科研 | Nature Communications：胃肠道微生物预测患者结核病治疗期间的外周炎症状态

2021-03-31 微生态

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导读

胃肠道微生物的组成可以显著影响全身的免疫应答，但其对传染性疾病的发病机制和抗生素的治疗效果的影响知之甚少。由于目前难以分离抗生素诱导的病原体清除和相关微生物改变的免疫效应，因此上述问题在人群中研究较少。在本研究中，研究者分别分析了两个结核病（tuberculosis，TB）治疗的纵向研究队列（35人和20人）和一个包含55名健康对照者的横断面研究数据。在这些研究中，研究者分别收集了受试者的粪便样本（用于微生物组分析）、唾液（用于确定结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，Mtb）的细菌负荷）和外周血（用于转录组分析）。此外，该研究通过比较标准TB治疗和不减少Mtb载量的实验性疗法将微生物效应从病原体灭菌中分离。对来自两个纵向队列的微生物组-转录组-唾液样本数据的随机森林回归分析显示，TB炎症状态的重新正常化与Mtb病原体清除，与Clusters IV和XIVa Clostridia的丰度增加以及Bacilli 和Proteobacteria的丰度降低有关。健康个体的独立队列中的外周基因表达和微生物组分析显示出相似的关联。该研究结果表明，抗生素诱导的病原体丰度降低和微生物变化与治疗诱导的活动性TB炎症反应变化相关，而抗生素治疗的反应可能是病原体清除和微生物驱动的免疫调节的综合作用。

论文ID

原名：Gastrointestinal microbiota composition predictsperipheral inflammatory state during treatment of human tuberculosis

译名：胃肠道微生物预测患者结核病治疗期间的外周炎症状态

期刊：Nature Communications

IF：12.121

发表时间：2021.2.18

通讯作者：Michael S. Glickman & VanniBucci

通讯作者单位：康奈尔医学院免疫与病原微生物系、马萨诸塞大学微生物组研究中心

实验设计

图1 本研究实验设计概述。A.该研究调查了来自海地的三个不同队列的微生物组与转录组的关系。其中，队列1：进行2周的纵向和干预性临床试验，包括对研究志愿者进行的随机临床试验的二次分析。在此基础上，研究者收集了活动性结核病患者体内结核分枝杆菌的细菌载量（TTP），粪便微生物组分析和外周转录组学分析，然后随机分为HRZE治疗组（TB标准治疗）或硝唑尼特治疗组（Nitazoxanide，NTZ）。队列2：进行6个月的纵向和观察性研究，受试者在在6个月的TB治疗过程中一直接受随访研究，同时收集了受试者的TTP，粪便微生物组和转录组数据。队列3：（横断面和观察组）由单独招募的健康志愿者组成的横断面和观察性研究，其中大约一半是健康以及结核病阴性的活动性结核病患者的家庭接触者（family contacts，FC），另一半是没有已知结核病暴露的社区对照（community controls，CC）。该研究也对上述个体进行了粪便微生物组分析和外周转录组分析。B.本研究不同研究队列中所纳入的个体数量。C.本研究所纳入的受试者样本采集及相应分析的示意图。

结果

1 HRZE或NTZ治疗两周后患者肠道微生物群多样性显著降低

在海地太子港的GHESKIO中心开展了一项前瞻性、随机、早期杀菌活性（early bactericidal activity，EBA）研究（NCT02684240），研究对象是初治、药物易感且无并发症的肺结核（tuberculosis，TB）成人患者。本研究中，30例受试者随机分为两组，一组给予NTZ治疗，口服1000 mg，每天2次；另一组给予标准口服治疗（HRZE），即异烟肼每天300 mg，利福平每天600 mg，吡嗪酰胺每天25 mg/kg，乙胺丁醇每天15 mg/kg，共治疗14天（图1A、2A），同时对5名受试者进行预筛选以接受HRZE治疗。本试验的主要终点是基于BACTEC液体培养系统中的痰液样本中的细菌载量（time to culture positivity，TTP）作为微生物学评价指标。每隔一天下午6点至上午9点收集受试者的痰液样本，以量化每种治疗方案中受试者体内的结核分枝杆菌活性。

与线性混合效应模型的基线TTP相比，HRZE在治疗的前两周导致受试者体内TTP可预测性增加（对应于减少的细菌载量），而NTZ作为治疗的参考水平（图2B）。尽管NTZ在体外具有较高的活性，但患者在治疗14天后对TTP并没有显著影响（p>0.05）（图2B）。原因可能是由于NTZ未能穿透痰液进而无法发挥抗菌作用。因此，相关受试者随后都进行HRZE标准治疗。

