定的神经相互作用时。Soucy等人开发了可重构的OOC，可在功能心脏组织芯片（cardiac tissue-on-chip）上成功地维持交感神经的支配和突触的形成。准确地说，他们通过GelPins来划分3D细胞负载材料（3D cell-ladenmaterials），利用了半月板固定效应（meniscus pinningeffect），从而重建了神经支配相互作用。本文所引用的例子均为解释肠道炎症芯片模型（intestinalinflammation-on-a-chip models）如何受神经支配提供了有价值的解决方案，从而在肠道屏障和中枢神经系统水平上模拟迷走神经的来源。 迄今为止，尚未报道利用OOC技术研究口腔微生物群对免疫系统反应影响的模型。然而，2018年，Rahimi等人提出了一个具有代表性的例子。他们开发了一种黏膜芯片系统（mucosa-on-a-chip system），以快速测定口腔黏膜对微生物种群影响的层特异性反应。黏膜芯片在微流控室的胶原基质中与人角质形成细胞（human keratinocytes）和牙龈成纤维细胞（gingival fibroblasts）共同培养，重建了口腔黏膜的管腔和管腔源相互作用。这种结构适合于通过向腔通道中加入人嗜中性白细胞（humanneutrophils ）或淋巴细胞（ lymphocytes ）来模拟上皮下层炎症（sub-epithelial layer inflammation）。对于改进和适应现有的口腔微生物群-免疫相互作用建模OOC系统来说，这是一个很有前途的起点。 BBB是免疫细胞和免疫介质进入中枢神经系统的入口，免疫细胞的通讯强度随着生理或病理条件的变化而变化。而目前，微孔径过滤膜（ microporoustrack-etched membranes）普遍被作为内皮细胞的基底来研究分子交叉扩散中的BBB。该过滤膜的厚度和渗透性必须精确调整，以允许基底运输和阻挡细胞极化，同时确保机械支持和高粘附强度。已有学者开发了一个体外平台，用于观察T细胞与血流下BBB模型的相互作用。他们提出了一种50 nm厚的新型超薄硅纳米膜，能够保证以下几个方面：1）超透气性（高达0.1 cm s−1）；2）共培养ECs与周细胞（pericytes）或周细胞培养基中富集的T细胞，在TNF-处理下的内皮层上也表现出强烈的表面不均和横穿；3）免疫细胞/内皮细胞相互作用的高质量成像。
如前所述，纳米薄膜可能在体内模拟基底层，但Koo等人更进一步，在OOC中重建了一种无膜内皮细胞灌注结构（a membrane-free endothelial cell-perfusedstructure），其目的是模拟特定分子的扩散及其对CNS的神经毒性作用。在没有任何合成膜的情况下，实质细胞（parenchymal cells）和内皮细胞（endothelium）之间的胞间相互作用达到最大值，为化学物质创造了一个生理性的暴露途径。这在细胞屏障模型中引入了一个开创性的元素。邻近内皮层的3D结构可以调节星形胶质细胞与脑源性内皮细胞的相互作用。通过调节与大脑相似的机械特性，几个研究小组已经成功地整合了3D类似相互作用。除了分子间的串扰以外，免疫细胞的转运是免疫系统-中枢神经系统相互作用建模的另一个基础。我们已经指出BBB损伤是如何引起白细胞和免疫信号分子外渗的，这些分子在脑实质内积累，从而引起CNS的神经炎症反应。 可靠的能准确清晰地描述免疫细胞进入大脑过程的体外模型可能为病理免疫反应提供有价值的见解，并有助于理解如何在其上发挥作用。免疫细胞迁移是一个多步骤的动态过程，具有复杂的时空过程：淋巴细胞最初被系在ECs上，沿着内皮细胞滚动，之后紧紧粘附，开始扩散和迁移。这发生在大脑微毛细血管内的3D动态微环境中，白细胞经内皮细胞迁移后经历血液流动并与ECM基质接触。在体外重建这些复杂步骤的困难限制了免疫细胞穿过BBB向炎症中心的分析。 经典的2D静态模型，如Transwell或Boyden室，已被广泛用于表征趋化因子信号的响应和测量细胞穿过多孔膜的迁移。虽然这些系统可以定量评估趋化因子介导的转运，但作用于EC单层细胞的生理剪切应力的缺乏，限制了内皮细胞与转运细胞的相互作用。