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科研 | Gut Microbes：自然分娩中早期生命环境暴露对肠道生态系统的影响较小

2021

04/01

微生态

A-

A+

导读

通过接受多种与分娩相关的干预措施，越来越多的证据表明，环境是剖腹产婴儿胃肠道定植细菌的重要来源；然而，环境微生物对阴道分娩婴儿的影响程度尚不清楚。通过调查农村和城市环境暴露对阴道分娩小鼠微生物建立和免疫的影响，确定农村和城市土壤暴露对幼鼠肠道菌群的影响，并了解这些变化是否会持续到成年。实验通过在笼子中添加土壤类型来模拟农村和城市的家庭环境。人们发现，早期土壤暴露对新生肠道微生物区系的丰富度影响不大，在早期和成年期间，小鼠之间的细菌群落结构分别有5%和9%的差异。暴露在城市土壤中会使Clostridiaceae和丙酸增加，这种情况会一直持续到成年。虽然土壤暴露对肠道类群的影响有限，但系统的细胞因子和趋化因子谱在成年后发生了变化。研究结果表明，自然分娩后的环境暴露对肠道微生物类群的影响有限，但在晚年免疫介导的疾病易感性方面可能起着重要作用。

论文ID

原名：Early life environmental exposures have a minor impact on the gut ecosystem following a natural birth

译名：自然分娩中早期生命环境暴露对肠道生态系统的影响较小

期刊：Gut Microbes

IF：7.74

发表时间：2020.12.24

通讯作者：Miranda Hart & Deanna L. Gibson

通讯作者单位：加拿大奥卡纳根校区生物系

实验设计

早期微生物群在新陈代谢、肠道内稳态和生理、免疫成熟和耐受性等健康结果中起着关键作用。在分娩和分娩期间，新生儿暴露在密集的细菌群落中。在手术室中发现，经阴道分娩的婴儿在很大程度上受到产妇阴道细菌群落的侵袭，而剖腹产婴儿则获得皮肤样微生物。剖腹产造成的初始细菌的相应差异与炎症性肠道疾病、白血病、食物过敏、肥胖和1型糖尿病等疾病的风险增加有关。因此，手术室环境中微生物被认为是导致剖宫产婴儿生物失调的一个影响因素。但是除了环境外，其他干预措施包括抗生素也可能使婴儿微生物失调，因此需要将医院环境的影响与其他医院干预措施分开。Combelick等人在没有所有干预措施的情况下，通过检查在医院出生的经阴道分娩的婴儿与在家中出生的婴儿的粪便微生物区系差异，解决了这一问题。他们发现，两组纯母乳喂养婴儿的微生物区系不同，证明了环境在经阴道分娩婴儿中的作用。尽管有这一重要发现，但对环境微生物特征的研究相对较少，而早期生活环境仍然是阴道分娩婴儿微生物建立过程中被忽视的一个方面。农村和城市生活环境可能会影响阴道分娩婴儿的早期微生物建立。在这项研究中，讨论了物理环境在非常早期的生命中建立肠道微生物区系中的作用。主要目标是确定乡村、城市或没有土壤暴露对经阴道分娩的C57BL/6幼鼠（3周大）肠道菌群的影响。第二个目标是了解这些变化是否会持续到成年。与此同时，实验试图了解早期肠道微生物群对宿主健康的生理影响。我们假设，在没有剖腹产常见的与出生相关的干预措施的情况下，早期的环境暴露将影响阴道分娩小鼠的微生物免疫系统。

结果

1 早期暴露于各种环境中在门水平上对肠道微生物没有影响

粉尘是室内暴露的很大一部分，三分之二的粉尘来自从外部追踪进来的土壤，因此实验通过将农村（森林）或城市（停车场）土壤添加到小鼠繁殖到断奶期间笼子床垫材料中模拟了农村和城市的家庭环境。另外没有土壤的养殖笼子作为无菌医院环境。目标是确定乡村、城市或没有土壤暴露对幼龄（3周大）小鼠肠道菌群的影响。第二个目标是了解这些变化是否会持续到成年。与此同时，通过对宿主免疫细胞因子和微生物短链脂肪酸（SCFA）进行量化，以了解早期肠道微生物群对宿主健康的生理影响和潜在机制。

两种土壤基质具有不同的物理、化学和微生物学特性，农村土壤的细菌总数（3217 OTUs）高于城市土壤（2818 OTUs），说明两种土壤模拟了两种不同的新生儿生活环境。为了了解环境对肠道微生物群的影响，小鼠在特定的环境中繁殖，幼鼠在这种环境中出生和饲养，直到断奶。其中一些小鼠被安乐死，并在3周时检查肠道微生物群，而另一组小鼠被转移到正常的笼子环境（没有土壤）3周，以了解在没有出生环境的情况下，3周的变化是否持续到6周。通过元基因组测序分析，并比较了城市、农村和未暴露的实验组中的优势微生物门。16S rRNA测序数据显示，早期环境没有显著改变新生儿或成年小鼠肠道中主要细菌门的相对丰度（图1a）。无论环境如何，新生和成年小鼠肠道微生物区系中最丰富的细菌门是Bacteriodetes和Firmicuts（约占OTU总数的97%）。在新生小鼠中，三组中最丰富的类群是Firmicuts，在农村、城市和无土壤中的相对丰度分别为61%、57%和69%，而在成年小鼠中肠道微生物区系由Bacteriodetes（农村占53%，城市占57%，无土壤占44%）和Firmicus （占农村占44%，城市占40%，无土壤占54%）共同控制。Tenericutes是新生小鼠特有的，占相对丰度的1.2-2%。成年小鼠的肠道中含有Proteobacteria（农村为0.4%，城市为0.9%，没有土壤为0.1%）。总体而言，早期土壤暴露没有显著改变幼年或成年小鼠肠道微生物区系在门水平上的组成。