尽管研究者在之前的研究中已经报道了使用HRZE疗法可清除Clostridiales，但相关研究的横断面设计没有考虑到上述影响的快速性，最重要的是，没有包括用于评估基线微生物组成的预处理样本。为了研究HRZE或NTZ干预引起的患者肠道微生物组的变化，该研究提取并扩增了患者肠道内细菌和古生菌的DNA，同时采用V4-V5区进行16S rDNA测序分析。分别在治疗开始前和治疗第14天收集患者的粪便样本（图1A）。基于Bray-Curtis距离算法的主坐标分析（Principalcoordinate analysis，PCoA）显示，微生物组数据中变化最大的组分定性地代表了NTZ处理两周后患者肠道微生物组群落结构发生的变化（图2C）。

此外，为了比较两种干预方式对患者肠道微生物组a多样性的影响，研究者分别统计了每个样本的Inverse Simpson多样性指数，并通过线性混合效应模型（Diversity~Sex+Age+Batch+Treatment+Time+Treatment: Time+1| ID）对该指数进行了回归分析。我们发现两臂基线之间的α多样性没有差异，而两种治疗均显着降低了微生物多样性（p <0.01，请参阅补充数据3），NTZ治疗与HRZE相比没有显着差异（p>0.05，参见补充数据3）（图1D）。

图2 经HRZE或NTZ治疗两周后均改变患者肠道微生物群多样性，仅HRZE治疗降低Mtb的细菌负荷。A.比较HRZE和NTZ体内病原菌清除效果的临床试验示意图。B对于NTZ治疗组和HRZE治疗组，在第0天和第14天配对的结核分枝杆菌痰液样本阳性反应时间（TTP），数据显示为2~3个技术重复的范围。其中, HRZE组：n=16; NTZ组: n=19。利用线性混合效应模型（TTP~1+Sex+Age+ Treatment+Time + Treatment：Time+1|ID）来确定各组治疗后及预处理中差异的显着性，其中“Treatment”表示NTZ治疗组和HRZE治疗组，“Time”表示患者经抗生素处理前后的时间，“：”表示相互作用项。C.基于Bray-Curtis距离算法的主坐标分析（PrincipalCoordinate analysis, PCoA）显示HRZE和NTZ治疗14天前后受试者个体间肠道微生物群落结构的差异。灰色线连接基线和第14天治疗配对样本，PCoA1清楚地区分NTZ治疗后的样本与基线或HRZE治疗后的样本。D.利用Inverse Simpson多样性指数分析患者肠道微生物群a多样性，其中, HRZE组：n=16；NTZ组: n=19。使用线性混合效应模型来确定差异处理对多样性的重要性。利用线性混合效应模型（Diversity~1+Sex+Age+Treatment: Time +1|ID），“：”表示相互作用项，以HRZE作为参考水平。在基线时，两种治疗方法之间没有显著差异。在治疗14天后，两组均显示出a多样性的显著降低。

2 在接受NTZ治疗的患者中抗生素引起的肠道微生物组成改变更为明显

为了鉴定受两种干预方式显著影响类群，研究者基于Limma/voom对dada2 （ASV）识别的每个测序变量的丰度进行了线性混合效应建模（ASV_i（counts）~Sex+ Batch+Group+1| ID）。该模型除了能够确定由于治疗手段（预处理，HRZE，NTZ）引起的效应外，还可以量化性别和测序批次之间的依赖效应。研究者使用1| ID随机效应来控制不同个体之间的基线差异，使用Benjamini-Hochberg FDR校正后的p值来确定受治疗方式显著影响的ASVs.

上述分析表明，HRZE治疗对患者胃肠道微生物的影响包括82个ASVs的耗竭，其中多数属于Clostridiales（FDR<0.05）。值得注意的是，这些ASVs中的多数（例如Blautia spp., Butyrivibrio spp., Clostridium spp., Eubacterium spp.,Faecalibacterium spp., Gracilibacter spp., Oscillibacter spp., Roseburia spp., Ruminococcus spp., Sporobacter spp.）均参与宿主健康相关的功能，例如SCFA的产生或胆汁酸的转化（图3A，B）。NTZ治疗对患者肠道菌群具有更实质性的干扰，共计有387种ASVs的耗竭和16种ASVs的增强。NTZ治疗造成肠道中Clostridiales的显著减少，其中包括除HRZE治疗清除的一种之外的所有ASVs，还包括许多其他的Firmicutes（FDR <0.05）。此外，NTZ引起了包括K.pneumoniae, E. coli, C. freundii, S. alactolyticus以及E.faecium在内的病原菌的扩增（FDR <0.01）（图3A，B）。通过抗生素治疗可以筛选出Bacilli和Enterobacteriaceae的菌种，因为较高浓度的抗生素可以诱导产生氧化还原电位，包括肠道上皮细胞氧化还原增加。

综上所述，上述结果表明，虽然NTZ治疗对患者体内的Mtb载量没有显著影响，但其对患者肠道微生态的扰动比HRZE治疗更为明显，包括大量Clostridia的耗竭，以及筛选一类与已知疾病相关的耐氧病原菌。

