BMP-2 多肽/功能化碳纳米管复合材料修复兔颅骨缺损的实验研究

目的　观察并比较多肽通过非共价与共价两种不同结合方式，以及利用羧基（-COOH）和氨基（-NH₂）两种不同官能团与材料结合，对兔颅骨缺损修复效果的影响。

方法　3 月龄雄性普通级新西兰白兔 21只，将左右两侧顶骨编号 1～42 号，采用随机数字表法分为 5 组，对照组（A 组，6 侧）及材料 1、2、3、4 组（分别为B、C、D、E 组，每组 9 侧）。所有动物均制备直径 12 mm 颅骨缺损模型，分别将 BMP-2 非共价结合的多壁碳纳米管（multi-walled carbon nanotubes，MWCNT）-COOH+左旋聚乳酸［poly（L-lactide），PLLA］、BMP-2 非共价结合的MWCNT-NH2+PLLA、BMP-2 共价结合的 MWCNT-COOH+PLLA、BMP-2 共价结合的 MWCNT-NH2+PLLA 植入B、C、D、E 组缺损区。术后 4、8、12 周取材行 CT扫描及三维重建观察，定量分析骨组织再生体积与总体积比值并测量骨密度值；样本切片行 HE 染色和 Masson 三色染色组织学观察，定量分析新生骨组织体积比。

结果　CT扫描及三维重建观察示，随时间延长，A～E 组骨缺损被逐渐填充，术后 12 周时 E 组骨缺损被完全填充。HE 染色和 Masson 三色染色示，随时间延长，各组新生骨组织体积逐渐增大，术后 12 周 D、E 组出现了再生成熟骨组织。定量分析显示，术后 4、8、12 周，各组骨组织再生体积与总体积比值、骨密度值、新生骨组织体积比随时间增加均呈逐渐增加趋势；且各时间点从 A～E 组也呈逐渐增加趋势，组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。

结论　通过共价结合方式并利用 -NH2 将多肽与材料相结合，可以实现最好的骨修复效果。

面对临床患者对骨移植和骨再生方面的迫切需要，开发具有高成骨活性的骨修复材料迫在眉睫^[1-2]。目前研究表明，与成骨相关多肽和活性蛋白等活性因子相结合，是提高材料成骨活性的有效途径之一^[3]。而且，与氨基酸序列较长的活性蛋白相比，成骨相关多肽合成成本低，稳定性高，更适合骨修复^[4-6]。成骨相关多肽可通过共价结合或非共价结合方式附着于生物材料上。相比于非共价结合，共价结合能更有效地增加多肽与材料的相互作用，延长植入后相互作用时间，控制分子的取向，使多肽在体内缓慢释放，有助于维持其功能^[7-9]。然而，对于多肽通过非共价与共价作用，以及通过不同官能团与材料结合对材料骨修复性能影响的报道均较少。我们既往研究发现，多肽通过共价结合比非共价结合作用时间更长，且体外实验结果表明，碳纳米管表面的氨基（-NH2）比羧基（-COOH）更有利于提高材料骨修复性能^[10]。但该研究结论需要体内实验进行验证。

为此，我们在前期研究基础上，进行了本次体内实验。颅骨缺损模型具有空间充足、硬脑膜和皮肤可以为植入材料提供支撑，以及无需额外固定等优势^[11]；此外骨缺损应超过动物不能自发愈合的尺寸，即临界骨缺损直径 8 mm^[12]。故本研究通过建立兔12 mm 颅骨缺损模型，利用 CT 扫描及三维重建、组织学染色等方法，观察并比较等量 BMP-2 多肽通过非共价和共价作用，以及多肽分别通过-COOH 和 -NH2 这两种官能团与碳纳米管结合，对兔颅骨缺损修复的效果，探讨结合方式和官能团对多肽活性的影响规律以及改善骨修复效果的最佳组合。

1.1    实验动物及主要材料、仪器

3 月龄雄性普通级新西兰白兔 21 只，体质量1.7～2.0 kg，平均 1.8 kg，由望都县彤辉养殖公司提供。

多壁碳纳米管（multi-walled carbon nanotubes， MWCNT；外径 40～60 nm，长度<2 μm，纯度≥ 97%；深圳市纳米港有限公司）；左旋聚乳酸［poly（L-lactide），PLLA；相对分子质量 2.5×10⁵；山东济南岱罡生物科技有限公司）］；BMP-2 多肽（序列 KTPKASSVPTELSAISTLYL，相对分子质量2.1×10³，纯度 98.28%；合肥国肽生物科技有限公司）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐［1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC］、N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；改良 HE 染色试剂盒、改良 Masson三色染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）。FREEZONE 12 冷冻干燥机（LABCONCO 公司，美国）；GE Lightspeed VCT CT 机（GE 公司，美国）；Olympus F100 显微镜（Olympus 公司，日本）。