2 早期暴露在土壤环境中瞬间改变了微生物的丰富度

为了评估早期土壤暴露是否与肠道微生物群落内细菌丰富度和均匀性的变化相关，绘制并比较了α多样性指标。发现α多样性估计与土壤暴露无关，也没有发现环境对在3或6周大的小鼠Observed、Chao1、Shannon、Simpson和Inverse Simpson多样性的显著影响（图1b）。β多样性受到早期生命环境的影响，解释了3周龄和6周龄实验组之间5-9%的差异（图1c）。PERMANOVA和多变量离散度分析的结果表明，尽管个体间有很高的变异性，但3周龄实验小鼠的微生物群落存在显著差异（Adonis R2=5.67%，P=0.041）。这些早期肠道细菌群落结构的差异一直持续到成年（Adonis R2=9.87%，P=0.061）。总体而言，这些发现证实了环境在生命早期对肠道微生物组成的影响很小。

图1 环境暴露和肠道微生物多样性。

3 早期城市土壤暴露显著增加了幼年微生物区系中Clostridiaceae的丰度，并持续到成年

为了进一步调查不同群体之间群落组成的差异，进行了LEfSe分析，确定了幼鼠早期环境暴露的三个肠道微生物分类生物标记物（图2a）。早期接触城市土壤的幼鼠生物标志物是Clostridiaceae科，而不接触土壤的生物标志物是未分类的系统类型。在早期接触农村土壤的幼鼠身上没有发现生物标记物。在6周大的成年小鼠中，LEfSe确定了早期环境暴露的四个肠道微生物分类生物标记物（图4b）。早期接触城市土壤的成年小鼠生物标志物是Clostridium属。相比之下，无土壤鼠的特征是Allobaculum spp.和两个未分类的系统类型水平升高。与新生小鼠相似，早期暴露在农村土壤中成年小鼠没有发现的生物标志物。总体而言，早期暴露于城市土壤可能增加了Clostridiaceae科在肠道的定殖和建立。同时结果表明，在农村（P=0.01）和城市土壤（P=0.05）暴露的小鼠（图2b）中，细菌生物被膜的数量随着年龄的增长而增加。

图2 早期暴露于农村土壤、城市土壤和无土壤的小鼠之间丰富度差异的微生物类群。

4 城市土壤小鼠盲肠丙酸的产量随着年龄的增长而显著增加

为了了解暴露人群中微生物群落结构差异和代谢差异之间的相关性，我们对SCFA进行了量化。SCFA分析显示，每个暴露组的乙酸和丁酸水平在3周和6周没有显著差异（图3）。农村土壤和非土壤组新生小鼠与成年小鼠的丙酸产量相似，但城市土壤小鼠盲肠丙酸的产量随着年龄的增长而显著增加（P=0.003）。总体而言，城市土壤暴露与6周龄小鼠的丙酸增加相关，这表明随着啮齿动物年龄的增长，早期城市土壤暴露会影响肠道健康和免疫力。

图3 早期土壤暴露与不土壤暴露对盲肠短链脂肪酸（SCFAs）相对浓度的影响。

5 早期农村土壤暴露增加幼鼠结肠巨噬细胞浸润

考虑到微生物生物标志物的变化，通过免疫荧光量化免疫细胞数量，研究了土壤暴露对淋巴细胞、中性粒细胞和巨噬细胞/单核细胞等肠道淋巴细胞的影响（图4）。早期农村土壤暴露导致新生小鼠结肠粘膜下层F4/80+巨噬细胞浸润高于城市土壤和未暴露土壤的小鼠（P=0.03，3周龄）。但这种结肠巨噬细胞浸润在成年小鼠中没有持续增加，在6周龄时，各组之间的巨噬细胞计数没有显着差异。同样，实验组的中性粒细胞浸润或CD8+T细胞在3周龄或6周龄时也没有显著差异。在3周龄和6周龄时，结肠细胞因子的表达在局部细胞因子反应中也没有差异。综上所述，这些结果表明，婴儿期早期环境暴露对肠道免疫的影响不大；然而，在农村土壤暴露后，巨噬细胞浸润显著增加，这表明其对早期宿主免疫反应有短暂的影响。