图3 NTZ和HRZE治疗引发受试者肠道微生物组的变化。A.火山图显示了基于ASV水平在HRZE和NTZ治疗后（第14天）和预处理（基线）之间的差异。每个ASV的颜色按菌种的系统发育顺序排列。对每个ASV的单一线性混合效应模型（ASVi（counts）~Sex+Batch+Group+1|ID）进行拟合，以确定由于处理因素而产生的差异，同时考虑测序批次和性别。B.受HRZE或NTZ干预显著影响的404个ASV的丰度的组内无监督分级聚类分析（FDR < 0.05）。右侧的注释（HRZE和NTZ）表示是否每个ASV都受到治疗的显著干扰。y轴上的P值根据Benjamini-Hochberg 算法计算FDR进行调整。

3 HRZE和NTZ特异性影响宿主外周基因的表达

由于以上结果突显了两种疗法对结核病的治疗和胃肠道微生物组成的不同影响，研究者认识到这提供了一个独特的机会来推测肠道微生物组成、结核分枝杆菌的细菌载量和外周基因表达之间可能存在的关联。由于受试者在被分配到上述两种治疗方案之前具有一定的随机性，因此研究者使用Limma/Voom的线性混合效应模型来对每个宿主转录本的丰度进行建模（Gene_i（Counts）~Sex+Batch+Group+1|ID）分析。

该研究通过对基线与NTZ或HRZE治疗后对比的limma/voom表达数据进行基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），确定了治疗引起的整体转录本丰度变化的功能模式。该研究使用GSEA评估了MiSigDB Hallmark途径的富集程度，目的是对可能表达的生物学途径进行广泛的概述。在接受HRZE治疗的受试者中，研究者在第14天观察到炎症反应显著减少（FDR <0.05），包括IFNa应答，IFNg应答，以及NFκB介导的TNFa通路和IL6 JAK STAT3通路，上述应答与抗生素引起细菌病原体水平降低的系统性免疫学作用有关（图4A）。相比之下，NTZ的治疗则显示了相反的效果。HRZE治疗下调了炎症相关的信号通路，包括TNFa信号通路、IFNg信号通路和I型干扰素信号通路，而在第14天NTZ处理后均显著富集（图4A）。NTZ治疗也上调了其他几种途径，例如低氧，细胞凋亡和活性氧（reactive oxygen species，ROS）等被认为是免疫失调的标志物。由于该研究发现NTZ治疗可改变患者肠道微生物组的组成结构，同时使痰液（TTP）中的Mtb细菌负荷基本保持不变，因此研究者推测NTZ引起的上述效应可能由于微生物组成改变的部分功能。

为了进一步了解这两种药物对基因特征的影响，研究者首先集中分析了一组已发表的活动性结核病的转录标志物，这些标志物来自多个人群队列，并且跨越测序平台（微阵列和RNAseq）。经过分析发现，上述标记物在LTBI、活动性结核病和健康对照组个体之间差异显著。在该研究中，研究者在预处理的活动性结核病受试者中检测到373个转录本中的363个。在HRZE或NTZ治疗两周后，研究者定义了这些转录本的三类主要变化：（1）重新正常化（HRZE/NTZ治疗前后变化的转录本，与之前文献报道的活性TB和对照组/LTBI之间的差异倍数具有相同的趋势）；（2）不变（在HRZE / NTZ治疗前后的转录本表达无变化）；（3）恶化（HRZE/NTZ治疗前后的差异基因倍数变化与文献报道的活性TB和对照组/LTBI之间的倍数变化关系相反。其中，有157个活性TB基因受HRZE治疗的显著影响（FDR< 0.05）（图4B）。在这157个受影响的基因中，有144个（92％）随着治疗进程而逐渐恢复正常（即，活动性TB与对照组相比，显示出相同的倍数变化趋势），而有13个（8％）则恶化了（也就是倍数变化的相反方向）。另一方面，研究还发现这些结核病相关的炎症基因中只有4个受到NTZ治疗的影响，且均属于急性发作期（图4C）。

由于NTZ治疗在不影响Mtb疾病缓解率的情况下改变患者的肠道微生物组成，因此研究者推测可能存在其他宿主相关的转录本亚群与肠道微生物的依赖性免疫相关，可能对上述微生物结构的改变有响应。为了验证上述假设，同时考虑到微生物失调和自身炎症条件，例如炎症性肠病之间已经建立的联系，该研究选择了最近发表的一组包括880个基因，与无症状对照相比，上述基因在IBD患者的结肠活检组织中表达显著差异。在这880个基因中，有364个在本研究的数据中被检测到。研究者将重新正常化定义为由于与对照/活性IBD经抗菌处理而具有相同倍数变化的基因。尽管与NTZ治疗相比，HRZE干预对患者肠道微生物组的影响更有限，但该研究仍然发现HRZE治疗导致了117个基因的改变（FDR <0.05）（图4D），其中NTZ治疗与其中55个基因的变化有关（FDR <0.05）（图4E）。上述结果表明，HRZE和NTZ治疗可能会引起患者产生微生物相关的外周炎症变化。