1.2    骨修复材料制备方法

参照文献［10］方法制备骨修复材料。首先，将MWCNT 经过纯化处理，并通过功能化改性分别制备成羧基化碳纳米管（MWCNT-COOH）和氨基化碳纳米管（MWCNT-NH2）；然后，将二者分别浸泡于 BMP-2 溶液中，室温下于无菌操作台放置 24 h，制备 BMP-2 非共价结合的 MWCNT-COOH 和MWCNT-NH2 复合材料；再通过 EDC/NHS 法制备BMP-2 共价结合的 MWCNT-COOH 和 MWCNT-NH2 复合材料；最后，将以上 4 种复合材料（MWCNT 含量均为 0.2 wt.%）与 PLLA 共混，利用冷冻干燥法制备成 4 种复合支架，分别为 BMP-2非共价结合的 MWCNT-COOH+PLLA（材料 1）、 BMP-2 非共价结合的 MWCNT-NH2+PLLA（材料2）、BMP-2 共价结合的 MWCNT-COOH+PLLA（材料 3）、BMP-2 共价结合的 MWCNT-NH2+PLLA（材料 4）。

1.3    实验分组及方法

将 21 只新西兰白兔左右两侧顶骨编号 1～42号，采用随机数字表法分为 5 组，对照组（A 组， 6 侧）及材料 1、2、3、4 组（分别为 B、C、D、E 组，每组 9 侧）。各组动物适应环境饲养 l 周后，耳缘静脉注射 2% 戊巴比妥钠（30.0 mg/kg）全麻，备皮后沿颅中缝作 4 cm 切口，分层剥离皮下组织暴露两侧平坦的顶骨骨面，用取骨环钻在两侧顶骨制备直径 12 mm 双层皮质骨贯通骨缺损，保留下方完整硬脑膜。分别将材料 1～4 植入 B～E 组缺损区，拉拢缝合骨膜以固定材料，缝合皮肤；A 组直接缝合皮肤。术后视动物状态酌情给予苏醒药物，并肌肉注射 60 万 U 青霉素，普食喂养。

1.4    观测指标

1.4.1    大体观察　术后观察动物进食、饮水、活动、体质量变化以及切口愈合情况。

1.4.2    CT 图像处理和三维重建　CT 图像处理：术后 4、8、12 周分别处死 7 只动物（每个时间点 A 组2 个样本，B～E 组各 3 个样本），迅速完整取下眶部以上的颅骨进行 CT 扫描，扫描条件：电压 80 kV，电流 500 mA，曝光时间 200 ms，旋转角度 220°，层厚 1 mm，图像数量 120 张。随后，利用 Mimics20.0软件对兔颅骨进行 CT 三维重建，通过以下公式计算骨组织再生体积与总体积比值：（V₂−V₁）/V₀，其中 V₁ 是指对缺损位置进行选区后测量的体积，V₂是指对缺损选区位置进行拟合修补处理后的体积， V₀ 为骨缺损初始体积。同时测量骨密度。

1.4.3    组织学观察　CT 观察后将颅骨标本置于 4%多聚甲醛中固定 24 h，再用甲酸脱钙 1 周。然后行常规石蜡包埋、切片（片厚 4 μm），进行 HE 染色和Masson 三色染色，封片观察，用 Image J 软件计算新生骨组织体积比。

1.5    统计学方法

采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。

2.1    大体观察

所有实验动物术中无死亡，术后均可正常进食、饮水、活动，体质量均正常增加。术后仅 2 只兔切口附近有炎性改变和皮脂腺瘤样改变，考虑可能为操作时植入皮脂腺或毛发等异物所致；其余动物切口附近未出现不良反应。

2.2    CT 扫描和三维重建

CT 观察示，术后 4、8 周，各组颅骨缺损均有不同程度修复，其中 B、C 组缺损被少许填充，D、E组缺损修复效果更好。术后 12 周，B、C、D 组缺损被进一步填充，但仍可观察到孔洞，D 组与 B、C 组相比填充程度更完整；E 组缺损已被完全填充，无孔洞。见图 1～3。

