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科研 | SBB：利用能量流来量化土壤中的微生物特征

2021

04/03

微生态

A-

A+

利用葡萄糖诱导的微生物活性的热耗散和呼吸数据来估计模型参数中编码的微生物性状

导读

有机物分解产生的热量是土壤中微生物活动的代表指标，但只有少数模型研究使用热量来量化最大底物吸收率，特定生长率，死亡率，生长效率等微生物特征指标。在这一实验中，构建了一种层次耦合质能平衡模型，利用葡萄糖诱导的微生物活性的热耗散和呼吸数据来估计模型参数中编码的微生物性状。此外，这些模型还用于解释在热量呼吸比(CR)中观察到的差异。使用仅在滞后阶段或整个生长阶段的数据在等温量热仪中测量的热耗散和呼吸速率来参数化四个模型变量。这四种模型分别是:(i)复杂生理模型，(ii)简化生理模型，(iii)滞后期模型，(iv)生长期模型。使用三种参数组合确定模型参数: A)仅使用散热速率，B)仅使用呼吸速率，C)同时使用散热和呼吸速率。假设“最佳”参数估计是使用数据时获得的参数（即数据组合C）。所有的模型变量都能够适应观察到的散热和呼吸速率。与仅使用呼吸速率数据相比，仅使用热耗散数据估计的参数与“最佳”估算值相似，这表明观测到的热耗散速率可以用于约束微生物模型和估算微生物性状。但是，CR变异性不能通过某些模型（例如简化生理模型）很好地模拟，这与预测CR的滞后期和生长期模型相反，表明CR可用于估计分解模型中代谢过程的表现程度。

论文ID

原名：Leveraging energy ﬂows to quantify microbial traits in soils

译名：利用能量流来量化土壤中的微生物特征

期刊：Soil Biology and Biochemistry

IF：5.795

发表时间：2021.4

通讯作者：Arjun Chakrawal

通讯作者单位：斯德哥尔摩大学自然地理系&博林气候研究中心

实验设计

对Ultuna中进行长期土壤有机物实验的土壤样品进行两次取样。两次取样的侧重时间不同，第一次实验侧重于延滞期，第二次是对数生长期。用不同的氮肥或有机改良剂对土壤进行了处理，并且所有处理进行四次重复，从每个重复块中抽取了8个深度为7 cm的子样本，通过2 mm筛子进行筛选，将每个重复块进行复合和混合，分别进行延滞期培养(LPI)实验及生长期培养(GPI)实验。提出了质量和能量平衡模型，以模拟底物对土壤微生物生物量的响应所产生的热量和碳通量（图1A）。微生物细胞成分可分为两类，即P组分和U组分。P组分(如核糖体或rRNA、核糖体蛋白等)是生长所必需的，U组分(如次生代谢、保护性色素、储备物质、高亲和力运输系统等)是生存所必需的。生理状态指数r定义了P组分在总微生物C中的比例，表示了微生物生物量的活性组分。底物被遵循Monod动力学的微生物所吸收，具有明显的生长效率Y。因此底物C (C_S)、微生物C (C_B)和CO₂的质量平衡可以写成

底物吸收率U₁和U₂分别促进微生物的生长和维持，分别为：

k_s和m_s为最大底物吸收速率，K_M1和K_M2分别为生长期和非生长期种群的半饱和常数，r为生理状态指数。Y× k_s为最大比生长速率(μ_max)，r的控制方程为

其中Krc是生理状态增加速率的半饱和常数。公式描述了当r较低时，随着C_S的增加，微生物种群的活性成分增加，但是当r接近时，其生长趋于稳定。当C_S减小时，项也减小，从而导致r减小。散热速率在实验中可以写作

其中Rq是在kJ g^-1土壤h^-1中的散热速率，而ΔH_G和Δ_CH_S分别为生长种群和非生长种群中代谢反应的焓变（kJ C-mol^-1底物）。在后者中，底物是矿化的而不需要生长，因此Δ_CH_S只是底物的燃烧焓（下标“ C”表示“燃烧”，下标“S”表示“底物”）。当底物(葡萄糖)进行有氧代谢时，微生物的生长反应可以写成