图4 HRZE和NTZ处理组的Hallmark通路基因集富集分析和基因表达比较。Hallmark基因通路改变与HRZE（A）或NTZ（B）治疗2周相关。与基线相比，阳性是指在治疗2周时通路过表达（up），阴性是指在治疗2周时通路表达下调（down），箭头大小表示显著性水平。结核病治疗相关的外周血液转录本强调了治疗后HRZE（B）或NTZ（C）基因表达与基线相比的差异变化。HRZE治疗使144个有效的TB炎症相关转录本的表达重新正常化，即接近健康状态，仅使13个炎症转录本的表达上调。而NTZ治疗使4个炎症转录本上调。每种处理影响与TB相关的外周血转录水平的显著性定义为在limma/voom模型中，对于变量Group而言，其FDR的p值小于0.05。HRZE治疗（D）和NTZ（E）导致不同基因的重新正常化（HRZE 66，NTZ 34）或加剧（HRZE 55，NTZ 21）。与IBD相关的外周血转录本受不同治疗方式影响的显著性定义为在limma/voom模型中，对于变量Group而言，其FDR的p值小于0.05。y轴上的P值根据Benjamini-Hochberg 算法计算FDR进行调整。

4 HRZE治疗队列中患者肠道微生物和外周炎症的纵向观察分析

为了验证HRZE治疗两周后的观察结果并确定随着治疗时间的延长可能发生的影响，该研究招募了一个纵向治疗队列（20人）以评估HRZE治疗6个月期间对疾病的缓解情况，并进行定期采样患者唾液样本用于TTP检测，粪便样本用于微生物组分析，外周血样本用于转录组测序（图5A）。所有参与者均接受HRZE标准治疗（异烟肼每天300 mg，利福平每天600 mg，吡嗪酰胺25 mg/ kg每天和乙胺丁醇15 mg/kg每天）。在治疗的基线，第7天，第14天，1个月，2个月和6个月检测唾液样本中结核分枝杆菌的细菌负荷（TTP），同时，在每个时间点也收集患者的粪便样本用于微生物组测序分析，在基线，第14天和2个月收集患者的全血进行转录组学分析。

上述结果与在HRZE/ NTZ中的HRZE干预组的观察结果相似，治疗两周后，TTP显著高于基线（p <0.05）。同时，干预两个月后的TTP也比两周时显著增加，该结果表明抗生素处理对结核分枝杆菌杀菌效果（p < 0.05）（图5B）。对患者微生物组结构变化的纵向分析显示，患者的肠道微生物的多样性在治疗7天后显著下降，而在治疗1个月后增加，但在随访6个月时仍明显低于基线水平（p < 0.05）（图5C）。

使用与上述相同的方法进行了Limma/Voom差异分析，以确定治疗方式和时间对患者肠道微生物组和外周转录组的影响。如研究者之前的研究结果一致的是，在治疗一周后发现HRZE治疗可以显著降低肠道中Clostridiales的丰度，与基线相比，上述Clostridiales ASVs中的大多数甚至在6个月的随访时间点时仍然显著降低，（图5D）。总体而言，与基线相比，在第7天，有19个ASVs出现耗竭，而3个ASVs增加；第14天，有61个ASVs出现耗竭，2个ASVs增加；而一个月时，与基线相比，有83个ASVs出现耗竭且无新增。因此，在治疗的第一个月，相对于基线样本，受试者肠道微生物组多样性显著降低。然而，在治疗过程的后期，该研究发现了不同的趋势。相对于基线，与HRZE治疗两个月的第0天相比，该研究发现有11个ASVs的丰度减少，而有53个ASVs的丰度增加。在HRZE治疗第6个月时，与第0天相比，该研究发现有3个ASVs显著降低，而有327个ASVs增加（图5D）。在2个月和6个月时，特异性ASVs的升高在不同患者个体之间具有相对的异质性。此外，一些在第0天未检测到Clostridiales ASVs的受试者在随后的两个时间点出现富集。总体而言，该纵向分析表明，在HRZE治疗一个月后，多数可能受到该治疗影响的ASVs都将出现耗竭，但在治疗2个月到6个月之后也会逐渐恢复。此外，该结果还表明可能会有在第0天未被检测到的与系统发育相关的ASVs取代某些菌群。

与基线相比，在治疗的两周（第14天）和两个月时，该研究发现受试者外周炎症的明显变化。在HRZE/NTZ试验队列中发现常见炎症通路的下调（图5E）。有趣的是，将第56天与基线或第14天的数据进行比较，该研究发现炎症基因进一步减少，这可能是由于第56天TTP进一步增加所致（图5F-K）。

