嵌合抗原受体：万物皆可CAR

3月21日，邦耀生物联合创始人兼副总裁、华东师范大学生命科学学院的杜冰教授在bioSeedin workshop的模块一中，为大家详细讲述了目前基因治疗领域免疫细胞疗法的发展现状。此篇文章将对部分内容进行整理概述。

免疫细胞疗法

免疫细胞是指参与机体免疫应答或与免疫应答相关的细胞，常见的免疫细胞包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）、单核巨噬细胞以及嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等。

免疫细胞疗法则是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，从而靶向性杀伤肿瘤细胞，及预防肿瘤的复发和转移。

目前，常用的免疫细胞疗法包括非特异性免疫疗法（LAK、CIK以及NK等）以及特异性免疫疗法（TIL、CAR-T以及TCR-T等）。其中，CAR-T疗法由于在血液肿瘤领域的出色表现进入公众视野，同时引领着抗癌治疗进入新的时代。

LAK细胞即淋巴因子激活的杀伤细胞，是将外周血淋巴细胞在体外经白介素-2(IL-2)激活3～5天而扩增为具有广谱抗瘤作用的杀伤细胞。严格来说，LAK细胞并非是一个独立的淋巴群或亚群，而是NK细胞或T细胞体外培养时，在高剂量IL-2等细胞因子诱导下成为能够杀伤NK不敏感肿瘤细胞的杀伤细胞，称为淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）。目前应用LAK细胞过继免疫疗法与直接注射IL-2等细胞因子联合治疗某些肿瘤，已获得一定的疗效。

CIK细胞即细胞因子诱导的杀伤细胞，可以说是“LAK的进化版本”，增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。由于该细胞同时表达多种膜蛋白分子，故又称为NK细样淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。

NK细胞又称自然杀伤细胞，是除T细胞、B细胞之外的第三大类淋巴细胞，来源于骨髓，占外周血淋巴细胞总数的5%-10%，是机体重要的免疫细胞，具有广谱抗肿瘤细胞作用，其不依赖于抗原刺激作用，以非特异方式直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染的靶细胞。

嵌合抗原受体（CAR）

CAR主要由三个功能域构成，分别是胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。胞外结构域由负责识别并结合抗原的单克隆抗体的单链可变片段（scFv）及一段起连接作用的铰链区（Hinge）构成。胞内结构域由共刺激结构域和信号转导结构域构成。

1. 抗原识别结构域（scFv）

结构组成：抗原识别结构域是CAR特异性结合肿瘤抗原的基础，其主要结构是scFv，由单克隆抗体的轻链（VL）和重链（VH）通过多肽连接而成，保留有抗体对抗原的特异性和亲和力。

功能：scFv赋予了T细胞特异性识别并结合靶抗原的能力，与未经修饰的天然TCR-T细胞相比，其对靶抗原的亲和力显著提高。CAR-T细胞通过scFv对靶抗原的识别结合不依赖MHC抗原呈递，一方面避免了肿瘤细胞通过调节MHC分子发生逃逸，另一方面赋予了CAR-T细胞识别非肽抗原的能力。

2. 铰链区（Hinge）

结构组成：铰链区连接scFv和跨膜结构域，大多数CAR的铰链区由IgG的铰链或CD8α/CD28胞外区衍变而来。铰链区的长度取决于靶细胞抗原表位的位置及暴露程度。

功能：多项研究表明，CAR-T细胞活化与铰链区长度有关。调整铰链区的长度可以使CAR-T细胞和靶细胞处于最佳距离，在抗原抗体结合过程中避免大型磷酸酶的作用减弱CAR信号。然而，在某些情况下，抗原表位可能相对不可接近，需要使用更长的铰链区，使scFv可以克服空间位阻，有效结合抗原。因此，抗原表位不同，铰链区的最佳长度也不同，在靶向新抗原时，可能需要相应地调整铰链区的长度。

3.跨膜结构域

结构组成：跨膜结构域将CAR的细胞外结构域与细胞内信号转导结构域连接，并将受体锚定到T细胞膜上。常用的跨膜结构域来源于CD4，CD8α，CD28和CD3ζ。

功能：如CD3ζ跨膜域能够使CAR形成同源二聚体或与内源TCR形成异二聚体，增强CAR-T细胞活性，但也正是由于其不需要与内源TCR结合即可高度活化T细胞，而逐渐被弃用。CD8α和CD28的跨膜域由于能够促进CAR在细胞表面表达，目前在多数临床试验中采用。

