microRNA技术FAQ

2021
04/19

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microRNA技术FAQ


Q1:游离microRNA大部分是在exosome中,还是在exosome外?

A外周血中游离microRNA,主要是两种形式存在,一种是在exosome中,一种在囊泡外与RBPRNA bindingprotein)相互结合。这两种各自占据的比例是波动的,取决与不同的生理或病理情境。整体上来说,大部分的游离microRNA都在囊泡外。一项对于健康人血浆/血清中游离microRNA的研究提示,约66%-68%的游离microRNA,都在囊泡外,以microRNA-RBP(例如Ago2)复合体的形式存在。【Proc. Natl.Acad. Sci. (2011) 108: 5003-5008】。另一项针对前列腺癌患者的血清样品的研究结果表明,大约只有2.5%microRNA在囊泡内【Pro. Natl.Acad. Sci. (2014) 111:14888-14893】。

Q2exosome内的成分有哪些?

Aexosome作为一个细胞分泌的活性囊泡,除了囊泡常有丰富的脂类分子,糖类分子,还有各种蛋白质,DNARNA分子,现分述如下:

exosome中包含的蛋白质除了有大量与囊泡分泌调节有关的蛋白,还有许多各种信号通路相关蛋白。exosome中包含的蛋白组分,具有组织、细胞特异性,与生理、病理状态也密切相关。一项对结肠癌细胞分泌的exosome的蛋白组学分析,共鉴定出多达1800种蛋白分子,其蛋白组成非常复杂。(如下图所示)

进一步研究表明,exosome的蛋白成分和含量,与分泌该囊泡的细胞内蛋白表达密切相关,但并不完全等量对应【Mol. Cell.Proteomics (2013) 12: 343-355】。

exosome中包含的RNA分子成分也非常复杂,它包含了mRNAmicroRNA,核糖体RNAlncRNAtRNA等。根据现有的对exosomeRNA测序的结果,microRNA的含量是最高的(76.20%)。其中的mRNA大部分是以降解片段的形式存在(整体含量<2%),也有报道提示也有一些完整的mRNA,但含量极其低【BMCgenomics (2013) 14: 319】。

exosome中包含的DNA,既包含单链的DNA,也包含双链DNA。有研究在黑色素瘤细胞分泌的exosome中,利用全基因组测序能够检测到肿瘤细胞的整个基因组序列【Cell Res.(2014) 24:766-769,并与分泌它的肿瘤细胞具有高度的一致性。

Q3exosome提取有哪些方法?

Aexosome提取的方法主要有四种:

超速离心ultracentrifugation

这种方法主要是根据exosome的比重,可以通过分步差速离心或密度梯度离心来实现exosome分离。这种方法成本较低,exosome得率较高,缺点是较耗时耗力,不适合大量样品分析。

超滤ultrafiltration)或体积排阻色谱法(sizeexclusion chromatography

这种方法主要是根据exosome的体积大小(30-150nm,大部分在90-100nm左右),利用特定孔径的超滤膜或者固相介质实现exosome分离。这种方法纯度较高,缺点是分离过程容易受到残余蛋白质的干扰,完整exosome的洗脱和复原比较困难。商品化试剂盒,如Vivaspin20100kDa MWCOGE)(超滤法),Sepharase 2BCL-4B(色谱法)

大分子聚合物沉淀

这种方法主要是基于exosome的疏水性特征,利用大分子聚合物将大量exosome聚集在一起(如下图),形成较大体积的沉淀,这样通过常规离心就可以实现exosome的分离。这种方法的优点是,分离操作简单,快速,便于实现样品的批量处理。商品化的试剂盒,如ExoQuick SBI)。

免疫亲和纯化

这种方法主要是基于exosome囊泡表明会特异性表达一些抗原(例如CD9CD63CD81),利用这些抗原的抗体进行免疫亲和纯化分离exosome。这种方法的优点是所需样品起始体积很少,特异性较强,能够实现不同类型exosome的区分,缺点是成本较高。商品化的试剂盒,如Exo-FlowSBI)。

Q4:如何对提取的exosome进行评估?

对提取的exosome可以根据实验室的条件,开展以下质控:

电镜:优点是金标准,能够直观看到囊泡形态学特征,缺点是实验较复杂,且需要特定仪器设备。

囊泡粒径测定:优点是金标准,能够直观看到提纯的囊泡在大小上的分布,从而明确囊泡的纯度,操作简便,缺点是需要特定仪器设备(NanoSightParticle Metrix等)。

囊泡特异性蛋白免疫印迹:用WB检测提取的exosome中囊泡特异性蛋白的表达。优点是简单易行,缺点是无法确定囊泡完整性和含量。

囊泡特异性蛋白流式测定:用特定染料标记提取的exosome,然后和偶联了囊泡特异性蛋白的微珠孵育,最后用流式检测。优点是简单易行,能够分析囊泡的完整性,缺点是成本较高。

Q5:如何保存提取的exosome

A需短期保存,可将exosome储存在4℃一周;需长期保存,可将exosome储存在-20℃或-80℃。冻存的exosome不建议多次冻融,这将破坏exosome的完整性。

Q6exosome中的microRNA可以通过那些方法来检测?

A基本上,所有常规的microRNA检测方法都可以用于exosome中的microRNA检测,例如测序,芯片,定量PCR,但可能在操作方法上需要进行一些特定的优化。

Q7:外周血游离microRNA检测最大的挑战性有哪些?

外周血游离microRNA检测最大的挑战性有以下几点:

由于血浆/血清中microRNA含量过于低,所以提取,反转效率不稳定,批次间差异较大。

优化的方案:加入精确定量的,人工合成的其他物种microRNA作为spike-in参照,通过检测该microRNA的含量,来评估不同批次间的microRNA实验差异。

血清/血浆中成分复杂,含有一些可能影响后期microRNA检测(PCR反应)的物质。

优化的方案:对于特定类型的血清/血浆,根据不同的检测方法,应该先进行不同体积起始样品的优化实验,确定该类样品实验最合适的起始体积。

对溶血及其敏感,释放的血细胞胞内microRNA会严重稀释原来游离的microRNA

优化的方案:可选择最主要的血细胞污染来源(红细胞,血小板)的高丰度microRNA作为溶血质控参照物(常用的有miR-451amiR-23a-3p)。通过检测这些microRNA的表达量,来评估溶血程度。

缺乏稳定和公认的内参。

优化的方案:可选择多条在健康人群中血清/血浆中高丰度表达的microRNA作为参照,常用的有miR-30c-5pmiR-103-3pmiR-124-3pmiR-191-5p

Q8:研究外周血microRNA,应该关注位于exosome内还是exosome外的microRNA

A选择exosome内外的microRNA作为研究的对象,应该根据研究的目的,开展条件等具体因素确定。

专注在exosome外的microRNA,优点是microRNA含量较高,较易检测到,项目运行成本较低,缺点是检测结果容易受到Q8中提到的多项因素的影响,工作流程稳定性较差,操作者间偏差较大。

专注在exosome中的microRNA,优点是工作流程易于标准化和质控,抗外界因素干扰能力较强,结果的可重复性较好,生物学意义较明确;缺点是exosomemiRNA含量较低,分离鉴定的实验流程较复杂,实验设施要求较高,项目成本较大,这些不利因素对于初学者来说都是很大的挑战。

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关键词:
FAQ,技术,囊泡,蛋白,方法,细胞,样品

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