从双抗技术难点剖析“为什么双抗研发看平台”（下篇）

作者：药链圈

本篇将结合上篇梳理的双抗药物研发过程的技术难点，聚焦解读双抗药物研发的典型技术平台。双抗分子根据是否具有Fc区可以分为全长双抗和片段双抗，其技术平台因此可分全长双抗技术平台和片段双抗技术平台两大类。虽然两类平台开发的双抗分子各具特色，但是无论哪一种平台，核心都是突破双抗分子成药性差和产业效率低的技术障碍。图：全长双抗和片段双抗相关平台

 片段双抗典型技术平台

常见的已经商业化的技术平台包括安进的BiTE、赛诺菲的Bi-Nanobody、MacroGenics公司的DART、Affimed公司的TandAb等。此类平台最大的相同点是开发的双抗分子均没有Fc区，分子量相对较小，具有半衰期短等共性问题；最典型的差异点是串联的抗体模块各有不同，抗原结合片段（Fab）、纳米体（VHH）、单链抗体（ScFv）等是采用比较多的串联模块，如BiTE采用单链抗体，Bi-Nanobody采用纳米体。

1. BiTE技术平台

BiTE技术平台最初由Micromet公司研发，2012年被安进以12亿美元收购。这是一种串联单链抗体技术平台，通过易弯曲的肽段linker将两个单链抗体（ScFv）以串联的方式连接在一起，防止链内VH结构域和VL结构域配对，以此控制和减少杂质蛋白，提高表达量，肽段linker的存在也改善了单链抗体稳定性差、溶解性低等生产问题；但半衰期依然较短，小于2小时。基于BiTE开发的双抗药物Blinatumomab已经在2014年上市。图：Blinatumomab作用机制

目前安进正在广泛探索BiTE技术平台的潜力。在产品管线储备方面，有10余项基于BiTE技术平台的临床研究。在平台发展上，安进在BiTE的基础上，开发了新一代双抗技术平台HLE BiTE。在原来BiTE分子结构上融合Fc片段，获得了更不易聚集、物理和化学稳定性更强、半衰期延长的双抗分子。

2. DART技术平台

DART技术平台是由MacroGenics公司和Servier公司联合开发的双抗构建技术。基于该平台开发的双抗分子是由两条多肽链结合形成的异源二聚体抗体。构建的基本原理是将一个抗体可变区的VH和VL序列分别与另一个抗体可变区的VL和VH序列连接，并在两条多肽链的C末端引入半胱氨酸，通过半胱氨酸形成链间二硫键，提高分子稳定性。此外，由于一种肽的盘绕线圈中含有谷氨酸残基，带负电荷，另一种肽含有赖氨酸残基，带正电荷，通过异性电荷相吸促进异二聚体形成。此外，在基础DART分子上加FC片段，可将半衰期从数小时提高到数天数周。

基于该技术平台合作的双抗项目较多，强生、辉瑞等跨国企业均与之达成合作关系，国内企业再鼎医药也与MacroGenics公司正在共同开发3款双抗药物。图：DART分子构建

3. Bi-Nanobody技术平台

Bi-Nanobody技术平台最初由Ablynx公司研发，2018年被赛诺菲以总价48亿美元收购。该平台开发的产品是一种参考骆驼及美洲驼的单域抗体结构，缺失轻链的重链抗体的可变区片段，也称为纳米体（VHH），将2个或者多个VHH进行连接而实现多特异性结合。该类产品的主要优点是分子小，稳定性高，易于人源化，易于连接，易于穿过较深的组织并靶向一些正常IgG抗体难以到达的表位，可以通过多种途径给药。虽然因为缺乏Fc区，在体内的循环半衰期较短，但可以通过融合人血清白蛋白或白蛋白功能区将半衰期延长至2-3周。代表药物是Ablynx公司开发的三价双特异性纳米抗体Ozoralizumab。

全长双抗典型技术平台

全长双抗技术平台开发的双抗分子均拥有相对完整的Fc区，根据双抗分子结构对称性，可以进一步分为对称模式和非对称模式。

对称模式的双抗：将两种不同特异性的抗原结合域融合在单条多肽链或单套形成配对的轻重链中，保留了Fc区域，更接近于天然抗体，但在大小和结构上有所不同。代表性平台有雅培的DVD-Ig技术平台、罗氏的Two-in-one技术平台等。