4.胞内结构域（包括共刺激域及信号转导域）

共刺激域通常来自CD28受体家族(CD28，ICOS)或肿瘤坏死因子受体家族(4-1BB、OX40、CD27)。共刺激域可实现协同刺激分子和细胞内信号的双重活化，使T细胞持续增殖并释放细胞因子，提高T细胞的抗肿瘤能力。如CD28共刺激域使CAR-T细胞依靠糖酵解代谢，促使CAR-T细胞向效应T细胞分化。而4-1BB共刺激域促进线粒体生成，增强呼吸作用和脂肪酸氧化，抗原刺激后，CAR-T细胞优先分化为中央记忆T细胞。

信号转导结构域通常为T细胞受体TCR/CD3ζ链或免疫球蛋白Fc受体FcεＲIγ链，含有免疫受体酪氨酸活化基序（ITAMs），发挥着T细胞信号转导功能。

CAR的结构组成及作用机理（来源：邦耀实验室）

万物皆可CAR

目前，鉴于CAR-T细胞疗法的成功，将CAR工程技术沿袭用于其他类型免疫细胞的工程化改造引起了研究者们极大的兴趣，由此衍生了CAR-NK、CAR-NKT、CAR-巨噬细胞（CAR-M）、CAR-Treg、CAR-γδT等一系列以CAR技术为核心的新型细胞疗法。

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CAR-T：血液瘤表现出彩

CAR修饰的T细胞免疫疗法（CAR-T），则是指将scfv的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的重组蛋白基因与T细胞杀伤激活信号CD3ζ的DNA链，通过基因重组技术连接在基因工程表达载体上，并将其表达于杀伤性T细胞膜上形成嵌合抗原受体，从而使得T细胞不依赖MHC-I而识别肿瘤细胞，再经纯化、体外扩增及活化，将CAR-T细胞回输至患者体内，使其特异性行使杀灭肿瘤细胞的功能。

CAR-T疗法至今一发展到第五代：第一代CAR仅依赖于CD3ζ介导T细胞激活，由于缺乏胞内共刺激信号，并不能提供长时间的T细胞扩增信号和持续的抗肿瘤效应，临床疗效有限；为了提高T细胞的增殖活性延长其存活时间，通过在胞内信号转导区增加一个或两个共刺激分子（CD28、4-1BB、ICOS 或 OX40等），由此产生了第二代和第三代 CAR，在现有的共刺激结构域中，CD28和4-1BB是应用频率最高的共刺激分子，相比之下4-1BB作为共刺激信号的CAR-T细胞在体内扩增更温和持久，发生细胞因子风暴风险较低，复发率也更低；第四代CAR则是引入了促炎症细胞因子（IL-12、IL-15、IL-18 等）和共刺激配体，主要目的是克服肿瘤免疫微环境的抑制，例如，CAR-T细胞中一种经常过度表达的细胞因子是IL-12，这是一种增强T细胞分泌IFNγ、颗粒酶B和穿孔素的有效分子，允许招募NK细胞消除CAR未能识别的肿瘤细胞；第五代CAR则是在第二代的基础上，添加了激活其它信号通路的共刺激结构域，比如IL2-2Rβ胞内结合SAAT3/5 的结构域等。

目前，大多数公司产品以第二代CAR-T技术为基础，在此之上进行探索开发。（杜冰博士提到：由于免疫疗法讲求平衡调控，凡事不能过度。当过多的共刺激因子被同时激活，很容易造成T细胞耗竭，导致治疗效果明显降低。）

该类疗法优点：在血液肿瘤中表现优异，已上市的几款CAR-T疗法均针对血液瘤疾病。局限：细胞因子释放综合征（CRS）、实体瘤效果不佳（靶点抗原选择限制、肿瘤浸润率低、肿瘤微环境抑制）。

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CAR-NK：安全性更优

NK细胞（自然杀伤细胞）是一种重要的肿瘤杀伤性免疫细胞，相较于CAR-T疗法，NK细胞作为效应细胞具有很多优良特性：（1）异体NK细胞不会引起移植物抗宿主反应（GVHD），这已经在许多临床试验中得到证实（2）NK细胞不分泌引起细胞因子释放综合征的炎症因子，如IL-1、IL-6（3）CAR-NK细胞除了CAR介导的靶向杀伤之外，还可以通过NK细胞自身抗肿瘤的特性，识别并杀伤CAR靶标下调或缺失的肿瘤细胞，提高免疫治疗效果（4）异体NK细胞的来源广泛：包括外周血、NK细胞系、脐带血、诱导多能干细胞（iPSC）、NK-92等细胞系（CAR-T细胞大多来源域患者自体或人类健康供体细胞）。

CAR-NK制备流程

目前该类疗法已有很大进展，但仍局限于临床前研究，临床研究并不广泛，还缺乏足够的数据支持。另外，NK细胞在人体内寿命短、细胞毒作用低，包含不同功能特性的细胞亚群，其临床疗效可能受到限制，还需要继续探索选择合适的细胞亚群用于CAR-NK。

