三种新型双抗平台: LegoBody、AliCE、mAb2

LegoBody（乐高抗体）设计中主要应用了凝血酶（Thrombin），该酶切割序列专一性强，水解效率高，被广泛用于切割标签。

凝血酶的最佳切割位点是X4-X3-P-R/K-X1-X2,其中X4和X3是疏水氨基酸，X1和X2是非酸性氨基酸。该抗体平台由加州大学旧金山分校Liu Bin 团队开发（2019年在预印本杂志biorxiv发表）。其双特异抗体设计如图1所示。

为了防止抗体重链的错配，其采用了常规的Knob-In-Hole技术；为了防止抗体轻链的错配，将抗体的轻链通过linker(GLVPRGSGSGGGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGSGGLVPRGS）与对应的抗体重链相连接，该linker的在轻链的C端和重链的N端都加入可以被凝血酶水解的序列(GLVPRGS)，当抗体纯化后，利用凝血酶将linker切割，从而形成不含linker的双特异抗体。

图2：ELISA检查双抗结合活性（Ipilimumab：Ipili， Daratumumab：Dara）

除了可以很方便的构建双特异抗体外，LegoBody还可以很容易的构建三特异或者多特异抗体（图3）。

稳定性方面，AliCE双抗体（ACE-05）的溶解温度在67°要高于BiTE的62°。并且抗体在室温下，不同PH溶剂中还保持很高的稳定性。

mAb²双抗平台由F-star开发，该平台与其它双特异抗体不同，不是通过引入新的Fab,scFv或者VHH（纳米抗体），而是引入Fcab—一种可以结合抗原的Fc。Fcab的构建主要是通过对抗体Fc端的CH3区域进行改造，使CH3部分具有结合抗原的能力。

在介绍Fcab之前，我们先了解一下CH3的结构，CH3区含有3个Loop区，AB loop (R355-Q362), CD loop (S383-Y391) 和EF loop(D413-V422)，其结构如图9所示。而Fcab的改造是在AB loop和EF loop区改造。 

Fcab的改造主要是通过酵母展示系统进行筛选，首先是通过PCR构建AB loop区突变库，然后通过流式细胞仪分选能够结合目标抗原酵母。初步筛选到的Fcab结合能力会比较差，为了提高其亲和力，需要在初步筛选的基础上，再对AB loop 和EF loop进行随机突变并构建酵母展示库。经过流式细胞仪分选得到高亲和力的Fcab（与初次筛选相比，通过降低抗原的浓度筛选高亲和力的抗体）。

图10：野生型CH3氨基酸序列以及突变的AB loop和EF loop区在抗体结构中的位置

mAb2是在单克隆抗体的基础上加入可以结合第二个抗原的Fcab形成可以结合两种抗原或者同一抗原上的两个表位的双特异抗体.该双特异抗体为2+2的形式（图12），因为改造后的Fcab为同源二聚体，且每个单体都可以结合一个抗原。该双特异抗体在表达上和单克隆抗体相同，因此与不对称双抗相比生产工艺更简单，高效。

F-star基于mAb2双特异抗体平台的项目共有三个，FS118，FS120和FS222，其中靶向LAG-3/PD-L1的FS118进展最快，即将开展2期临床。

LegoBody可以像乐高一样随意的将不同靶点抗体进行组合，甚至可以在抗体的末端加入纯化标签如His-Tag或者Twin-Strep-Tag,只需要在Tag和抗体之间加入凝血酶位点即可在纯化后清除Tag序列，该技术的缺点是凝血酶酶切后会有氨基酸序列残留，另外，通过linker连接后，抗体链序列较长可能会影响抗体的表达。

AliCE为2+1形式的双特异抗体，与非对称IgG型双特异抗体相比，生产更加简单，一步亲和层析纯化后可以到达较高的纯度，在错配方面几乎观察不到错配分子。在稳定性方面，该双抗与IgG抗体类似，有较高的稳定性；关于亲和力和药效，该双抗因为可以包含两个肿瘤相关结合位点，因此比BiTE有更好的治疗效果；在Off target效应上，因为与CD3的结合结合能力较弱，因此副作用更小。依据该平台，Y-BIOLOGICS已经有两个项目正在开发中。

mAb2双特异抗体平台是在单克隆的抗体的基础上对Fc端的CH3进行改造，使其能够结合第二个抗原并形成2+2的形式，与单克隆抗体相比，其半衰期，稳定性，与Fc受体的结合能力基本相同；与其它非对称双特异抗体相比其生产工艺更加简单高效。

2、Seil Jang, Jaeho Song, NaYoung Kim et al. Developmentof an antibody-like T-cell engager based on VH-VL heterodimer formation and itsapplication in cancer therapy.Biomaterials2021

3、G.Wozniak-Knopp, S.Bartl, A.Bauer et al. Introducingantigen-binding sites in structural loops of immunoglobulin constant domains: Fc fragments with engineered HER2/neu-binding sites and antibody properties. Protein Engineering 2010

4、Elisabeth Lobner, Anne-Sophie Humm, Georg Mlynek et al. Two-facedFcab prevents polymerization with VEGF and reveals thermodynamics and the 2.15 Åcrystal structure of the complex. mAbs 2017

5、F-star 官网 https://www.f-star.com/