其中γ_S（对于葡萄糖而言，γ_S= 4）和γ_B= 4.2分别是底物和微生物C的还原度。值得注意的是，该公式只是导致微生物生长的复杂生化反应的宏观化学表示。通过得出的焓平衡并将燃烧焓作为参考状态，我们得出ΔH_G，如下所示：

假设所有微生物都属于生长种群，通过固定r=1简化了复杂的生理模型（图1B）。因此，公式（6）变得多余，由此产生的质量和能量平衡如下所示：

其中Δ_CH_S和Δ_CH_B是底物和微生物生物质的燃烧焓，在下面的章节中，我们对复杂的生理模型进行了一系列简化（图1B）。这些简化的模型用于描述观察到的散热和呼吸数据集。通过设置r = 0，将复杂的生理模型简化为表示底物添加后和微生物生长之前的滞后期活性，得出

先前的建模工作表明，上式无法捕获滞后期之后的指数生长阶段的细节。因此，建立了一个额外的模型（称为“生长阶段”模型），该模型仅在底物可用性不受限制的情况下使用来自初始指数生长阶段的数据来推断微生物性状（图1B）。在底物饱和条件下，与C_S相比，K_M1，K_M2和Krc可以忽略

不计，上述公式可简化如下：

又可以进一步推算出

结合两式得出其中，β_Ci和β_Hi(i = 0,1,2)定义为

最后从两个数据集中分别估算了模型参数中编码的微生物特征（图1）。GPI实验的数据用于简化的生理期模型和生长期模型，而LPI实验的数据用于延滞期期模型。对于简化的生理期模型，使用了三种参数化方法来估计参数—仅使用散热率，仅使用呼吸率或同时使用两者的数据并使用GPI数据集中的五种处理方法来处理数据。根据使用数据集进行校准或验证来使用这三种方法：方法A）仅使用散热率进行校准和呼吸率进行验证，B）仅使用呼吸率进行校准和散热率进行验证，C）同时使用热量和呼吸频率进行校准（表1）。从方法C估计的参数被认为是“最佳”估计值，因为它们是通过使用所有可用信息获得的，因此被用作方法A和B的参考。使用双因素方差分析来检验LPI试验，不同土壤处理和葡萄糖水平之间所观察到的CR是否存在显著差异。此外，使用t检验来检验模型和实验估算的CR值在每种土壤处理和每种葡萄糖水平下的差异显著。

图1 （A）底物C_S和微生物生物量C_B复杂生理模型的示意图。增长和未增长的微生物种群以U₁和U₂的速率吸收底物。不断增长的种群利用了生长效率为Y的底物(因此生长速率= YU₁);相反，非增长种群仅使用底物来维持其生存（因此维护率= U₂）。总的CO₂产生速率为RCO₂ =（1- Y）U₁ + U₂，总散热速率为R_q =-ΔH_GU₁-Δ_CH_SU₂，其中ΔH_G和Δ_CH_S分别为生长种群和非生长种群代谢反应的焓变。（B）当增长的种群是微生物生物量的主要形式时，将复杂的生理模型简化为“简化生理模型”，当非增长的种群为主要形式时，简化为“滞后期模型”，当底物不受限制时，简化为“生长期模型”。生理状态r指标控制了总微生物C在生长和非生长种群中的比例。除了只校准过的生长期模型外，这三种模型都是使用生长期和滞后期孵化实验的观测数据集进行校准和验证的。

表1 不同模型变量、数据源和估计参数列表的校准和验证方法。

结果

在LPI实验中比较了所有土壤处理的模拟结果和观察到的散热率（图2A和B）。如图2C和D所示，通过将观测到的散热率拟合到滞后期模型，估算出参数k^'_s和K_M2。总体而言，滞后期模型能够较好地解释在不同土壤处理过程中观察到的散热率（r² = 0.99），并能够预测呼吸速率（r² = 0.82）。然而，在较高的葡萄糖浓度下，该模型低估了某些土壤处理中观察到的呼吸速率（图2D）。