利用多组学约束的数学建模可以区分胃肠道微生物和结核分枝杆菌对外周炎症特征的贡献程度。接下来，研究者尝试确定胃肠道微生物和Mtb的动态变化在预测外周炎症基因趋势变化中的相对贡献。作为结核病炎症状态的一个基本反映，该研究推断这种状态的缓解可能受到病原体清除和微生物组改变的上游因素的共同影响。研究者假设可以通过利用通过利用HRZE治疗的个体可变性，以及利用HRZE/ NTZ试验队列中NTZ组的数据，可以实现对这些关系的建模。这是因为NTZ组实际上可以作为有效的实验对照，可以在没有Mtb改变的情况下检测胃肠道微生物群和基因表达变化。具体来说，该研究的目标是确定在三组抗生素治疗的患者中，菌群丰度变化与炎症通路显著变化相关的特定微生物群。为了训练上述模型，研究者使用了HRZE / NTZ试验队列和纵向观察队列中的所有结果，共34个配对样本（图1）。同时使用来自两个纵向队列（HRZE /NTZ试验和HRZE纵向观察队列）的所有数据为每个炎症途径进行拟合来挖掘在多个数据集中通用的模式，每个模型都对80 %~20 %的数据进行训练验证分区，这种方法适合于临床研究中常见类型的多组学数据集。重要的是，与传统的多元线性回归分析相比，RFR建模具有明显优势，因其与模型结构（例如，非参数回归）无关，不需要满足经典回归分析所需的通用假设，并且能够执行设定的排名特征选择。重要的是，尽管与传统回归分析相比，RFR的解释不那么直接（例如，本身没有回归系数），但其下游分析，包括排列重要性（Permutated importance）和累积局部效应（Accumulated local effects，ALE）可以用于评估预测因子（例如TTP，微生物组组成等）的重要性及其对因变量的影响（例如宿主外周炎症标记）。

图5 HRZE治疗引起患者肠道微生物的组成和外周炎症相关基因表达的纵向变化。A.研究队列示意图。B.在基线（19个生物独立样本）、第14天（14个生物独立样本）、1个月（5个生物独立样本）和2个月（9个生物独立样本）测量至阳性的时间。为了确定不同时间点的TTP差异的统计学意义，该研究拟合了线性混合效应模型（TTP ~ Sex+Age +Time+ 1|ID）。研究者检查了与时间变量相关的p值，以确定TTP的显著差异（p值<0.05）。C.计算每个受试者在基线（20个生物独立样本）、第7天（7个生物独立样本）、第14天（19个生物独立样本）、1个月（13个生物独立样本）、2个月（13个生物独立样本）和6个月（13个生物独立样本）的微生物群落多样性，使用Inverse Simpson指数计算微生物组的a多样性。D. 火山图显示在第7天、第14天、第30天、第56天和第180天微生物群落组成与倍数变化之间的差异性。E. 第14天与基线，第56天与第14天以及第56天与基线之间的Hallmark Pathway计算的归一化富集得分。F-H火山图显示治疗后第14天与基线、第56天与第14天以及第56天与基线的TB转录水平差异。I-K火山图显示Palmer等人的研究中在治疗后第14天与基线，第56天与第14天以及第56天与基线之间检测到的IBD病例与对照组的转录水平差异。

当绘制具有显著排名重要性值（p < 0.05）的预测变量的ALE曲线的平均斜率时，该研究发现TTP的增加（痰液中Mtb的减少）和Clostridia ASVs丰度的增加，特别是Clostridia IV和XVIa，其已被证明可通过SCFA的产生来诱导抗炎反应E rectale, F.prausnitzii, G. formicilis, E hallii, O ruminantium, D. formicerans, S.variable, B. faecis,和 B. obeum。上述菌群的丰度与外周促炎反应的减少相关，包括INFγ，INFa，炎症反应以及IL6 JAK STAT3的信号传导（图6）。相反，E. coli和 E. faecium丰度的增加与炎症加重有关（图6），表明这些物种在胃肠道内的过度生长是微生物失调和炎症的标志，通常也与不良的临床结果相关。

综上所述，该研究的数据和相关的计算分析表明，伴随结核病治疗的炎症基因表达的变化与导致病原体清除的药物的抗菌活性以及抗生素诱导的微生物组成变化有关。基于此建模结果，研究者提出了微生物相关炎症作用的两个模式。首先是由于Clostridia（尤其是Clostridia IV和XVIa）的耗竭加剧了TB相关的炎症反应，这在HRZE和NTZ治疗组中均具有显著差异。另外，仅与NTZ治疗相关的病原体如E.faecium, S. alactolyticus和E. coli,的升高也可能加剧个体中的炎性相关途径表达上调。重要的是，由于该研究的模型明确说明了所有受治疗方式影响的ASVs的丰富（即，通过将模型中的微生物种类作为预测因子来控制所有细菌的存在和丰度）。因此，上述病原菌的丰度与宿主炎症相关反应的加剧相关表明，已确定的微生物组变化与宿主免疫应答的关联可能不仅仅反映Clostridia的动态变化。