定量分析显示，术后 4、8、12 周，各组骨组织再生体积与总体积比值和骨密度值随时间增加均呈逐渐增加趋势；且各时间点从 A～E 组也呈逐渐增加趋势，组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 4、5。

2.3    组织学观察

HE 染色示，术后 4 周，A 组有大量纤维结缔组织，无明显骨生成；其余各组可观察到成骨细胞核，有少量新生骨组织，B～E 组新生骨组织体积逐渐增大。术后 8 周，各组均有新生骨组织，B～E 组新生骨组织体积较 4 周时有所增大，B～E 组新生骨组织体积也呈逐渐增大趋势。术后 12 周，A 组有少量新生骨组织生成；B～E 组新生骨组织体积较 8 周时进一步增大，B～E 组新生骨组织仍呈逐渐增大趋势，其中 D、E 组产生了骨陷窝。见图 6。

Masson 三色染色示，术后 4 周，A 组无再生骨组织；B～E 组均有再生的未成熟骨组织且组间呈逐渐增多趋势。术后 8 周，A 组仍无再生骨组织， B～E 组再生的未成熟骨组织较 4 周时有所增多且组间也呈逐渐增多趋势。术后 12 周，A 组有少量再生的未成熟骨组织；B～E 组再生骨组织较 8 周时进一步增多且组间仍呈逐渐增多趋势，其中 D、E组产生了再生成熟骨组织。见图 7。

定量分析显示，术后 4、8、12 周，各组新生骨组织体积比随时间增加均呈逐渐增加趋势；且各时间点从 A～E 组也呈逐渐增加趋势，组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 8、9。

成骨相关多肽与材料通过非共价与共价两种方式结合，具有不同特点。其中，非共价结合主要通过离子键、氢键和范德华力等作用，实验方法以共混-多肽吸附为主，作用力较弱；而且，成骨相关多肽往往与材料不能有效结合，会在初始阶段引发爆释^[13]。多肽共价结合主要通过酰胺键作用，作用力较强，从而可有效提高多肽与材料间的作用力，延长其植入体内后的作用时间，还可控制分子取向，使功能化表面具有较高稳定性，进而更有利于多肽等活性物质在体内缓慢释放，促进多肽作用的发挥^[14]。目前，已有很多研究通过共价结合引入成骨相关多肽来提高人工材料的骨修复能力^[15]。

关于多肽与材料通过不同官能团结合对其成骨活性的影响，我们之前已进行了相关研究^[10]。首先在 MWCNT 表面分别引入等量 -COOH 和 -NH₂官能团，然后将细胞黏附肽 RGD 和 BMP-2 多肽分别与 MWCNT 共价结合，最后将这些材料与聚乳酸共混后利用冷冻干燥法制备孔径 10～200 μm 的多孔复合支架，通过体外实验对支架的细胞成骨活性进行研究。扫描电镜观察显示，在含有多肽/功能化 MWCNT 的支架中清楚观察到 MWCNT 均匀分布，且各组复合支架微观结构无显著差异，表明官能团及多肽种类对复合支架的形貌结构无显著影响。

已有研究表明基体材料中 MWCNT 的引入量达 1 wt.% 以上，会对复合支架的力学性能造成显著影响^[16-17]；达 0.5 wt.% 以上，会对复合材料的降解性能造成显著影响^[18-19]。本研究中，各组复合支架引入的多肽/功能化 MWCNT 含量较少（仅为0.2 wt.%），因此官能团及多肽种类对支架的力学性质无显著影响；术后 12 周，植入动物模型的材料均完全降解，表明官能团及多肽种类对支架的降解性能无显著影响。此外，我们既往研究的 BMP-2多肽释放曲线表明，以不同官能团共价结合不影响BMP-2 多肽释放（P>0.05），BMP-2 多肽在 21 d内稳定释放；与非共价结合相比，BMP-2 多肽可通过与不同官能团的共价结合发挥更持久作用^[10]。

因此，以上研究排除了一些因素对体外实验结果可能的影响，如材料的微观结构、材料共价结合多肽的量、多肽释放速率和反应过程中溶液 pH值。体外实验结果表明，材料通过 -NH₂ 与多肽共价结合，小鼠成骨细胞 MC3T3-E1 的黏附、增殖、分化和矿化能力明显高于通过 -COOH 结合，这可能是由于官能团所带的不同电荷导致了肽构象、蛋白吸附和肽链靶向作用差异，最终影响了细胞行为^[10]。本研究通过体内实验表明，利用不同官能团将多肽与材料共价结合，-NH₂ 的骨修复效果优于 -COOH，也可能是由于官能团所带的不同电荷导致。