图2 使用从LPI数据集中观察到的散热速率（图A和B）校准滞后期模型。除了未修改的对照（图B）外，还显示了针对八种不同的土壤处理方法（图A）和四种不同的葡萄糖水平的建模和观察到的散热率（R_q）。使用来自相同LPI数据集（图C和D）的观测呼吸频率（RCO₂）验证滞后期模型。误差线代表观察到或模拟的散热和呼吸速率的95％置信区间。

使用三种参数化方法将简化的生理模型拟合到GPI实验的结果如图3所示。简化的生理模型可以高度准确地拟合观察到的R_q（图3A1-A5），但是，模型没有较好地拟合初始滞后期（最初几个小时）的散热率。与散热率相比，初始滞后期的RCO₂预测值（图3A6–A10）与观测值匹配结果更好。

图3 使用方法A(A1-A10)和B(B1-B10)对简化的生理模型进行校准和验证，使用方法C(C1-C10)进行校准。测量的热耗散率(R_q)和呼吸率(RCO₂)来自GPI数据集。模拟和观测到的热量和呼吸率分别用实线和圆表示，显示了每个模型的均方根误差(RMSE)和决定系数(r²)。

方法B使用RCO₂对简化的生理模型进行校准（图3B1-B5）可预测散热速率的总体形状（图3B6-B10），但与方法A相比，不确定性更高（r²更低）。且在方法C中观察到的呼吸速率（即同时使用呼吸和散热数据的“最佳”校准方法）并不能改善模型拟合，因为方法A和C中的RMSE和r²值相似。

使用方法A和方法C获得的参数几乎相同（图4），方法A提供的估计值接近使用所有可用数据获得的“最佳”值。相比之下，用方法B估算的参数平均值与方法A和C的平均值不同，并且不确定性更大（图4）。因此，仅散热率就可用于估计微生物特性。

图4 使用三种估计方法比较简化的生理模型估计的参数。（A）最大吸收率k_s，（B）半饱和常数K_M，（C）微生物死亡率常数k_d，（D）生长效率Y，（E）初始微生物生物量C_B_，₀。方法A的参数值绘制在y轴上，而方法B和C的参数值绘制在x轴上。水平和垂直条是估计参数的95％置信区间；黑色实线表示1：1线。

GPI实验的指数生长期基于生长期模型的拟合结果如图5所示。如预期的结果一致，与最大比增长率（β_H2和β_C2）的估计值相似，表明即使从能量或流量的角度来看，微生物的增长率也是可比的。在此模型中，两种类型的数据是独立使用的。最大吸收率k_s（由β_H2或β_C2除以生长效率Y得出）接近于根据简化的生理模型进行的校准得出的估计值。这为我们的参数估计方法提供了支持。而且，从生长期模型估算的生长效率值与用Ca（NO₃）₂处理的土壤的简化生理模型估算的效率相似，但对于其它处理的估计值过高。因此，在生长期的测量可用于估计生长速率，但并适合用于估计产量。

图5 使用GPI数据集中的散热速率（R_q）（A–E）和呼吸速率（RCO₂）（F–J）对生长期模型进行校准。模拟和观察到的热量和呼吸速率分别显示为实线和圆。显示了每个模型的均方根误差(RMSE)和决定系数(r²)。

GPI实验的指数生长期基于生长期模型的拟合结果如图6所示。GPI实验中的五个土壤处理的CR如图7所示。在GPI实验中观察到的CR是随时间变化的量，与LPI实验不同。而使用生长期模型的CR仅在指数生长期随时间变化并更好地模拟了观察到的CR值。

图6 滞后期培养实验的热量呼吸比（CR）：不同的色条代表土壤处理，误差线是标准误差（四次重复）。水平虚线表示CR的恒定值，等于葡萄糖完全燃烧时的焓变。星号表示实验和模型模拟CR值之间的显著差异（p <0.05）。