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CAR-M：有望突破实体瘤

实体瘤之所以难于被CAR-T疗法治疗，和实体瘤附近的微环境以及实体瘤的异质性有很大关系。实体瘤通过构建具有免疫抑制特性的肿瘤微环境，阻止免疫细胞向病灶的运输，以及T淋巴细胞对肿瘤的浸润。即使有些T淋巴细胞能够浸润实体瘤，它们的免疫反应还可能受到微环境中免疫抑制细胞或抑制因子的限制。而实体瘤的高度异质性则限制了靶向单一抗原的CAR-T疗法的疗效。

吞噬细胞是一种吞噬体内入侵者的免疫细胞，是身体对病毒感染的第一反应者，对它进行基因改造可能是开发有效治疗实体瘤的细胞疗法的关键。研究发现，经过基因工程改造的CAR-M细胞不但能够靶向吞噬肿瘤细胞，而且能够通过分泌促炎症细胞因子，改变肿瘤附近的微环境，同时还能够将肿瘤抗原呈现给T细胞，激活T细胞对肿瘤的免疫反应，可谓“一箭三雕”。

但该疗法也存在需要克服的问题：（1）首先是细胞量的限制，吞噬细胞分化增殖能力远低于T细胞及NK细胞，这会严重限制其在体内的治疗效果。这时候选择对患者进行反复输注，细胞来源严重受限。（2）此外，巨噬细胞一旦在体内被过度激活，其分泌的IL-1、IL-6等白介素因子很容易造成CRS反应，严重将导致患者死亡。此类副作用在CAR-T细胞疗法中已经体现。

值得一提的是，3月18日，临床阶段的生物制药公司CARISMA Therapeutics宣布完成 CAR-M细胞疗法CT-0508（靶向HER2，针对实体瘤）的首例受试者给药，这是全球首次将经工程化改造巨噬细胞应用于临床研究中，基于此，这项临床试验也成为了基因疗法发展中的关键里程碑。

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CAR-γδT：挑战实体瘤

γδT细胞同样也是介于适应性免疫和固有免疫之间的一类T细胞，占外周血T淋巴细胞的1%-5%，主要分布在黏膜和上皮组织中。γδT细胞识别抗原无MHC限制，不仅可以通过多种方式杀伤肿瘤细胞，而且作为抗原提呈细胞（APC）发挥提呈抗原作用。γδT细胞通过自然归巢到各种组织进行免疫监视，与αβT细胞相比在实体瘤治疗上更具有潜力。将γδT细胞改造成CAR-γδT细胞，使其能够精准的识别特异性抗原，高效杀死肿瘤细胞，利用γδT细胞特性或许可以挑战实体瘤的治疗。（推荐阅读：UCAR-γδT——新一代异体通用型细胞治疗产品）

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CAR-NKT

自然杀伤T细胞（NKT）是一群细胞表面既表达T细胞受体（TCR），又表达NK细胞受体的特殊T细胞亚群，能产生大量的细胞因子，例如IL-4和INFγ等。该类细胞既可以直接溶解杀伤肿瘤细胞，也可以通过间接途径（分泌的细胞因子、激活的免疫细胞等）发挥抗肿瘤作用。

尽管优势明显，但NKT细胞在血液中的含量非常少，这使得CAR-NKT疗法的研究目前还处于早期开发阶段，相关临床数据较少。国外公司Kuur Therapeutics率先开发了三款CAR-NKT细胞疗法，分别为靶向GD2的自体KUR-501、靶向CD19的同种异体KUR-502以及靶向GPC3的同种异体KUR-503。目前，KUR-501、KUR-502疗法均已步入临床，KUR-503计划今年启动临床试验。

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CAR-Treg

Treg细胞是一群具有负调节机体免疫反应的T细胞，起着维持自身耐受和避免免疫反应过度损伤机体的作用，同时也参与肿瘤细胞逃避机体免疫监视。不同于上面几种针对肿瘤的CAR-免疫细胞疗法，CAR-Treg旨在针对自身免疫病，通过CAR对Treg细胞的工程化改造使得Treg细胞能够聚集于易受攻击的组织，以抑制其自身免疫反应。

小结

杜冰博士在讲解中还提到，TIL作为肿瘤组织内分离出的浸润淋巴细胞，具有较强的肿瘤归巢特性，未来如果与CAR技术相结合，或许也能够成为攻克实体瘤的新型免疫细胞疗法。

肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）是一种从肿瘤组织中分离出的浸润淋巴细胞，含有肿瘤抗原特异性CD4+、CD8+T细胞群，具有很强的肿瘤归巢特性。TIL在肿瘤细胞内受肿瘤微环境的限制，不具备肿瘤杀伤作用，当从体内分离出来后，在体外经共刺激因子的作用后可恢复肿瘤杀伤活性，扩增后利用其特异性识别肿瘤抗原的功能，对肿瘤细胞实现杀伤作用。