1. DVD-Ig技术平台

DVD-Ig技术由雅培开发，其结构是在正常IgG抗体轻链和重链的N末端分别再接入另一个抗体的VL和VH结构域，产生一个对每个抗原各有两个结合位点的四价分子，通过两个可变区结合双靶点来实现双功能。这个技术可以避免不同的重链或轻链的错配，同时提高生产的重复性、产量和稳定性。由于DVD-Ig双抗与正常单抗具有相同的Fc区，可以采用现有通用抗体技术进行生产。但是因为可变区结合了另一个抗体的VL和VH结构域，可变区内部的亲和力有降低的潜在风险。类似的技术还有在正常抗体IgG上连接scFv，或者将scFv连接在CL末端或CH3末端，产生了一系列双抗结构结构。图：DVD-Ig双抗分子图示

2. Two-in-one（DAF）技术平台

Two-in-one技术最早由基因泰克提出，通过对抗体分子可变区进行工程化改造并通过噬菌体展示技术获得识别两个不同靶点的双特异抗体，又称为DAF抗体。DAF抗体有双抗原结合位点，抗体本身能结合的靶抗原为第一个抗原，在抗原结合区引入突变可以识别第二个抗原。DAF抗体具有正常IgG抗体的结构，稳定性良好，易于进行产业化生产，在下游生产工艺、制剂开发和体内药动学等方面具有突出的优势，技术难点在于前期的工程化过程。图：DAF抗体构建图示

非对称模式的双抗：数量较对称模式更多，其中一部分采用类似于天然抗体的结构，以尽可能保留天然抗体所具有的优点，大多数非对称模式是基于在共表达四种多肽链或三种多肽链时促进重链异源二聚化或轻链和重链正确配对的策略下开发的，因此链相关问题是该类平台重点解决的技术问题。代表性平台有罗氏的KiH技术平台、ART-Ig技术平台等。

1. Knobs-into-Holes（KiH）技术

KiH技术由基因泰克于1997年开发，目前已过专利期，作为双抗基础平台，常与其他技术结合形成新的平台。该技术的基础原理是将双抗一条重链上CH3区的一个体积较小的苏氨酸突变为体积较大的酪氨酸，形成突出的“Knobs”型结构，同时将另一条重链上CH3区的一个较大的酪氨酸残基突变成较小的苏氨酸，形成凹陷的“holes”型结构，利用“KiH”结构的空间位阻效应实现两条不同重链间的正确装配。该技术使双抗重链的正确装配率达90%-95%，可以达到规模化生产的要求。但经过突变后的抗体分子稳定性不如天然抗体，往往需要引入链间二硫键稳定抗体结构。图：Knobs-into-Holes（KiH）技术图示

2. ART-Ig技术平台

ART-Ig技术由罗氏子公司Chugai开发，采用了CH3静电改造的原理。所谓静电改造主要是利用在生理条件下氨基酸带不同的电荷进行设计，在生理条件下，赖氨酸、精氨酸和组氨酸带正电，天冬氨酸和谷氨酸带负电荷。该技术用带负电荷的天冬氨酸或谷氨酸取代一条重链上CH3区中的一个残基，并用带正电荷的赖氨酸取代对应另一条重链上CH3区中的一个残基，利用“同种电荷相互排斥，异性电荷相互吸引”的原理，起到阻止同种重链形成二聚体，促进异源二聚体的形成。

罗氏在ART-Ig技术基础上，升级开发了FAST-Ig技术，在重链CH3正负电荷改造的基础上，在重链CH1和轻链CL也引入正负电荷，解决轻链错配问题。

除罗氏外，还有多家药企也拥有自己的静电突变专利技术。如安进将不同于罗氏的一条链上的K329D、K409D和另外一条链上的E356K、D399K定为突变位点，防止双抗分子链错配。国内企业友芝友生物制药也通过电荷突变减少双抗分子重链错配，同时搭配KiH突变进一步减少同源二聚体的错配。

小结：由于双抗分子的多样性和特殊性，双抗技术经过多年积累，已经有了长足发展，各家企业的各类平台百花齐放，各有优势也各有欠缺。随着双抗技术的不断发展，更具有优势性的平台技术值得继续研究和优化。

参考资料：

1.《双特异性抗体行业深度报告：曙光初现的抗体V2.0，聚焦肿瘤领域》

2.《2020年中国双特异性抗体行业投资机会分析》

3.《2020年中国双特异性抗体行业概览》

4.《行业领先的双特异性抗体平台领跑者》

5.《刘跃：双特异性抗体开发的关键和难点》

6.《行研|双特异性抗体药物技术概览》