图7 生长期培养实验的热量呼吸比（CR）：不同的灰线代表测量到的CR，而黑色虚线和实线分别代表使用简化的生理模型和生长期模型模拟的CR值。

讨论

在本研究中，我们提出了一个耦合的质量和能量平衡模型来解释底物诱导的土壤热耗散和呼吸速率。与以往基于能量的模型不同，本文提出了一种与土壤微生物群落功能特征量化相关的动态模型和系统参数估计方法。使用该模型，我们从两个不同的数据集估算了底物摄取的最大速率、Monod动力学的半饱和常数、生长效率和微生物死亡率常数。此外，我们使用模型来解释两个数据集中观察到的CR，并使用不同的方法进行估计模型参数。

1. 散热率本身是否可以约束土壤碳循环模型？

通过不同方法估算的参数的比较表明：尽管仅基于热交换数据，方法A仍提供了准确的估算，而方法C的估算值最不准确（图4）。这意味着仅散热率就可以用于表征微生物特性，并且可以从能量通量推断出有关C通量的信息，反之则不然。这种方法的主要优点是，它可以利用量热仪提供的高分辨率数据。

为了让这些结果在更广泛的实验中得到应用，将微生物特征的估计值与其它研究报告的值进行了比较。文献中的葡萄糖浓度范围与LPI和GPI数据中的相似，因此可以直接与我们的结果进行比较。在这些研究中，只有两项研究使用散热数据来估计Monod动力学中葡萄糖矿化的参数。其它研究基于单次脉冲添加或一定范围的葡萄糖浓度的呼吸率测量。使用简化的生理模型从GPI数据集中估算的生长效率值趋向于文献中的较高的值。使用简化的生理模型估算的微生物死亡率和半饱和常数的数量级与先前报道的值相似。因此，基于与独立研究的比较，我们可以得出结论，我们的估计方法提供了合理的参数值。

本研究还尝试在GPI实验的整个过程中参数化复杂的生理模型。但是，由于参数数量较多，不可能进行可靠的估计。这表明仅使用散热数据的简化模型就可以提供微生物性状的可靠估计。

2. 我们能否从生长期的数据中估算出选定的微生物性状吗?

分析表明，在实验的第一部分中，生长期模型的拟合比简化生理模型的拟合更为准确。实际上，尽管总体表现良好，但在大多数生长期培养数据集中的土壤处理中，简化的生理模型未能拟合两种校准方案的初始散热率。在这些处理中，以饱和浓度提供底物，所估计的半饱和常数（K_M1）几乎比添加的底物量低一个数量级。峰周围附加数据点限制了参数值，使得简化的生理模型不能同时拟合到初始滞后期和最终的急剧下降期。相比之下，生长期模型是沿着指数增长曲线对齐的数据点进行校准的，这允许更精确的拟合，但忽略了峰值周围的数据信息。

用不稳定的底物的数据模型中，底物诱导的响应在以前的研究中被描述为滞后期和生长期贡献的总和。在本实验中，生长期模型考虑了这两个方面，并且能够拟合滞后期和生长条件下的散热和呼吸速率。因此，当专注于生长期数据时，生长期模型比简化的生理模型更灵活，并且效果更好。

在指数生长期，由于微生物在这些条件下的维持负荷最小，估计的表观效率Y非常接近实际的生长效率。因此，从生长期模型获得的Y值大于使用其它模型获得的Y值。在用稻草进行土壤处理的情况下，Y被错误地估计为大于1。这可能是由Y和CR之间的关系引起的，Y和CR之间的关系只适用于有氧条件。因此，如果其它代谢途径同时处于活跃状态，则会导致估算错误。其它代谢途径对CR的影响将在下一节进一步讨论。

3. 一个简化模型能否帮助解释观察到的CR变异性吗?

在LPI实验中，添加的葡萄糖主要用于维持呼吸，因此葡萄糖仅被分解代谢而不会导致生长。因此，1-C mol葡萄糖完全氧化为1-C mol CO₂，并产生469 kJ C-mol^-1葡萄糖热量。因此，我们可以预测CR = CR_L= 469 kJ Cmol^-1 CO₂，这也是滞后期模型假定的CR值。但是，大多数构建的模型在观察到的CR和CR_L之间显示出显著差异，双向方差分析表明，CR水平显示显著差异，但在葡萄糖水平之间无显著差异，这些偏差可以通过其它代谢途径或土壤有机质分解来解释。