为了真实地模拟体内血液流动，微流控系统是最合适的解决方案，它们再现了从滚动步骤到外渗的整个招募过程。最先进的体外模型包括具有生理剪切应力水平的EC刺激。尽管人们普遍认为整合这些刺激对于有效捕捉传输现象是十分重要的，但目前对于是否需要缩小剪应力范围，以更精确地调节大脑微血管上皮细胞的行为仍然无定论。一些动态BBB在体外模型中很好地复制了免疫细胞的聚集和迁移，但由于它们使用了亚微米孔的底物膜，从而阻止了细胞的跨内皮迁移（trans-endothelial migration，TEM），因此无法顺利完成进一步的重现。 一些研究表明，在2-4 µm范围内的反式毛细管孔隙直径（Trans-capillary pore diameters）足以让细胞运动，而获得无膜腔需要更复杂的制造技术。由McMinn等人设计的LENS （LumENext-Stacks）设备引导可灌注容器内衬ECs的形成，这些ECs可以在类似ECM的3D环境中自我维持。LENS包括TEM建模的所有主要特征：1）血流灌注；2）高细胞渗透性相互作用；3）3D微环境；4）在空间和时间上实时检测免疫细胞外渗过程的可能性。另一种研究免疫系统-CNS相互作用转运的扩散方法包括基于PDMS的微流控装置，该装置由3个被微柱分隔的平行通道组成。微毛细管力决定流体分离，并允许iPSC-ECs在3D基质腔内迁移，并在类似大脑的环境中形成微血管。 除了在生理学上重建免疫系统-CNS相互作用外，我们还需要模拟由神经免疫细胞介导的大脑微环境内的炎症反应。大多数体外AD模型不包括小胶质细胞介导的神经炎性改变，而是包括神经元和小胶质细胞。它们虽然可以使模拟整个炎症场景的模型更加完整，但同时也增加了系统的复杂性。此外，鲜少有学者研究包括小胶质细胞在内的BBB共培养模型。由于分离和培养纯净的小胶质细胞群体具有挑战性，因此人们一直在努力了解体外培养原代小胶质细胞长期表型表达的最佳条件。有学者还研究了AD模型中的OOC模型在神经退行性变和神经炎症中趋化因子作用下，小胶质细胞行为的可能性。他们设计了一种具有特定几何形状的微型装置，将用于研究神经元和星形胶质细胞三培养模型中小胶质细胞的招募和积累。另外，在微流控装置内的四重培养系统中，小胶质细胞和神经元被嵌入与EC微血管和星形胶质细胞相邻的胶原凝胶基质中。这提供了最完整的免疫系统-CNS相互作用模型，它可以追踪神经毒性化合物从腔室、BBB屏障到大脑的路径。
人类的微生物群可以深刻地影响几个身体组织，而免疫系统是一个关键的角色在这串对话。最近的发现证明了微生物群介导的免疫参与神经炎症和神经退行性变的几个分子机制。在神经退行性疾病中，细菌通过产生结构成分、功能酶和代谢产物来触发扩散的免疫信号反应，发挥关键作用，主要负责身体屏障损伤和大脑胶质瘤。此外，微生物群介导的免疫也通过影响特定病理特征的发展，如AD中的A β纤维或PD中的α-syn包涵体，进而影响神经炎症的严重程度，从而影响神经退行性变的进展。 整个微生物群-免疫-CNS轴以一个动态和异构的微环境为特征，即在一个复杂的化学和细胞介质构成的综合网络中表现其生物结构和过程。微流控OOCs体外建模提供了一个非常好的机会来剖析特定的轴机制，并定义微生物群介导的免疫在神经退行性疾病病因学中的真正影响。在这篇综述中，我们首先回顾了体外工程模型的主要生物学和技术特点，概述了微生物群-免疫-CNS相互作用，然后解释了最先进的技术。例如上皮-内皮相互作用的GOC重建肠道微环境，侧微通道提供了一个灌注毛细血管网络（perfusedcapillary network），采用类似ECM的3D环境，以模拟微血管系统或可灌注人工血管，为刺激外渗并实时跟踪提供了可能性。尽管如此，我们仍然需要大量的努力来调整工程参数，以建立可靠的和生理相关的OOCs。目前最具挑战性的研究方向是在3D微环境中多细胞群的共培养，多物理元素在动态功能集合中的整合与组合，多阶段OOCs中微生物与CNS的连接。 多室和动态的体外模型将为理解微生物群-免疫-CNS轴开辟新的前景，这得益于在一个相互关联的环境中汇集所有相关的细胞群的可能性。 
打赏
010-82736610
股票代码: 872612
京公网安备 11010802020745号