基于此模型，还研究假设结核病的缓解可能与梭状芽胞杆菌的保存有关，而它们的耗竭和与病菌病相关的肠杆菌科细菌或芽孢杆菌的增强可能会减慢消融甚至支持炎症加重。

基于该模型，研究者假设结核病的缓解可能与Clostridia（尤其是Clostridia IV和XVIa）的丰度升高有关，而其在肠道内的耗竭和随后与菌群失调相关的Enterobacteriaceae和 Bacilli pathobionts的升高可能阻止疾病缓解甚至加剧炎症的恶化。

图6使用随机森林回归分析宿主免疫相关的外周血液基因特征与肠道微生物组成和TTP变化之间的关系。热图表示ALE曲线的变化趋势。蓝色/橙色表示与特定炎症通路变化显著相关的特征，蓝色表示负相关，橙色表示正相关。对于每条免疫途径，从置换重要性分析中调整的Benjamini–Hochberg FDR的p值小于0.05，则认为该路径-ASV之间显著关联。黑色圆点用于识别每个特定宿主路径的建模识别的最重要预测因子（即，如果缺失将导致模型预测和结果之间的均方误差最大增加的预测因子）。该分析表明，TB相关负荷的减少和与宿主健康相关的ClostridiaIV和XIVa丰度的增加可以用来预测宿主炎症反应的减弱。相反，患者肠道中耐氧菌（包括Enterococcus, Streptococcus和E.coli）的丰度增加则预示着宿主炎症反应的加剧。

5 验证队列中健康对照肠道微生物组与外周基因表达的关系

研究者对两个纵向治疗队列的数据进行机器学习建模表明，特定的肠道微生物类群与宿主外周血中免疫相关的基因特征有关。具体地说，Clostridia的高丰度与炎症（如干扰素a、干扰素g、IL6/JAK/STAT3、炎症反应基因信号）呈负相关，而常见耐氧病原菌的高丰度与上述炎症的恶化有关。为了评估上述发现的普遍性，研究者推测即使在健康个体中，上述细菌定殖的不同水平也与宿主免疫相关的外周血基因的不同水平相关。

为了验证这一假设并最终从模型中验证，研究者分析了来自两个健康对照队列的一组人群数据。这些数据的一个子集已在该研究团队已发表的工作中报导，即来自海地同一社区的结核病阴性健康家庭接触者（Family Contacts，FC）和健康未接触者（Community Controls，CC）的横断面研究。对于这两个队列，该研究总共包括55名健康对照，其中有9名FC和36名CC，研究者收集了微生物组16S rRNA测序数据和外周血转录组数据。

研究者首先试图验证上述结果，即在其FC和CC的验证对照队列中，受试者外周血液转录模式在HRZE治疗后恢复正常，在NTZ治疗后恶化（这是通过我们与已发表的对照/活动性结核病基因签名数据集的比较确定的）仍然有效（队列3）。为了将转录本丰度与免疫途径的富集联系起来，研究者利用R语言的GSVA软件包进行了单样本基因集富集分析。研究者首先对本研究中所有样本的通路样本NES得分进行了无监督聚类分析，发现来自不同队列的个体在不同的生物路径上有广泛的差异（图7A）。然后，研究者针对HRZE / NTZ试验和长期观察队列分别使用线性混合效应模型，将每对FC/CC与治疗前或治疗期间样本之间的欧氏距离（Euclidean distance）与时间、治疗和患者ID进行回归分析。结果发现，在HRZE/NTZ试验和长期观察队列中，与治疗前（第0天）相比，HRZE治疗显著缩短了到FC/CC样本之间的距离（HRZE/NTZ试验中HRZE的p值<1e−20，纵向的观察性HRZE治疗队列<1e−10，纵向观察性HRZE治疗队列的p值<0.05）。相反，在HRZE/NTZ试验中，与治疗前p值相比，NTZ干预增加了到FC/CC的距离，该结果再次验证了NTZ诱导的患者体内炎症反应的加剧。

该研究对每条通路的微生物组数据进行了RFR建模分析，并将结果总结在图7B中。令人惊讶的是，研究者发现大量Firmicutes尤其是Clostridia与许多特征的标志性分子通路相关。更有趣的是，该研究发现与宿主健康相关的Clostridia，包括F. prausnitzii, Rumonoccocus spp.和C.catus的ASVs丰度较高，与包括INFa和INFg在内的促炎途径的减少有关。这种在稳态条件下的独立分析与该研究在HRZE/NTZ队列试验和HRZE治疗队列的纵向观察性建模分析的结果一致（图6）。上述结果是在来自海地社区的55名志愿者的队列中进行的，从而更加说明了特定的胃肠道微生物群的相对丰度与宿主炎症反应相关的外周基因表达有关，而这些特定的微生物类群在结核病的治疗中受到显著影响。