在我们的实验中，CR值高于200 kJ C- mol^-1 CO₂，表明实验在有氧条件下进行。因为CR是热量与CO₂产生速率的比率，所以高于469 kJ C-mol^-1 CO₂的值表示比完全氧化葡萄糖产生更多的热量或产生更低的CO₂。因为如果高度还原的有机物正在分解，土壤有机物上的新陈代谢可能会产生大量的热量，但是会释放少量的二氧化碳。相比之下，CR值低于469 kJ C-mol^-1 CO₂，表明比完全氧化葡萄糖产生更少的热量或产生更高的CO₂。例如，当葡萄糖未被完全氧化为二氧化碳时，释放的热量和产生的二氧化碳都将减少。在发酵或混合发酵和好氧分解过程中会出现这种情况，这可以解释除泥炭和泥炭+ N处理外，其它处理的CR值均低于469 kJ C-mol^-1 CO₂。

在GPI实验中，在培养期间，CR值在150-700 kJ C-mol^-1CO₂的范围内变化，通常在生长期最低，在散热速率达到峰值后恢复。在实验的早期，CR值高于469 kJ C-mol^-1 CO₂，但在生长期则低于该阈值，这指示了从早期滞后阶段到生长期的过渡。由于分解代谢和合成代谢的耦合产物在微生物代谢的不同阶段是不同的，因此CO₂的速率和产热量并不总是成比例的。因此，CR也随时间变化。在不同处理下，微生物代谢类型中CR的时间变化可以使用生长期模型来解释，而不能用简化的生理模型来解释。

实际上，在简化的生理模型中，假定了CR值不变。这是因为简化的生理模型中的CR仅取决于微生物的生长效率。对于0.4-0.8范围内的增长效率，可以预测CR范围为364至440 kJ C-mol^-1CO₂，更重要的是，葡萄糖的CR总是小于469 kJ C-mol^-1 CO₂，说明在有氧生长条件下，系统中CR产生偏差表明存在尚未将其包含在模型中的其它葡萄糖代谢途径或土壤有机质引发的途径。有趣的是，在没有结合其它葡萄糖代谢途径和土壤有机质引发的细节的情况下，相对简单的生长期模型比简化的生理模型更好地解释了在指数生长期观察到的CR。

4. 生态影响

除上述发现外，利用能量通量估算的微生物性状还可用于研究土壤不同管理方法对生态系统的影响，例如氮的添加以及对土壤进行有机和无机改良的影响。此外，所估计的参数还可以用于研究不同土壤处理方法对添加葡萄糖的微生物反应的影响。

在LPI实验中，N的添加通常导致葡萄糖矿化增加，这反映为热量和二氧化碳释放量增加。例如，在图2B中的红线与蓝线的差异。使用滞后期模型估算的微生物特征能够捕获这种差异，这体现在吸收额外氮的土壤中底物最大利用率的较高值。这表明在有机氮含量更高的土壤中，微生物生物量更高维持呼吸作用更高。

此前，GPI实验中的污泥和（NH₄）₂SO₄处理的数据被用于研究重金属毒性和低pH对土壤长期胁迫的影响。作者得出结论，微生物群落在压力下表现出较低的热力学效率和热产量。相比之下，在本研究中的生长效率没有显示出在土壤处理之间的任何差异，表明微生物主要响应葡萄糖代谢而不是土壤处理。

最后，我们没有发现在不同土壤处理方法的最大生长速率和生长效率之间有任何差异性，这可能是由于这些以葡萄糖为主的微生物新陈代谢导致的这些性状的影响相对较小。实际上，由于资源利用率的差异，只有在不同的微生物群落中才会出现生长效率差异，而在我们的实验中，这一条件是相同的，并且差异主要由添加的葡萄糖量来决定。

作者在本文中构建了一种层次耦合质能平衡模型，利用葡萄糖诱导的微生物活性的热耗散和呼吸数据来估计模型参数中编码的微生物性状。同时通过三种参数组合估算模型参数，来比较不同参数对估算微生物性状的可靠性。结果表明，仅使用散热数据的简化模型就可以提供微生物性状的可靠估计。为进一步对微生物性状进行研究提供了一种简单的预测方法.