图4 早期农村土壤、城市土壤和无土壤暴露对新生（3周大）和成熟小鼠（6周大）肠道免疫细胞浸润的影响。

6 早期暴露于农村土壤和城市土壤与成年小鼠血清细胞因子和趋化因子浓度改变相关

虽然肠道免疫基本上不受早期生活环境的影响，但为了了解它是否对系统免疫有影响，我们对血清细胞因子反应进行了量化。IL-1α、IL-1β、 MCP-1、IL-10和TNF-α等细胞因子在3周龄和6周龄时无统计学差异，提示各组小鼠细胞因子免疫功能正常。虽然实验各组的细胞因子谱没有不同，但幼鼠和成年鼠之间存在年龄相关变化（图5）。具体地说，在农村（P=0.003）和城市土壤试验组（P=0.005）的幼鼠和成年鼠之间，趋化因子嗜酸性粒细胞的浓度增加。此外，农村土壤组的血清粒细胞集落刺激因子（G-CSF）浓度随年龄增加而升高（P=0.015）。相反，城市土壤组6周龄小鼠血清抗炎IL-13浓度低于3周龄小鼠（P=0.03）。无土壤组成年小鼠血清中分泌的促炎细胞因子IL-6的浓度也低于新生小鼠（P=0.01）。除了这四种趋化因子和细胞因子外，所有其他细胞因子和趋化因子浓度在两个年龄段的不同暴露组中都是相似的。综上所述，早期环境暴露没有改变幼鼠的全身性细胞因子反应，但与年龄相关的全身性细胞因子和趋化因子的变化有关。

图5早期环境暴露于农村土壤、城市土壤和无土壤对新生和成熟小鼠血清细胞因子和趋化因子反应的影响。

讨论

在这项研究中，我们调查了农村和城市环境暴露对经阴道分娩的C57BL/6小鼠微生物建立和健康的影响。由于土壤细菌群落的分类组成在生物区系、理化等级和人类活动之间存在差异，对采集自农村和城市环境的土壤进行了表征。研究发现，与农村土壤相比，城市土壤的生物多样性降低，土壤细菌数量减少，菌丝长度变小。通过对各组小鼠肠道菌群的研究结果发现，与拟杆菌属相比，幼鼠的肠道微生物群最初是由 Firmicutes 占主导地位，随着老鼠年龄的增长， Bacteroidetes 增多，这一转变与在4岁以下儿童中观察到的情况不谋而合。这表明土壤暴露对门水平上的微生物多样性没有显著贡献。同样，在3周或6周龄小鼠中，α多样性指数没有差异。β多样性分析同样发现，土壤暴露对微生物群落组成的影响有限。实验组肠道群落聚集度较高，对细菌群落变异的贡献率为5-9%。在许多情况下，检测到的细菌来自阴道，这表明实验组中的微生物区系主要来自分娩期间母亲的暴露。然而，不同分组LEfSe分析生物标志物不同。值得注意的是，暴露在城市土壤中的小鼠增加了 Clostridiaceae 的数量，而在没有土壤的情况下饲养的小鼠 Allobaculum spp. 丰度增加。 Allobaculum spp. 作用的认识有限其抗炎作用尚不清楚，而 Clostridiaceae 常常与健康状况不佳有关。这个类群丰度增加可能表明，城市土壤暴露增加了过敏的风险。为了支持这一观点，实验观察到城市土壤队列中系统性嗜酸性粒细胞趋化蛋白表达随着年龄的增长而增加，这在变态反应性疾病的发病机制中起着核心作用。然而，在没有明显过敏相关微生物模式的农村土壤队列中也观察到了相对的嗜酸性粒细胞趋化蛋白表达。此外，IL-13在城市土壤队列中的表达随年龄增长而降低。IL-13是过敏性气道反应所必需的，并促进B细胞的同型转换以产生IgE。因此，嗜酸性粒细胞趋化蛋白表达增加可能是自然衰老现象。此外，与医院分娩婴儿中常见的 Clostridiaceae 不同，定居在城市土壤队列中的 Clostridiaceae 不太可能是致病性的，因为主要细胞因子或趋化因子的表达在实验组之间没有差异，而且丙酸随着年龄的增长而增加，这在适当的水平上是有益的。然而， Clostridia spp. 升高值得注意。在自闭症患者中也观察到丙酸的产生，但在我们的小鼠中没有发现明显的行为异常。这项研究的结果表明，土壤中的环境微生物，无论是来自城市还是森林的土壤微生物，对婴儿的微生物定殖影响很小，但会随着年龄的增长影响基础细胞因子的产生。免疫老化轨迹的改变可能对宿主对感染性病原体的反应能力很重要，从而导致过敏或自身免疫性疾病等慢性病的发展。

本研究通过使用城乡土壤来创造独特的家庭环境进行了验证。发现表明，自然分娩环境中环境的影响是有限的，但不是可以忽略的。尽管出生环境几乎没有引起微生物类群的变化，但出生环境可能会影响晚年的疾病易感性，包括传染病或慢性病（包括过敏和自身免疫性疾病）。未来的研究需要更好地理解早期环境暴露对阴道分娩婴儿的生理影响。