图7对独立的健康对照人群的微生物组和血液外周基因表达的分析证实了特定肠道微生物和宿主外周基因表达之间的关联。A.对于本研究中的所有队列，基于每个样本的MiSigDB的50个Hallmark途径的NES得分。使用DSEeq的方差稳定化变换计数计算NES得分，用R中的GSVA软件包计算，并在所有样本中按比例缩放后绘制（Z得分）。B.将特定微生物类群与Hallmark途径相关联的随机森林回归分析。图中仅显示在RFR模型中标识的路径。通过取每个关系的ALE图的一阶导数计算出的“Relation”，如果该路径与特定的ASV正相关，则该“Relation”为正；如果该路径与特定的ASV负相关，则该“Relation”为负。

讨论

自从微生物组高通量测序技术问世以来，研究人员已经清楚地认识到，抗生素的使用是清楚体内微生物最有效的手段之一，其作用具有急性和持久性的特点。特定的微生物可以对宿主的免疫效应产生特定影响，包括影响免疫细胞亚群的丰度和功能。大量基于小鼠的研究数据已经证明了抗生素对体内微生物组成和功能的影响，以及这些微生物对宿主免疫细胞的后续影响。然而，抗生素诱导的微生物群扰动在什么程度上可以显著改变机体抗感染治疗的结果，或者在人体肠道微生物群中的组成变化和外周基因表达之间存在什么关系仍是未知的。通常认为，抗生素清除感染的作用是通过直接杀死病原体和通过微生物群调节免疫应答，而抗生素对病原体的杀灭作用也可能部分被微生物群扰动所引起的有害免疫应答所抵消。上述动态过程尤其可能与肺结核等慢性感染的治疗有关，在这种疾病状态下，抗生素治疗的时间延长，并且疾病的进展反映了体内病原体的负荷和导致组织破坏的慢性症状相关炎症介质的结果。

对抗生素敏感的结核病患者通常需要使用六个月的抗生素，其中主要是基于分枝杆菌的特异性药物治疗。在这项研究中，研究者报告了HRZE治疗对活动性结核病患者的早期和晚期肠道微生物组的影响，并证明了在仅进行了两次治疗后，在结核病治疗患者的横断面研究中观察到的相同变化趋势（比较治愈者和LTBI个体）。经过数周的治疗，研究发现HRZE的治疗条件下，对患者肠道中Clostridia的丰度有显著影响，同时这一发现在小鼠实验中也得到证实。鉴于治疗结核病药物靶向分枝杆菌的特异性以及小分子物质相互作用影响微生物的组合特性，因此很难预测HRZE疗法主要针对厚壁菌门中的Clostridia，而Mtb所属的放线菌门不受影响。小鼠实验结果表明，这种抗梭菌的作用主要由利福平/ PZA的治疗所驱动。Clostridia是肠道微生物群中的免疫活性成分，可以产生多种代谢产物，例如短链脂肪酸和其他化合物。

基于NTZ / HRZE的研究使本研究能够剖析病原体清除和微生物组扰动对疾病治疗的相对贡献度。因为标准疗法既减少了Mtb细菌符合又扰乱了体内的微生物组，而NTZ对Mtb的平均负荷没有显著影响，但是确实以与HRZE重叠的方式干扰了体内的微生物组成。同时，在纵向队列中扩展了上述发现，该队列追踪了患有活动性结核病的患者在治疗后一周，两周，一个月，两个月和六个月的变化情况，证实了抗生素使用对体内微生物组的扰动会对宿主外周基因表达产生系统性影响。进一步，该研究推测患者对结核病治疗响应的巨大差异可能是由于抗生素对微生物群影响异质性的部分作用。

为了验证所推断的微生物群-宿主炎症之间的潜在关系，研究者从一个独立的海地健康人群队列中进行了微生物组和血液转录组的分析。值得注意的是，尽管与活动性结核患者相比，炎症途径的外周水平降低，但研究再次发现，ClostridiumIV和XIVA的丰度升高与促炎途径中的表达减少有关。上述结果支持了本研究的结论，即无论是在结核病的疾病状态下还是在稳态条件下，微生物组的组成决定了全身炎症状态。

进一步，考虑到用配对样本解释微生物组地组成与周围基因表达之间的关系所面临的挑战，将样本随机分配到对机体系统性影响差异显著的药物组合中，并尝试用适当的算法进行此类分析。对于单组学微生物组和RNA seq数据，该研究选择使用limma / voom来模拟这些数据中的变化，因其具有对多种效应进行建模的能力，同时可以将受试者的基线值用作随机效应。对于多组学整合数据，该研究使用了随机森林回归。上述分析结果以两种方式突出了这些模型的实用性：（1）通过提供支持或反对关于许多潜在相关参数之间具有临床意义的关系的特定假设的证据，以及（2）通过提供这些模型的多组成分（即特征）之间的假设生成关系，这些关系可以在小鼠、验证队列或其他模型系统中进一步测试。