已有研究表明，肽链上带正电荷的未反应 -NH₂可以吸附更多特异性蛋白。例如，Curran 等^[20]报道了 -NH₂ 表面可以维持干细胞的活性细胞黏附和成骨分化，这可能与玻璃连接蛋白在表面吸附增加有关。Kikuchi 等^[21]发现，-NH₂ 衍生的底物有利于细胞培养，并进一步证明胺衍生物吸附血清中的牛血浆纤维连接蛋白和玻璃连接蛋白，可能促进细胞黏附和生长行为。此外，纤维连接蛋白是一种重要的细胞黏附蛋白，已被证明对带正电荷的材料表面具有亲和力^[22]。生物材料表面性质对细胞响应的影响，一般是由于表面化学可以调节被吸附特定蛋白质的结构和活性^[23]。这些研究均通过体外实验表明，通过 -NH₂ 结合多肽的复合材料骨修复效果可能优于通过 -COOH 结合多肽的复合材料，然而这些结果需要通过体内实验进一步验证。

本研究通过建立兔临界颅骨缺损模型，观察并比较等量 BMP-2 多肽通过非共价和共价作用，以及多肽分别与 -COOH 和 -NH₂ 这两种官能团与碳纳米管结合，对兔颅骨缺损修复的效果，探讨结合方式和官能团对多肽活性的影响规律以及改善骨修复的最佳组合。在材料方面选择了 MWCNT，一方面，MWCNT 被证明适合用于骨修复。文献报道 MWCNT 不仅可促进细胞黏附和增殖，还可通过浓缩大量蛋白质（包括骨诱导蛋白形成诱导骨），将可诱导细胞分化为成骨细胞^[24]。Pahlevan-zadeh 等^[25]合成并表征了一种新型含有 MWCNT 和钙矾石的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥，结果表明MWCNT 的加入提高了聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥的力学性能和生物活性。此外，MWCNT 比单壁碳纳米管更适合用作骨修复材料，这可能是由于MWCNT 对骨钙素的长期作用强于单壁碳纳米管，能更明显地诱导新骨形成，进一步促进与新骨的结合，从而更早完成骨重建^[26]。另一方面， MWCNT 很容易与不同官能团如 -COOH、-NH2、羟基、邻苯二酚等结合，从而实现其功能性和在各个领域的应用。例如 Shrestha 等^[27]通过混酸（浓硫酸和浓硝酸）制备 MWCNT-COOH 用于制备骨修复材料。Rahimi 等^[28]采用酸氯化法制备 MWCNT-NH₂，开发抗菌生物膜，利用二乙烯三胺和顺丁烯二酸酐通过自由基聚合法制备 MWCNT-NH₂ 用于智能药物输送。然而，目前碳纳米管作为纳米材料，因为细胞毒性问题阻碍了其在骨修复领域的应用^[29]。结合以往 MWCNT 含量对细胞毒性的影响，证实<50 μg/mL 的含量是安全范围，所以制备复合支架时采用 0.2 wt.% 的含量在安全范围以内^[30]。本研究组织学观察结果表明，术后并未发生因材料植入导致的炎症反应，说明通过提纯及官能化处理，可以避免纳米材料因团聚或吸附杂质等原因引起的细胞毒性。而且，碳纳米管与聚乳酸混合后制备成复合支架材料，使碳纳米管结合的多肽在修复过程中稳定释放，又有利于碳纳米管随聚乳酸的降解而缓慢排出。与一些其他未引入活性物质的骨修复材料体系相比，在术后相同时间实现了更好的修复效果^[31-32]。而相比于近期研究使用胶原或负载基因作为活性物质的骨修复材料体系，本研究制备的材料修复时间相对稍长，但本研究使用的多肽与之相比具有低成本的优势^[33]。

综上述，本研究一方面验证了共价结合对BMP-2 多肽的活性影响较小，修复效果优于非共价结合，而且通过不同官能团共价结合受不同电荷影响；另一方面，在今后多肽复合材料应用过程中，应对不同种类多肽如 P-15 多肽或 OGP 肽等，或各类官能团如羟基、巯基、邻苯二酚基等因素进行更深入和系统地讨论，从材料选择和制备等方面提供一定参考，以期制备出更高性能的骨修复材料。