该研究的主要目标之一是通过使用快速且无创的测量方法（例如，粪便DNA测序，唾液细菌负荷和血液样本转录组测序）来推断人体肠道微生物群、病原体负荷和宿主炎症状态之间的联系。潜在的理论基础是，对这些关联的分析可以引导在体内和体外的后续机制性研究工作，不仅旨在验证，而且还可以建立起靶向微生物组的干预策略，从而提高结核病治疗期间的炎症缓解。而上述分析是基于TTP是足以预测结核病对全身免疫反应的影响的预测变量所进行的。此外，还要考虑肠道微生物组的改变不仅可能影响全身性炎症反应，而且还可能影响肺部滞留的免疫细胞的类型和数量。此外，本研究中得出的任何关联结果都可能无法充分解释机体肠道微生物-炎症反应-病原体关系的潜在变量或混杂因素。同时，尽管上述分析是在独立的队列中进行的，但研究验证已识别的微生物外周基因表达的相关性分析也适用于健康对照队列，而对没有结核病但患有其他疾病的人进行验证可能会比健康人群更容易产生假阳性结果。因此，未来的研究工作将着眼于确定在新的独立结核病治疗队列中是否存在上述已确定的关联。

该数据表明，在结核病患者进行治疗的前14天内，患者体内炎症反应的消退（通过外周血转录组学分析）可能既受到体内Mtb负荷减少的影响，也受到抗菌素诱导的肠道微生物群扰动的影响，而后者可能直接作用于全身性的免疫功能改变。与这两个因素密切相关的途径中，一种是活动性结核病的特征性激活途径：干扰素γ、I型干扰素和肿瘤坏死因子α。越来越多的证据表明，活动性结核病的结果反映了体内病原体的负荷和包括IL-1和IFNγ在内的细胞因子的混合作用，而后者则加剧了疾病的进展。该研究表明，伴随结核病治疗的肠道微生物组的扰动是早期治疗期间这些相同途径正常化的预测标志物之一，表明肠道微生物组的改变可以影响或预测结核病缓解的速度。在患者治疗的前两周，病原体杀灭是主导因素，但在治疗的后期，当病原体杀灭减缓时，治疗过程中炎症反应相关微生物组成依赖的调节作用可能会发挥重要作用。在健康对照队列中，肠道微生物的组成和外周基因表达之间的关系验证，特别是上述相同的促炎和抗炎途径的共同表达，表明这些关联可以延伸到其他人群。而上述关联是属于因果关系，还是作为另一种状态的生物标志物，将是本研究未来的前沿方向。接下来的研究工作将致力于将本研究提出的分析工具和研究设计思路应用于结核病治疗的后期，以检查治疗过程中的肠道微生物群的改变是否与临床相关的治疗结果相关，以及Clostridia的丰度是否与体内Mtb的清除速度或伴随活动结核病的炎症反应的消退相关。这些研究为靶向肠道微生物作为结核病治疗预测指标的相关研究提供参考，同时有助于进一步分析治疗结果的个体间异质性。

结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，Mtb）感染引起的一种传染病。肠道菌群与结核病之间存在相互作用关系，主要通过宿主免疫系统产生。在Mtb感染后，机体可产生一系列复杂的免疫反应，这个过程涉及多种免疫细胞及细胞因子（如CD4⁺T细胞、巨噬细胞、TNF-a、IFN-g等），尤其是CD4⁺T细胞，其分化的Th1/Th2细胞亚群可调节抗结核免疫反应的方向。鉴于结核病标准治疗可以引起胃肠道微生物群的显著变化,包括许多梭状芽胞杆菌物种的耗竭,上述改变可能与机体系统性炎症反应有关。然而，由于HRZE疗法在治疗早期可以迅速消除结核分枝杆菌。因此，如果没有一个具有Mtb病原体杀灭或微生物群扰动，同时又不是两者兼具的对照组，则很难将消灭Mtb的免疫效应与肠道微生物群的干扰分离开来。因此，该研究分别结合了三个独立的临床队列，分别通过对粪便样本进行16SrDNA测序、外周血转录组分析和唾液样本中结核分枝杆菌丰度进行了分析。该研究通过比较结核病标准疗法和不减少结核菌载量的实验性疗法，可以独立研究肠道菌群对结核病治疗的影响，并指出特定菌群组成与结核病恢复期炎症指标下降有关。上述研究为探讨肠道共生菌群对感染性疾病的发生和发展过程的影响提供了新的研究思路。